四八-基因工程和核酸雜交

1、14 基因工程基因工程（gene engineering ）：又稱DNA重組技術（DNA bination），是指將外源基因通過體外重組后導入受體細胞，并使其能在受體細胞內(nèi)復制和表達的技術。分子克?。╩olecular cloning ）：是指將目的DNA片段與載體重組，然后導入受體細胞，并在受體細胞中復制、擴增，以獲得該DNA分子大量拷貝的技術。24.1 工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶DNA連接酶堿性磷酸酶T4多核苷酸激酶核酸酶S131、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶（restriction endonuclease）：簡稱限制酶，是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶

2、。4第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶限制性核酸內(nèi)切酶命名5作用 三種核酸內(nèi)切酶的作用酶活性 核酸內(nèi)切酶 核酸內(nèi)切酶 核酸內(nèi)切酶 甲基化酶 甲基化酶 ATP酶 DNA解旋酶DNA鏈上的 無 有 有特異識別位點DNA鏈上的 無 在識別序列內(nèi) 在識別序列外特異切割位點在分子克隆中 無 有 無的重要意義6限制酶能識別雙鏈DNA特異的48個堿基對，并在此序列內(nèi)特異切割DNA。限制酶功能：根據(jù)需要在特定的位點

3、上精確切割雙鏈DNA分子?；匚慕Y構（palindrome structure）：指雙鏈DNA分子上按對稱軸排列的反向互補序列（常為限制酶所識別）。限制性核酸內(nèi)切酶的作用75GAATTC3ATATGC5 3 EcoR的識別序列：對稱軸3CTTAAG5 8粘性末端（sticky end）：指限制酶錯位切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。平末端（blunt end）：指限制酶平齊切開兩條對稱軸互補DNA雙鏈所產(chǎn)生的末端。GAATTCCTTAAGEcoRCCC GGGGGG CCCSma9101112同工異源酶（isoschizomers）：指來源不同，但能識別和切割同一位點的酶。 同尾酶（is

4、ocaudarner）：指識別序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的酶。如：BamH 和Bst （G GATCC） Xho 和 Pae R7（C TCGAG） 如： BamH （G GATC C） Sau 3A （N GATC N）。 由此產(chǎn)生的DNA片段可借粘性末端相互連接，在DNA重組時具有更大的靈活性。131） DNA聚合酶和Klenow片段大腸桿菌DNA聚合酶（ E . Coli DNA polymerase ）是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為103kD，它具有3種酶活性： 5 3 DNA聚合酶活性 3 5 核酸外切酶活性 5 3 核酸外切酶活性2、DNA聚合酶 14 53外切酶 53聚合酶

5、 35外切酶 (103kD)Klenow 片段 N C 53聚合酶 35外切酶(68kD)35kD (小) 68kD(大)N枯草桿菌蛋白酶 DNA聚合酶 15補齊雙鏈DNA的3末端，同時可使3 末端DNA標記上同位素。cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈。DNA序列分析。Klenow片段的主要用途16Taq DNA聚合酶（簡稱Taq 酶）是一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65Kd，最佳作用溫度是7080，Taq酶具有53 聚合酶活性和依賴于聚合作用的53外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于DNA測序及通過聚合酶鏈反應（PCR）對DNA分子的特定序列進行體外擴增。 2） Taq DNA聚合酶17

6、逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為逆轉(zhuǎn)錄過程。逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。 RNA指導的DNA聚合酶活性（RDDP） 核糖核酸酶H活性（RNaseH） DNA聚合酶活性（DDDP）3）逆轉(zhuǎn)錄酶185335 RNA(用 表示)RNA-DNA 雜化分子 35 RNase （核酸酶H活性) DDDP （DNA聚合酶活性） 4種dNTP RDDP （逆轉(zhuǎn)錄酶） 引物、4種dNTP 病毒雙鏈DNA用 表示）（cDNA第二鏈(complementary DNA，cDNA )與病毒RNA 互補的DNA(用

