CD147在胃癌細(xì)胞SGC7901增殖

1、RNA干擾抑制CD147表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖、侵襲和順鉑敏感性的影響2010.5.18王書(shū)奎 MD, PhD 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院報(bào)告內(nèi)容 研究背景 研究目標(biāo) 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)論一、 研究背景胃癌概況 胃癌最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，惡性腫瘤致死占第二位 。其惡性程度較高，轉(zhuǎn)移擴(kuò)散嚴(yán)重，多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，因而死亡率較高 。MMP簡(jiǎn)介 腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要步驟。這與細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（extracellular matrix metalloproteinase，MMP）的參與密不可分。 MMP是一個(gè)鋅

2、離子依賴的蛋白酶家族，目前已發(fā)現(xiàn)26種。MMP的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)。腫瘤細(xì)胞利用MMP的基質(zhì)降解能力遷移到其他部位。在腫瘤與間質(zhì)交界處，MMP往往高表達(dá) 。 20世紀(jì)80年代，Biswas實(shí)驗(yàn)室從人肺癌細(xì)胞株LX-1的細(xì)胞膜上分離得到了一種58 kDa的糖蛋白，具有刺激成纖維細(xì)胞合成MMP-1的功能，將其命名為腫瘤膠原酶刺激因子（tumor collagenase stimulating factor，TCSF）。 進(jìn)一步研究表明TCSF不僅能刺激MMP-1的產(chǎn)生，還能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的產(chǎn)生，因此將其重命名為細(xì)胞外基質(zhì)金屬酶誘導(dǎo)因子（extracel

3、lular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)。 第六屆人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組會(huì)議將EMMPRIN命名為CD147。CD147的結(jié)構(gòu) CD147屬單次跨膜糖蛋白，胞外段中的4個(gè)半胱氨酸殘基形成2個(gè)二硫鍵，構(gòu)成2個(gè)典型的半球形Ig結(jié)構(gòu)域。 細(xì)胞內(nèi)的CD147存在低糖基化（ low glycosylated CD147， LG）和高糖基化（high glycosylated CD147，HG）形式，分子量分別是3244kDa、4565kDa。只有HG形式能刺激MMP的產(chǎn)生。CD147的功能 CD147是一種廣泛表達(dá)于細(xì)胞表面，在體內(nèi)分布廣泛，參與精

4、子發(fā)生、胚胎發(fā)育、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)、病毒感染等多種生理和病理過(guò)程，是一個(gè)多功能的分子。 免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD147在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，包括膀胱癌、皮膚癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且腫瘤的惡性程度越高，CD147的表達(dá)水平也越高。CD147在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用 1. 促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移 CD147就是通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞本身產(chǎn)生多種MMP來(lái)降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的。 2. 誘導(dǎo)腫瘤血管生成 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）是很多情況下血管生成過(guò)程的主要調(diào)節(jié)因子，包括

5、腫瘤形成過(guò)程 。CD147可以誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)。 3. 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥 在多種多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞中都觀察到CD147的高表達(dá)。CD147可激活PI3K/AKT細(xì)胞存活信號(hào)通路。在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中此通路均被激活。胃癌中CD147的表達(dá) 日本Toyama大學(xué)的Zheng HC等研究表明：在正常胃黏膜發(fā)展為增生性或化生性胃黏膜，最后發(fā)展為胃癌的過(guò)程中，CD147的表達(dá)量是逐漸增加的，并且CD147的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)。 胃癌組織中CD147的表達(dá)CD147在胃癌組織中高表達(dá)二. 研究目標(biāo) 本實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制

