流式細(xì)胞術(shù)最新發(fā)展

1、流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry,FCM)是一種對液流中排成單列的細(xì)胞或其它生物微粒(如微球，細(xì)菌，小型模式生物等)逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)。作為應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測的技術(shù)平臺(tái)，現(xiàn)代流式細(xì)胞儀產(chǎn)生于上世紀(jì)六七十年代。經(jīng)過近四十年的發(fā)展和完善，今天的流式細(xì)胞儀已經(jīng)十分成熟，并被廣泛的運(yùn)用于從基礎(chǔ)研究到臨床實(shí)踐的各個(gè)方面，涵蓋了細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、藥理學(xué)遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域，在各學(xué)科中發(fā)揮著重要的作用?，F(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)綜合了流體力學(xué)技術(shù)、激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、熒光化學(xué)技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)，是多學(xué)科多領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)步的結(jié)晶。隨著現(xiàn)代科技的高速發(fā)

2、展，為了滿足生命科學(xué)對細(xì)胞分析更高層次的要求，流式細(xì)胞技術(shù)仍然在快速發(fā)展，并已經(jīng)在檢測技術(shù)、分選技術(shù)及高通量分析等方面取得了許多突破。本文就流式細(xì)胞術(shù)的最新進(jìn)展做一些介紹。RealTimeready智力大沖浪！答對5題，即獲贈(zèng)美國傲仕優(yōu)質(zhì)保溫杯！一、流式細(xì)胞檢測與細(xì)胞成像的結(jié)合使用傳統(tǒng)的流式細(xì)胞檢測技術(shù)，研究人員可以分析成千上萬個(gè)細(xì)胞，獲得每個(gè)細(xì)胞的散射光信號和熒光信號的數(shù)值，從而得到細(xì)胞群體的各種統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并可以找到稀有的細(xì)胞亞群。但是傳統(tǒng)流式細(xì)胞檢測技術(shù)仍然存在局限，那就是獲得的細(xì)胞信息很有限。細(xì)胞對研究人員來說，只是散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)，而不是真實(shí)的細(xì)胞圖像，缺乏細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞

3、水平信號分布的相關(guān)信息。要想獲得細(xì)胞圖像，研究人員就必須使用顯微鏡進(jìn)行觀察，但顯微鏡能夠觀察的細(xì)胞數(shù)量是非常有限的，很難提供細(xì)胞群體的量化與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。因此，使用傳統(tǒng)的細(xì)胞分析技術(shù)，我們就只能面對這樣的兩難選擇，沒有一種技術(shù)可以既提供細(xì)胞群體的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，又獲得細(xì)胞圖像。不過，最近美國Amnis公司推出的ImageStream成像流式細(xì)胞儀，給傳統(tǒng)細(xì)胞分析帶來突破性的變革。ImageStream是一種臺(tái)式多譜段成像流式細(xì)胞儀(MultispectralImagingFlowCytometry)，能夠同時(shí)采集6個(gè)檢測通道中的細(xì)胞圖像(圖1)。它將流式細(xì)胞檢測與熒光顯微成像結(jié)合于一身，既能提供細(xì)胞群的

4、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，又可以獲得單個(gè)細(xì)胞的圖像，從而提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號分布的信息。WWW生!|WWW生!|圖1.ImageStream流式細(xì)胞成像系統(tǒng)與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀很類似，ImageStream也是由液流系統(tǒng)，光學(xué)系統(tǒng)和電子系統(tǒng)等三大部分組成。液流系統(tǒng)將樣本細(xì)胞懸液和系統(tǒng)鞘液注入流動(dòng)室中，使細(xì)胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個(gè)流過檢測窗口。光學(xué)系統(tǒng)中光源照射通過檢測窗口的細(xì)胞，從而產(chǎn)生光信號。光源分為兩種，其一是用于產(chǎn)生明場細(xì)胞圖像的鹵燈(BrightfieldIlluminator)，另一種是用于產(chǎn)生熒光細(xì)胞圖像的激光器。光源照射細(xì)胞產(chǎn)生的光信號被具有很大數(shù)值孔徑(NA：0.7

5、5)的物鏡收集，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到由二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧(DichroicFilterStack)，光信號在這里被分成不同波段投射到一個(gè)六通道冷CCD上，產(chǎn)生一個(gè)明場細(xì)胞圖像，一個(gè)暗場細(xì)胞圖像(SideScatter，SSC)及四個(gè)不同熒光通道的細(xì)胞圖像。ImageStream的光路系統(tǒng)能夠自動(dòng)調(diào)整焦距，并實(shí)時(shí)測定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度，而其冷CCD采用時(shí)間延遲積分方式(TimeDelayIntegration，TDI)進(jìn)行信號采集，上述這些手段保證了系統(tǒng)采集到的細(xì)胞圖像的質(zhì)量。ImageStream系統(tǒng)配有功能強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析軟件IDEAS(圖2)，可以對每個(gè)細(xì)胞分析超過500種量化參數(shù)。這些參