7、 表示)5335 535 319末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，簡稱末端轉(zhuǎn)移酶）：分子量為60Kd，在二價陽離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3末端-OH上。末端轉(zhuǎn)移酶的功能主要有： 在載體或目的基因 3末端加上互補的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。用于DNA 3末端的同位素探針標記。4）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶20(A、G、C、T)nOH5 35 3OH5 3 5 3(A、G、C、T)n Mg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5 3OH5 3OH 5 35 3(A、G、C

8、、T)n Co2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是單鏈DNA或有3突出末端的雙鏈DNA，需要Mg2+。（2）底物是平端或3凹端的雙鏈DNA，需要Co2+。 (A、G、C、T)n21DNA連接酶（DNA ligase）：稱為基因工程的縫紉針，它的主要功能是催化兩個互補粘性末端或平末端雙鏈DNA分子的5磷酸基團與3羥基形成磷酸二酯鍵，將具有相同粘性末端或平末端的DNA連接起來。DNA連接酶包括大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶兩種類型。3、DNA連接酶2223堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基團。主

9、要用途有：除去DNA片段上的5磷酸以防自身連接。在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標記前，從RNA或DNA上除去5端的磷酸。4、堿性磷酸酶 5- pCpGpC -OH 3 堿性磷酸酶5- CpGpC -OH 35-p3-HO5-HO3-HO245、T4多核苷酸激酶 5- CpGpC -OH 3p+ADP+ATP5- CpGpC -OH 3T4多核苷酸激酶前向反應： 交換反應：5- CpGpC -OH 3 +ADP - 32P dATP 二硫蘇糖醇, Mg2+過量ADPT4多核苷酸激酶p* +ATP25核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。其主要作用有：除去粘

10、性末端以產(chǎn)生平末端。除去cDNA合成時形成的發(fā)夾結構。分析RNA的莖環(huán)結構和DNA-RNA分子的雜交情況。6、核酸酶S1核酸酶S1核酸酶S1核酸酶S1+264.2 載體載體（vector）：指能攜帶外源DNA片段導入宿主細胞進行擴增或表達的工具。載體的本質(zhì)為DNA。制備的目的基因或DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進入受體細胞并進行復制和表達。常用的載體有：質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母質(zhì)粒和病毒等。271、克隆載體克隆載體：能將外源DNA在受體細胞中復制、擴增并產(chǎn)生足夠量目的DNA的載體。28能自我復制并具較高的拷貝數(shù)。分子量一般 10Kb。帶有遺傳篩選標記。有適當?shù)南拗泼该盖形稽c，便

11、于外源DNA的插入和篩選。多克隆位點（multiple cloning sites，MCS）：載體上具有的多個限制酶的單一酶切位點?？寺≥d體應具備的特征291）質(zhì)?？寺≥d體質(zhì)?？寺≥d體的主要用途： 用于保存和擴增 2Kb目的DNA。 構建cDNA文庫。 目的DNA的測序。 作為核酸雜交時的探針來源。30pBR322質(zhì)?？寺≥d體pBR322質(zhì)粒是由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過DNA重組技術構建而成的雙鏈克隆載體，長為4.36Kb。它含有一個能保證高拷貝自我復制的復制起始點（Ori），并裝有四環(huán)素抗性（Tetr）基因和氨芐青霉素抗性（Ampr）基因供菌落篩選。在這兩個抗性基因中分別含有BamH I

12、和Pst I等限制酶的單一酶切位點，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，會導致這些標志性基因的失活。31 復制起始點抗藥基因抗藥基因pBR322載體32pUC系列載體 pUC系列載體是由pBR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體。pUC18和pUC19質(zhì)粒長約2.69Kb，除多克隆位點互為相反方向排列外，其它序列均相同。pUC質(zhì)粒含Ampr，可供菌落篩選。載體中裝入一個來自大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因序列中含有多克隆位點。33pUC18載體342）噬菌體克隆載體噬菌體（bacteriophage，phage）：指感染細菌的病毒。按其生活周期分為兩種類型：