6、胃癌細(xì)胞株SGC7901中CD147基因的表達(dá)，研究該基因沉默后對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲能力及化療藥物敏感性的影響，探討CD147在胃癌中的作用。三、研究方法及結(jié)果CD147shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)干擾載體的SGC7901細(xì)胞株MTT法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞增殖水平的變化明膠酶譜法檢測(cè)SGC7901細(xì)胞MMP-2、MMP-9分泌的變化SGC7901細(xì)胞體外侵襲力測(cè)定MTT檢測(cè)SGC7901細(xì)胞順鉑敏感性的變化技術(shù)路線技 術(shù) 路 線 胃癌細(xì)胞株SGC7901源自一位56歲女性胃腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤。研究表明其侵襲能力強(qiáng)，惡性程度高。我們前期研究表明，該

7、細(xì)胞表面CD147是高表達(dá)的。 shRNA（short hairpin RNA）表達(dá)載體的構(gòu)建pSilencer3.1-H1 neoshRNA模板的設(shè)計(jì)示意圖干擾靶序列的選擇 參考陳翔等的報(bào)道，選取CD147mRNA 370-390和808-828作為靶序列，相應(yīng)的shRNA分別命名為shRNA1和shRNA2。另外，設(shè)計(jì)一個(gè)陰性對(duì)照shRNA-control。RNAi靶序列在CD147 mRNA上的位置 1 AGCGGTTGGA GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATCA TGGCGGCTGC 51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GG

8、GCACCCAC GGAGCCTCCG 101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA 151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG 201 CTGGCTGAAG GGGGGCGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA 251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCA

9、GC TCCACGGGCC351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTGA AGTCGTCAGA ACACATCAAC GAGGGGGAGA 401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG 451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TGAACGGCTC 501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA 551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTG

10、CAACGGC601 ACCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG 651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG 701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGGAC 751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA801 GCACCAGAAT GACAAAGGCA AGAACGTCCG CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG

11、 851 GCAGGTGGCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC 951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT設(shè)計(jì)好的shRNA插入序列shRNA15-GATCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTTGGAAA-35-AGCTTTTCCAAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACG-3s

12、hRNA2 5GATCCGTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTTGGAAA-3 5AGCTTTTCCAAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCACG-3shRNA-control5GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3 5AGCTTTTCCAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACGGTAGTG-32、CD147 shRNA

13、表達(dá)載體的構(gòu)建： 將合成的三對(duì)片段分別用水浴中加熱后退火備用，與經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切的pSilencer3.1-neo質(zhì)粒連接，構(gòu)建成CD147 shRNA表達(dá)載體，重組質(zhì)粒分別命名為pSilencer-shRNA1， pSilencer-shRNA2 和pSilencer-shRNA-control 。重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定結(jié)果DNA測(cè)序表明，3個(gè)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。pSilencer/shRNA1測(cè)序圖（紅線為插入片段）轉(zhuǎn)染及篩選 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48h后用含0.4g/ml的G418的完全培養(yǎng)基篩選2周，然后改為半量維持。將抗G418的陽(yáng)性細(xì)胞克隆用有限稀釋法分離出來(lái)并逐步擴(kuò)增以待進(jìn)一

14、步分析。篩選出的細(xì)胞克隆分別命名為SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。Real-time PCR檢測(cè)CD147 mRNA表達(dá)水平 與SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2細(xì)胞中CD147 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別下降至72.4%和17.3% 。 1 2 3 4HGLGCD147-actinLane 1: SGC7901.Lane 2: SGC7901/shRNA-controlLane 3: SGC7901/shRNA1Lane 4: SGC7901/shRNA2 HG代表高糖基化形式的C

15、D147，LG代表低糖基化形式的CD147。Western blot結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果相符。接種細(xì)胞 培養(yǎng)細(xì)胞 加入MTT呈色 終止培養(yǎng) 比色 結(jié)果計(jì)算 抑制率(%)=(對(duì)照組A 值-實(shí)驗(yàn)組A 值)對(duì)照組A 值100% 24h、48h、72h 時(shí)間點(diǎn)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培養(yǎng)24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2細(xì)胞增殖能力均顯著降低.而陰性對(duì)照組SGC7901/shRNA-control增殖能力無(wú)顯著改變。明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞上清中MMP-2和MMP-9的活性 明膠酶包括72 kDa的明膠酶A（基質(zhì)

