細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本原理和相關(guān)技術(shù)概述

1、 從分子到細(xì)胞，我們?nèi)绾稳ニ伎迹緿NA的重組 DNA Recombination1.DNA是什么？2.我們這里談的DNA重組是什么？3.如果我的實驗需要重組DNA，我需要什么試劑？4.如何提高重組的效率和成功率？DNA是什么？ 有個小問題，如果我要表達(dá)一個蛋白質(zhì)或者多肽，這一段基因是DNA嗎？或是RNA?還是別的什么東西？DNA重組的到底是什么？A.重組的DNA如何獲取?a.變出來行不行？b.買一個基因行不行？c.如果是克隆出來的，那怎么克隆？DNA重組是大家實驗中的“最笨的機(jī)械運動嗎？A.顯然不是。B.DNA重組與數(shù)學(xué)，計算機(jī)，人的求知欲有沒有關(guān)系？基因-gene重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）

2、DNA克隆 克?。╟lone） 來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。 獲取同一拷貝的過程稱為克隆化（cloning）,即無性繁殖。技術(shù)水平： 分子克隆（molecular clone） 即DNA克隆 細(xì)胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮﹥?nèi)切核酸酶內(nèi)切核酸酶，維持細(xì)菌遺傳性狀的穩(wěn)定。限制性內(nèi)切核酸酶或DNA結(jié)合蛋白所特異識別、結(jié)合的DNA位點的核苷酸序列，呈二元旋轉(zhuǎn)對稱，通常將這種特殊的結(jié)構(gòu)順序稱為回文結(jié)構(gòu)（palindrome）。 識別序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；產(chǎn)生的切口可以是粘性末端、平頭或鈍性末端、配伍末端。 。(三)目的基因 目的基因：用來擴(kuò)增作研究或生產(chǎn)某一種蛋白質(zhì)的基因。就

3、是在重組DNA時，人們感興趣的基因或DNA序列，又稱目的DNA(target DNA)。 類型： cDNA(complementary DNA)：指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA互補(bǔ)的單鏈DNA，經(jīng)聚合可合成雙鏈cDNA。 基因組DNA(genetic DNA)：指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息(染色體及線粒體)的所有DNA序列。感受態(tài)細(xì)胞：指具備接受外源DNA能力的宿主細(xì)胞六）克隆基因的表達(dá)表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化、原核表達(dá)體系、真核表達(dá)體系體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長類型 按生長方式:2型 粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于

4、固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。 絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長。 貼附(粘附)型細(xì)胞 粘附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi) 生存和生長發(fā)育的基本存在方式含義 兩方面結(jié)果 基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織， 有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須 粘附于一固相表面 才能生存和生長。培養(yǎng)時：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細(xì)胞。粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞 類型 細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式：存在差異 體內(nèi)：粘附是全方位 外形具有復(fù)雜的立體特

5、征 體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個附著平面 外形一般與體內(nèi)時明顯不同 按照培養(yǎng)細(xì)胞粘附生長時的主要形態(tài)，可分為幾大類型 分類 根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要2類： 上皮細(xì)胞型 成纖維細(xì)胞型 其它，不定型上皮細(xì)胞型 名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全等于-來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞 如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞 扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核 生長特點 易相連成片 相靠緊密相連成薄層 鋪石狀 生長時呈膜狀移動 很少脫離細(xì)胞群而單個活動 體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（1）上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型 名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織

6、如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出23個長短不等的突起 中有卵圓形核生長特點 排列成放射狀，漩渦狀 并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而 單獨行動 游離的單獨的成纖維樣細(xì)胞， 常有幾個伸長的細(xì)胞突起體外培養(yǎng)細(xì)胞類型（2）成纖維細(xì)胞型貼附生長型-類型1. 與體內(nèi)同名的細(xì)胞不完全相同 如：形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞，可不同來源 自同一動物不同組織的成纖維樣細(xì)胞相似但 發(fā)展趨向不同2. 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不穩(wěn)定 條件改變，細(xì)胞形態(tài)可有變化 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定血清 Hela 高血清 低血清 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 pH Hela 太酸或太堿 標(biāo)準(zhǔn)pH 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 細(xì)胞密度 3T3 低密度 高密度 成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞 生長狀態(tài)改變 懸浮或貼附 懸浮 貼附 圓形 成纖維或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后 成纖維樣 可成上皮樣 懸浮生長型概念 培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源 自血，脾或骨髓， 尤