13、溶菌性噬菌體：指噬菌體感染細胞后，連續(xù)增殖，直到細菌裂解，釋放的噬菌體又可感染其它細菌。溶原性噬菌體：指噬菌體感染細胞后，可將自身的DNA整合到細菌的染色體中，和細菌染色體一起復制。35野生型的噬菌體是線性雙鏈DNA，全長約48.5Kb，其中60%（約30Kb）是溶菌生長所必需，中間40%的區(qū)域為非必需，可被外源DNA片段代替而不影響噬菌體的生存。噬菌體5末端含12核苷酸的互補單鏈順序，是天然的粘性末端，稱為cos位點，噬菌體感染宿主菌后，其粘端通過堿基配對而結合，形成環(huán)狀DNA分子。噬菌體載體36噬菌體載體的結構 37噬菌體載體的特點重組噬菌體的分子量必須在野生型噬菌體的75% 105%之間

14、。篩選標記：外源基因插入型：藍白斑(LacZ)篩選。外源基因置換型：噬菌斑數(shù)目（轉(zhuǎn)染率高100 1000倍）。38噬菌體載體的用途 用作一般的克隆載體。 用于構建基因組或cDNA文庫（22Kb）。 用于抗體庫或隨機肽庫的構建。 核酸的序列分析。39M13噬菌體野生型M13噬菌體為6.4Kb左右的閉環(huán)正鏈DNA分子?？寺〉耐庠椿蚱?kb。M13噬菌體能以單鏈和雙鏈兩種方式存在，可用于感染(經(jīng)包裝的單鏈DNA)和轉(zhuǎn)化(雙鏈DNA)。M13中引入的多克隆位點，正好插入LacZ基因內(nèi)，可利用藍白色噬菌斑篩選重組體。M13噬菌體只降低宿主細胞的生長速度，而不溶解宿主細胞（呈溶源狀態(tài)生長，故可從細菌培

15、養(yǎng)液中獲得噬菌體，制備單鏈DNA）。40M13噬菌體在細菌內(nèi)的復制模式圖噬菌體正鏈復制復制型DNA經(jīng)pII蛋白造缺口355335滾環(huán)復制釋出單鏈DNA(正鏈)經(jīng)pII蛋白剪切進入下一循環(huán)41粘粒(cosmid)是由質(zhì)粒和噬菌體的cos位點構建而成。粘粒載體組成：質(zhì)粒復制的起始位點(Ori)。攜帶抗藥基因。 用于插入目的基因的單一酶切位點。噬菌體的cos位點。3）粘?？寺≥d體42粘粒載體的特點粘粒載體大小為46Kb，而插入外源基因長達4050kb。加入噬菌體頭部和尾部蛋白，可將粘粒包裝成類似于噬菌體的具感染能力的顆粒，容易進入大腸桿菌。粘粒進入細菌后則完全失去噬菌體的功能，而表現(xiàn)質(zhì)粒的特性。43

16、粘粒載體的用途 克隆大片段DNA。 構建基因組文庫。442、表達載體表達載體是指能將外源基因在受體細胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體?；虮磉_、合成有功能的蛋白質(zhì)依賴于基因的有效轉(zhuǎn)錄、mRNA正確的翻譯和翻譯后加工。45報告基因（reporter gene）為了判斷某一待測DNA序列的生物活性，常采用報告基因方法。報告基因：是指處于待測基因下游并通過轉(zhuǎn)錄和表達水平來反映上游待測基因功能的基因，又稱報道基因。461）原核細胞表達載體真核基因在原核細胞中表達需要保證外源基因：插入方向的正確性；受原核啟動子的控制；必須能在原核細胞中有效轉(zhuǎn)錄和有效翻譯。外源基因在原核細胞中表達需要重要調(diào)控元件。47原核細

17、胞的表達載體主要是大腸桿菌表達載體。大腸桿菌表達載體是在克隆載體的基礎上導入表達系統(tǒng)調(diào)控元件：啟動子核糖體結合位點轉(zhuǎn)錄終止信號。48（1）啟動子（promoter） 如乳糖啟動子（Lac）、色氨酸啟動子（Trp）、Tac啟動子（Trp-Lac）以及PL和PR啟動子等。5TTGACATATAAT/3-35區(qū) -10區(qū) 轉(zhuǎn)錄起始點Pribnow boxDNA原核細胞啟動子示意圖49（2）SD序列mRNA50（3）終止子（terminator）終止子：一個基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識別并停止轉(zhuǎn)錄的功能。該序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文對稱結構，終止子轉(zhuǎn)錄后形成的