16、金屬蛋白酶-2，MMP-2）和92 kDa的明膠酶B (基質(zhì)金屬蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物為基底膜中的型膠原和變性的間質(zhì)膠原（明膠），其活性與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。 明膠酶譜法是一種測(cè)定明膠酶活性的常用方法。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法可將這兩種明膠酶按分子量大小分開(kāi)，顯示兩條負(fù)染條帶，根據(jù)條帶的面積和亮度可判定明膠酶的活性。明膠酶譜結(jié)果MMP-2MMP-9 1 2 3Lane 1:SGC7901. Lane 2:SGC7901/shRNA-control.Lane 3:SGC7901/shRNA2*BSGC7901/shRNA2細(xì)胞上清液中MMP-2

17、和MMP-9的活性明顯降低 Transwell原理 Matrigel是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有層粘連蛋白、型膠原等。將Matrigel鋪在Transwell侵襲小室的多孔濾膜上，能形成與天然基底膜極為相似的基底膜結(jié)構(gòu)。Transwell結(jié)果穿過(guò)Transfer侵襲小室的染成紫色的細(xì)胞（400）SGC7901SGC7901/shRNA-controlSGC7901/shRNA2SGC7901/shRNA2細(xì)胞 體外侵襲能力顯著降低B*順鉑敏感性實(shí)驗(yàn) 抗腫瘤藥物順鉑的使用濃度以血漿峰濃度（ Peak Plasma Concentration，PPC) 為標(biāo)準(zhǔn)。參照Sondak等的報(bào)道

18、，順鉑的PPC為3.0 g/ml。 本實(shí)驗(yàn)中使用的順鉑濃度為：0.01PPC，0.1PPC，10PPC。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=1-OD(cisplatin）/OD(cisplatin) 100% 與SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，順鉑對(duì)SGC7901/shRNA2的抑制率顯著增加*四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論成功構(gòu)建了靶向CD147的shRNA真核表達(dá)載體；成功轉(zhuǎn)染了人胃癌細(xì)胞SGC7901，并獲得了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，經(jīng)Real-time PCR、Western Blot檢測(cè)，CD147在mRNA和蛋白水平均被顯著抑制；CD147表達(dá)沉默后SGC7901的增殖能力明顯降低，細(xì)胞的MM

19、P-2和MMP-9的活性明顯降低，細(xì)胞的體外侵襲能力明顯降低，細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性增強(qiáng)。 我們的研究表明：CD147在胃癌細(xì)胞SGC7901增殖、侵襲和化療藥物敏感性中發(fā)揮重要作用；CD147可能是胃癌治療的一個(gè)有效的靶點(diǎn)。 下一步的研究方向1.動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)（裸鼠移植瘤模型，體內(nèi)腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)）；2.CD147自身的表達(dá)調(diào)控；3.CD147在其他消化系統(tǒng)腫瘤中的作用；4.CD147多藥耐藥的機(jī)制。Thanks for your attention!凍傷的護(hù)理診斷（男，14歲）雙足凍傷5%，III1%主述雙足低溫凍傷10天現(xiàn)病史患者于入院10天前，在雪地里走，鞋浸濕后，致雙足凍傷。傷后