18、RNA具有莖環(huán)狀局部二級結構。51 -NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGC TTTTTTNNN-DNA-NNTT CGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN-G/C富含區(qū)2G/C富含區(qū)1A/T富含區(qū)5353RNA-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH53RNA結構5G C NN NN CC GC GC GG CG CA UA U NNNN UUUU-OH 3DNA轉(zhuǎn)錄的強終止子模式圖轉(zhuǎn)錄52非融合型表達載體：產(chǎn)生外源蛋白，易被原核細胞蛋白酶降解。如pKK223-3質(zhì)粒載體。分泌型表達載體：產(chǎn)生帶信號肽的分泌型融合蛋白，可減少外源蛋白被降解以及使蛋白

19、質(zhì)能在細胞外正確折疊，易提取。如PINlll系列。融合型表達載體：產(chǎn)生由較短的原核細胞多肽和真核細胞蛋白質(zhì)構成的融合蛋白，具有抗原性，較天然的外源蛋白穩(wěn)定。如pGEX系列。原核細胞表達載體的類型53真核表達載體的真核表達元件有：啟動子/增強子終止位點和加poly A信號。原核質(zhì)粒序列：包括復制起始序列和抗藥基因標記。 啟動子：轉(zhuǎn)錄起始位點上游2530bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游約100200bp處為上游啟動子元件。增強子（enhancer）：是一類顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件。終止子和加polyA信號（AAUAA）。 2）真核細胞表達載體54目的基因的獲取載體的選擇目的基

20、因和載體的連接重組DNA導入受體細胞重組體的篩選和鑒定4.3 基因工程的基本步驟55連接含重組子的陽性克隆載體+目的基因轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定陽性克隆DNA重組體+受體細胞基因工程的基本步驟 分、切、接、轉(zhuǎn)、篩56 1）從基因文庫中獲取2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA3）人工合成DNA片段4）直接從染色體DNA中分離目的基因1、目的基因的獲取571）從基因文庫中獲取目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表達的基因?；蚪M文庫（genomic library，G-文庫）是指含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群。58用逆轉(zhuǎn)錄法得到的目的基因進行克隆，可獲得較完整的連續(xù)編碼序列，易在宿主細

21、胞中表達及篩選。選用富含目的基因mRNA的細胞作為實驗材料，有利于分離到目的基因。如胰島素基因的mRNA主要存在于胰腺組織，血紅蛋白基因的mRNA占網(wǎng)質(zhì)紅細胞總mRNA的50%90%。2）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA59根據(jù)已知基因的核苷酸序列或基因產(chǎn)物的氨基酸序列，可推導出為該多肽編碼的核苷酸短序列，再用DNA合成儀人工合成目的基因。適用于合成分子量較小的目的基因 （100bp以內(nèi)）。如：人生長激素釋放因子、血管加壓素、干擾素、胸腺素及胰島素原的基因等。3）人工合成DNA片段60根據(jù)染色體DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割染色體DNA、分離目的基因。適用于制備原核生物目的基因，因為：真

22、核細胞染色體DNA有豐富的內(nèi)含子，它們在原核細胞中轉(zhuǎn)錄后不能被剪接。真核細胞的基因多數(shù)為單拷貝，難以分離到足夠量的目的基因。 4）直接從染色體DNA中分離目的基因61根據(jù)外源DNA的特性和受體細胞的特性選擇合適的載體。2、 載體的選擇621)粘性末端連接3、目的基因和載體的連接本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上有相同單或雙酶切位點。63粘性末端DNA重組體的構建 3 HO-G CTTAA-p 5 5p-AATTC G-OH 3 3HO-G CTTAA-p 5 5p-AATTC G-OH 3 質(zhì)粒 目的基因 目的基因和載體連接 EcoR EcoR 堿性磷酸酶 3HO-G CTTAA-OH 5 5HO