20、自行用溫水復(fù)溫。自覺(jué)局部腫脹不適，行走受限，在當(dāng)?shù)氐尼t(yī)院治療，具體不詳。因雙足皮膚破潰，肢端發(fā)黑，來(lái)我院治療。?？魄闆r雙足紅腫，表皮的溫度較正常的皮膚高，表皮部分剝脫。創(chuàng)面的基底紅潤(rùn)，或紅白相間。痛覺(jué)敏感或遲鈍。有炎性滲出，無(wú)明顯異味，末梢循環(huán)差，右足趾端皮膚部分發(fā)黑。白細(xì)胞:12.2*109/L,中性粒細(xì)胞：7.79*109/L冷傷的概念冷傷是低溫一起的人體組織細(xì)胞的損傷冷傷的分類非凍結(jié)性凍傷:10度以下至冰點(diǎn)以上的低溫加以潮濕條件所造成的損傷.凍結(jié)性損傷:冰點(diǎn)以下的低溫造成組織細(xì)胞冷凍所致的損傷.局部?jī)鼋Y(jié)性冷傷-凍傷按損傷范圍分全身性冷傷局部性冷傷凍僵，凍亡，凍傷，凍瘡，戰(zhàn)壕足，浸泡足(手

21、)按損傷性質(zhì)分凍結(jié)性冷傷非凍結(jié)性冷傷凍瘡，戰(zhàn)壕足，浸泡足(手)凍僵，凍亡，凍傷病因和發(fā)病機(jī)制由于寒冷刺激，局部皮膚小動(dòng)脈痙攣并造成組織缺氧、缺血和細(xì)胞損傷；如持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境改變，可出現(xiàn)血管麻痹性擴(kuò)張，靜脈瘀血，其通透性增加，血漿滲入組織間隙而引起水腫。濕冷環(huán)境(特別是氣溫在10以下)、末梢血運(yùn)微循環(huán)異常，自主神經(jīng)功能紊亂、營(yíng)養(yǎng)不良性貧血和手部多汗均可促使凍傷的發(fā)生。 凍傷分四度 一度:凍傷最輕，亦即常見(jiàn)的“凍瘡”，受損在表皮層，受凍部位皮膚紅腫充血，自覺(jué)熱、癢、灼痛，癥狀在數(shù)日后消失，愈后除有表皮脫落外，不留瘢痕。二度:凍傷傷及真皮淺層，傷后除紅腫外，伴有水泡，泡內(nèi)可為血性液，深部

22、可出現(xiàn)水腫，劇痛，皮膚感覺(jué)遲鈍。凍傷分四度 三度:凍傷傷及皮膚全層，出現(xiàn)黑色或紫褐色，痛感覺(jué)喪失。傷后不易愈合，除遺有瘢痕外，可有長(zhǎng)期感覺(jué)過(guò)敏或疼痛。四度:凍傷傷及皮膚、皮下組織、肌肉甚至骨頭，可出現(xiàn)壞死，感覺(jué)喪失，愈后可有疤痕形成。凍傷緊急處理辦法1、迅速脫離寒冷環(huán)境盡快復(fù)溫。2、那么如何復(fù)溫呢?迅速脫掉凍傷者寒冷潮濕的衣褲襪,盡快使局部或全身浸泡在4042度的水中，3、局部用水或者肥皂水清潔后用凍傷膏。2度以上凍傷，需敷料包扎好。皮膚較大面積凍傷或壞死時(shí)，注射破傷風(fēng)抗毒素或類毒素。 凍傷緊急處理辦法4、在野外無(wú)溫水的條件下，也可把傷者放在未凍傷人的腋下或腹股溝等地方復(fù)溫。注意，嚴(yán)禁火烤，雪搓，冷水浸泡或猛力捶打傷者患部 5、對(duì)局部?jī)鰝募本纫I(lǐng)是一點(diǎn)一點(diǎn)地、慢慢地用與體溫一樣的溫水浸泡患部使之升溫。如果僅僅是手凍傷，可以把手放在自己的腋下升溫。然后用干凈紗布包裹患部，并去醫(yī)院治療。 凍傷治療1、凍傷的肢體應(yīng)迅速在溫水中使之溫暖或靜脈點(diǎn)滴熱液體復(fù)溫（38-40度）。2、復(fù)溫后繼續(xù)采取保暖措施,保護(hù)受傷部位,預(yù)防外傷.3、防