23、-AATTC G-OH 3 退火 DNA連接酶 3HO-G CTTAA G CTTAA-p 5 5p AATTC G AATTC G-OH 3 642) 平末端連接質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點質(zhì)粒產(chǎn)生平末端的內(nèi)切酶DNA連接酶目的基因產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶核酸酶S1核酸酶S165人工接頭本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。66本法適用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。通過同聚尾連接67質(zhì)粒 目的基因 33 3ACGTC G 55G CTGCA 33 GnGGGACGTC G 55G CTGCAGGGGn 33 CnCCC 55 CCCCn 3 末端轉(zhuǎn)移

24、酶 dGTP 末端轉(zhuǎn)移酶 dCTP 混合，退火 1）轉(zhuǎn)化細菌2）體內(nèi)修復同聚尾連接法構建 DNA重組體G CCCC GGGGACGTC CTGCAGGGG CCCC G Pst 核酸外切酶 目的基因和載體連接GACGT C CTGCA GG ACGTC C TGCAG CCC GGG GGG CCC Pst Pst 684、重組DNA導入受體細胞常用的受體細胞是大腸桿菌。轉(zhuǎn)化（transformation）：是指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。感受態(tài)細胞(competent cell)：細胞膜結構改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細胞。69制備感受態(tài)細胞的基本方法C

25、aCl2處理，增加大腸桿菌細胞膜通透性。電擊法，高壓脈沖使細胞膜形成暫時性微孔。701）重組體的篩選根據(jù)載體的抗藥性標志篩選 大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性基因（如Ampr 、Tetr等），當帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗性細菌后，被轉(zhuǎn)化的陽性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應排除未重組的空載體。5、重組體的篩選和鑒定71根據(jù)載體抗藥性標志插入失活選擇某些質(zhì)粒載體如 pBR322質(zhì)粒中有Ampr和Tetr 抗性基因，在這兩個基因中裝有幾個常用的MCS，如將外源DNA片段插入BamH識別序列時，則此質(zhì)粒由Tetr變?yōu)閷λ沫h(huán)素敏感（Tets ）。這種重組子導入宿主菌后，宿主

26、菌在含四環(huán)素瓊脂糖平皿上不能生長而在含氨芐青霉素的平皿上能夠生長。在含四環(huán)素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長的細菌只含有空載體，此篩選方法稱為雙抗生素篩選法。72雙抗生素篩選法73-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍白斑篩選法）某些質(zhì)粒載體帶有大腸桿菌乳糖操縱子的lacZ基因，該基因含一段編碼-半乳糖苷酶氨基末端145個氨基酸-肽的DNA片段， IPTG可誘導此片段合成，此片段能與宿主細胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實現(xiàn)基因內(nèi)-互補，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示劑底物X-gal 形成藍色產(chǎn)物，結果重組克隆呈藍色菌落。當外源基因插入lacZ基因中MCS，lac -肽基因閱讀框架被破壞，細菌內(nèi)將無-半乳糖

27、苷酶活性，結果重組克隆呈白色菌落，這是常用的藍白斑篩選法。7475根據(jù)插入的外源性基因的性狀進行篩選當細胞生物合成途徑中某個酶的編碼基因失活后，該細胞成為營養(yǎng)缺陷型，如導入細胞的重組DNA能彌補缺陷的基因，那么培養(yǎng)基中就不需補充有關的營養(yǎng)成分，由此可挑選出含重組DNA的陽性細菌。76核酸雜交技術篩選 將轉(zhuǎn)化細菌平板轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，應用特異性的核酸探針對其進行原位雜交，可篩選出陽性克隆。對于噬菌體載體的克隆，此法也可通過噬菌斑的原位雜交篩選陽性克隆。通過斑點雜交和Southern blot雜交技術篩選 。772）重組體的鑒定根據(jù)重組子大小鑒定 重組子裝有外源DNA，分子量較原載體大得多，

28、從挑選的菌落中分別提取重組DNA和原載體DNA，直接進行電泳，原載體DNA分子量較小、電泳遷移率較大；而重組DNA因分子量較大而遷移率較小。78酶切鑒定分別提取重組載體DNA和原載體DNA，根據(jù)已知外源基因兩端的酶切位點，分別用相應的內(nèi)切酶進行切割，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，只出現(xiàn)一條區(qū)帶的是原載體本身，而重組載體還多一條外源DNA片段的區(qū)帶，可根據(jù)DNA mark來分析插入DNA片段的分子量。79PCR鑒定提取重組子DNA，利用插入外源基因兩端互補的特異引物，對重組子DNA進行PCR擴增。此法不僅可分離擴增目的基因，還可對目的基因進行測序。80DNA序列分析鑒定DNA序列分析是確定分離的DNA是否

29、是特異的外源性插入DNA的唯一方法（金標準），也是最確定的方法。自動化，快速、簡便和實用。818 核酸分子雜交8.1 核酸雜交基本原理8.2 核酸探針技術8.3 核酸分子雜交技術8.4 基因芯片82核酸定性或定量檢測基因克隆、突變及其表達研究疾病的臨床診斷主要用途838.1 核酸雜交基本原理核酸變性核酸復性核酸分子雜交848.1.1 核酸變性變性（denaturation） ：在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級結構的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過程?；瘜W鍵變化：維持雙螺旋穩(wěn)定的氫鍵和疏水鍵發(fā)生斷裂，斷裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的?；瘜W結構變化：D

30、NA變性改變了其空間結構，不涉及到其一級結構的改變。8586DNA的變性因素凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件。加熱極端的pH有機試劑（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）87變性DNA的理化性質(zhì)溶液黏度降低：DNA雙螺旋是緊密的“剛性”結構，變性后代之以“柔軟” 無規(guī)則單股線性結構，DNA黏度明顯下降。溶液旋光性發(fā)生改變：變性后DNA分子的對稱性及局部構型改變。紫外吸收增加：DNA變性后，DNA 溶液的紫外吸收增強。雙鏈DNA單鏈DNA單核苷酸88增色效應：DNA變性時其溶液OD260增高的現(xiàn)象。89解鏈曲線通常利用DNA變性后在波長260nm處吸光度（A260）的增加來監(jiān)測DNA變性的

31、過程。如果以溫度對A260的關系作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。典型DNA變性曲線呈S型。90融解溫度融解溫度（ melting temperature，Tm）：在熱變性過程中，紫外吸收增加達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度。爆發(fā)式：熱變性是在變性溫度范圍內(nèi)突發(fā)的躍變過程，很像結晶達到熔點時的融化現(xiàn)象，故名融解溫度。狹窄性：變性溫度范圍很小。91Tm的影響因素DNA分子大小和堿基的組成溶液的離子強度pH值變性劑921、DNA分子大小和堿基的組成DNA的均一性堿基組成的均一性樣品組成的均一性DNA的（G+C）含量93DNA的（G+C）含量在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決于

32、DNA分子中的（G+C）的含量。（G+C）含量越高，G-C 堿基對越多，Tm值越高。核苷酸20bp：Tm=4（G+C）+2（A+T）94952、溶液的離子強度溶液中離子與DNA分子中磷酸基團形成離子鍵，需要較高溫度才能使DNA變性。離子強度較低時，Tm值較低，而且解鏈的溫度范圍也較寬。963、pH值pH值影響氫鍵的形成。pH值在5-9范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。pH值小于4或大于11時，均不利于氫鍵的形成，DNA容易變性。974、變性劑干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑有甲酰胺、尿素、甲醛等。 988.1.2 核酸復性復性（renaturation）：指變性 DNA 在

33、適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。退火（annealing）：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為“退火”。雙鏈DNA、RNA雙鏈區(qū)、DNA: RNA雜交雙鏈以及其它異源雙鏈核酸分子都具有此性質(zhì)。99核酸復性的影響因素溫度和時間DNA濃度DNA分子大小和復雜度離子強度1001、溫度和時間一般認為比Tm低25左右的溫度是復性的最佳條件，越遠離此溫度，復性速度就越慢。復性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫（如4以下），復性幾乎是不可能的。1012、DNA濃度DNA復性的第一步是兩個單鏈分子間的相互作用“成核

34、”?！俺珊恕彼俣扰cDNA濃度的平方成正比。溶液中DNA分子越多，相互碰撞結合“成核”的機會越大。1023、DNA分子大小和復雜度用非重復堿基對（bp）數(shù)表示核酸分子的復雜性。簡單順序的DNA分子，如多聚（A）和多聚（T）這二種單鏈序列復性時，互補堿基的配對較易實現(xiàn)。順序復雜的DNA，如小牛DNA的非重復部分（一般以單拷貝存在于基因組中），這種復雜的特定序列要實現(xiàn)互補，顯然要比上述簡單序列困難得多。1034、離子強度對復性的影響增加鹽濃度可增加互補鏈合成雙鏈的速度，鹽中和DNA單鏈中磷酸基團的負電荷，減少互補鏈靜電排斥。1048.1.3 核酸分子雜交核酸分子雜交（molecular hybrid

35、ization）:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補的原則締合成異質(zhì)雙鏈的過程稱為分子雜交或核酸分子雜交。105雜交的本質(zhì)：就是在一定條件下使互補核酸鏈實現(xiàn)復性。利用探針（probe）與靶DNA雜交，可識別靶DNA中的特異核苷酸序列。1065.2.2 核酸探針技術核酸探針（nucleic acid probe)：是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補雜交，雜交后可用特殊方法檢測的已知被標記的核酸分子。107選擇探針的基本原則高度特異性探針的來源是否方便制備探針的難易程度1088.2.1 核酸探針的類型基因組DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針109來源：這類

36、探針來源于某種生物的基因組，多為某一基因的全部或部分序列。 制備方法:基因克隆的方法聚合酶鏈反應(PCR) 特點:多克隆在載體中的DNA片段，可無限繁殖，取之不盡。PCR制備探針簡便和省時。相對RNA而言，DNA探針不易降解，標記方法也較成熟。1、基因組DNA探針110cDNA(complementary DNA)：是指與mRNA互補的DNA分子。特點:不存在內(nèi)含子和高度重復序列，是一種較理想的核酸探針，尤其是用于基因表達的研究。 排除了RNA酶的影響，現(xiàn)已成為分子生物學實驗室的常規(guī)實驗。 cDNA探針111RNA探針與靶序列的雜交效率較高，穩(wěn)定性也高。RNA分子大多以單鏈形式存在，幾乎不存在

37、互補雙鏈的競爭結合。RNA分子中不存在高度重復序列，非特異性雜交少，雜交后未雜交的探針分子水解可用RNA酶去除，本底的干擾低。RNA探針有易降解和標記方法復雜等缺點，限制了其廣泛應用。 RNA探針112根據(jù)需要來合成相應的核酸序列，避免天然探針的缺點。探針長度一般為1050bp。 尤其適合點突變的檢測。 由于探針的長度較短，特異性較低，雜交信號較弱 ，但經(jīng)過精心設計仍可設計出非常 特異的寡核苷酸探針。 寡核苷酸探針113 探針長度：一般要求在1050bp。 GC含量為4060。 探針分子中應避免互補序列。 避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個，如GGGG-或 -CCCC-。 借助計算機相應軟

38、件與已知的各種基因序列進行同源性比較。 探針設計原則114理想的探針標記物應具有以下特點：檢測物要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡便。標記物與探針結合后，應不影響雜交反應，尤其是雜 交特異性、穩(wěn)定性和Tm值。標記物對環(huán)境污染小，對人體無損傷，價格低廉。標記物對檢測方法無干擾。 8.2.2 核酸探針的標記和檢測115常用核酸探針的標記和檢測標記分子標記方法檢測方法32P dNTPNT、PCR、RP放射自顯影或液閃計數(shù)32P dNTPTL放射自顯影或液閃計數(shù)35SNT放射自顯影或液閃計數(shù)3HNT放射自顯影或液閃計數(shù)Bio-11-dUTPNT、PCR、RP酶標親和素或酶標抗體顯色光敏生物素可見光照射酶標親和素或

39、酶標抗體顯色生物素化補骨脂素紫外線照射酶標親和素或酶標抗體顯色HRP和ALP化學法或直接法酶促底物顯色FITC和羅丹明合成法熒光顯微鏡觀察地高辛RP、NT酶標抗體+底物顯色1168.3 核酸分子雜交技術5.2.3.1 固相核酸分子雜交5.2.3.2 原位核酸分子雜交5.2.3.3 液相核酸分子雜交5.2.3.4 核酸分子雜交實驗條件的優(yōu)化117分子雜交技術一般流程探針制備及標記（同位素或非同位素） 待測核酸樣品制備（分離，純化）雜交（液相，固相，原位雜交）雜交后處理（去掉非特異雜交分子）顯示結果（顯色，發(fā)光，放射自顯影）結果分析118核酸分子雜交技術類型 雜交類型檢測對象Southern印跡雜

40、交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子菌落雜交檢測固定在膜上，經(jīng)裂解從細菌體釋放的DNA分子正向斑點雜交檢測固定在膜上的DNA或RNA分子反向斑點雜交檢測樣品中的DNA或RNA分子微板雜交檢測固定微板孔上的DNA或RNA分子原位雜交檢測細胞或組織上的DNA或RNA分子119固相分子雜交：是將待測的靶核苷酸鏈預先固定在固體支持物上，然后放入含有標記探針的雜交液中，進行雜交反應后，使雜交分子留在支持物上，故稱固體雜交。固體雜交的優(yōu)點： 未雜交的游離探針通過漂洗可容易除去，膜上的雜交分子容易檢測，還能防止靶DNA的自我復性，所以

41、被廣泛應用。8.3.1 固相核酸分子雜交120DNA變性 中和 Southern印跡 預雜交 雜交 洗膜 檢測 1、Southern印跡雜交（Southern blot）121 毛細管轉(zhuǎn)移示意圖122電轉(zhuǎn)移示意圖123Northern印跡雜交是應用DNA探針檢測特異mRNA的一種膜上印跡技術。是由Alwine于1977年建立，后經(jīng)Thomas等人改進。用于分析mRNA分子大小及mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。2、Northern印跡雜交（Northern blot）124Northern印跡雜交流程圖 125與Southern印跡雜交的不同點RNA提取過程中需特別注意RNA酶的污染。所用器材最好與Sout

42、hern印跡實驗分開使用。RNA變性的方法：不能用堿變性，因為堿會水解RNA的2-羥基基團，在變性劑的存在下進行電泳，防止RNA分子形成發(fā)夾式的二級結構，以保持其單鏈線形狀態(tài)。印跡前將含變性劑的凝膠用水沖洗掉， 再印跡、雜交。如果測定RNA片段大小，可在同一塊膠上加分子量標記物一同電泳，之后將標記物切下、上色、照像，樣品膠則進行Northern轉(zhuǎn)印。126斑點雜交是將待檢樣品（DNA、RNA 或細胞）直接點到膜上，烘烤固定。3、斑點雜交（Dot-blot）127斑點雜交不需電泳和轉(zhuǎn)膜過程，整個操作過程簡便、快速。但結果無法判斷核酸片段的大小，也無法判斷樣品溶液中是否存在著不同的靶序列。多用作核酸定性或半定量分析，而且便于雜交條件的摸索。128菌落雜交示意圖4、菌落雜交129微板酶聯(lián)夾心雜交動畫流程NOS 基團捕獲探針PCR 產(chǎn)物檢測探針親和素-HRP四甲基聯(lián)苯氨氨基生物素5、微板酶聯(lián)雜交130捕獲探針共價結合在微孔板上，不僅結合牢固而且結合量大，因而捕獲能力很強。捕獲探針豎直地而不是平躺地“包被”在微孔板表面，因而與目的片段的雜交效率很高。檢測探針5端、3端均標記生物素，等量檢測探針結合親合素-辣根過氧化物酶的量增加。微板酶聯(lián)雜交的優(yōu)點1318.3.2 原位核酸分子雜交原位