6、數(shù)不僅包括細(xì)胞整體的散射光和熒光信號強(qiáng)度，還包括對細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞信號分布的分析。通過在細(xì)胞群體中對這些參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析軟件可以生成細(xì)胞群體的散點(diǎn)圖和柱狀圖，而這些統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與細(xì)胞圖像是完全整合的，比如點(diǎn)擊散點(diǎn)圖上的點(diǎn)，就可以直觀的看到這個(gè)點(diǎn)代表的細(xì)胞的圖像。另外，使用者還能夠根據(jù)自身研究的特殊需要，進(jìn)行自定義參數(shù)的設(shè)定，進(jìn)行更深入的分析。圖2.IDEAS分析軟件ImageStream流式細(xì)胞成像系統(tǒng)結(jié)合了流式細(xì)胞檢測功能與熒光顯微成像功能，并整合了功能強(qiáng)大的分析軟件，幾乎可應(yīng)用于細(xì)胞分析的所有領(lǐng)域，大大深化和拓展了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用。下面簡要列舉一些ImageStream的新穎應(yīng)用。

7、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/通路分析(CellSignaling/PathwayAnalysis)細(xì)胞信號通路中關(guān)鍵因子的磷酸化水平和在細(xì)胞內(nèi)的分布是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的重要內(nèi)容。ImageStream系統(tǒng)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)與熒光顯微成像的檢測方式，一方面可以統(tǒng)計(jì)細(xì)胞內(nèi)因子的磷酸化程度，一方面可以通過分析細(xì)胞圖像來確定信號因子在亞細(xì)胞水平定位的變化，因而非常適合進(jìn)行這方面的研究。轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核(NuclearTranslocation)是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要事件。傳統(tǒng)的檢測方法是使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，但是這種方法效率很低，所能觀察的細(xì)胞數(shù)量十分有限，且很難對不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)位程度進(jìn)行評估。為了更有效的檢

8、測NuclearTranslocation，ImageStream系統(tǒng)在IDEAS分析軟件中引入了一個(gè)全新的參數(shù)一Similarity，來對采集的細(xì)胞圖像進(jìn)行分析。所謂Similarity，是指兩個(gè)不同熒光檢測通道采集的熒光圖像在空間分布上的一致性（圖3）。Similarity值越高，則兩張細(xì)胞圖像上的信號分布越相似。對于NuclearTranslocation研究來說，Similarity值越高，細(xì)胞因子轉(zhuǎn)位的程度就越高。里旦1|一FOHQ:tnNliM里旦1|一FOHQ:tnNliMNF-kB是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠在多種組織中激活不同基因的表達(dá)，與慢性和急性炎癥，自身免疫性疾病及多種癌

9、癥的發(fā)生存在著聯(lián)系。脂多糖（LPS）能夠激活人類單核細(xì)胞系THP-1的一個(gè)信號通路，導(dǎo)致NF-kB的轉(zhuǎn)位。研究人員使用LPS處理細(xì)胞，AlexaFluor488標(biāo)記的抗NF-kB抗體和7-AAD染色細(xì)胞，利用ImageStream進(jìn)行檢測。在散點(diǎn)圖上以一定的Siminlarity值設(shè)門，定量分析NF-kB轉(zhuǎn)位的細(xì)胞亞群所占比例，然后通過觀察細(xì)胞圖像，確認(rèn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。分析顯示，LPS處理后，細(xì)胞內(nèi)的NF-kB發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)位，細(xì)胞群體的MedianSimilarity值由-1.358變?yōu)?.114，發(fā)生高度轉(zhuǎn)位的細(xì)胞比例從0.72%增加到45.9（圖4）。Untreated:NF-KBPeak

10、Ir-l-ensilyChiirr浴MiniUntreated:NF-KBPeakIr-l-ensilyChiirr浴MiniMnanMadIanSid口呃FhIiijIhCi|h27EC-9S.31SD517,33fillrajEi百tpi陽Qy263ft叮：35.5B1T.15Sdd7-5.37Wod.SfrlliHTty115.儷S15.-04510ABHqhSimja20a.71M2関5力財(cái)呂1站匍？廿ntfeatodNF-KB/SimilarityCaurn鵡TotalSingleCells-瓷0Iflfi-1.S4R晌dsiinIwriiyn*i,H-1.3511.2371?C.E

11、S7Vrj：,i細(xì)胞間相互作用(AnalysisofCellConjugates)細(xì)胞間的相互作用是通過細(xì)胞膜相互接觸部位上的分子相互作用來實(shí)現(xiàn)的。研究細(xì)胞間相互作用，不僅要找到細(xì)胞雙聯(lián)體，還要對兩個(gè)細(xì)胞接觸部位的信號分子的分布進(jìn)行研究。T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞(APC)之間的相互作用，作為T細(xì)胞活化過程的重要部分，是研究細(xì)胞間相互作用的一個(gè)很好范例。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用一種D011.10TCR轉(zhuǎn)基因小鼠淋巴結(jié)中分離的OVA多肽特異性T細(xì)胞與OVA多肽致敏APC進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)的第一步是尋找兩種細(xì)胞的雙聯(lián)體。首先利用針對T細(xì)胞特異性標(biāo)記Thyl.l和T細(xì)胞受體（TCR）信號通路關(guān)鍵因子ADAP

12、（AdhesionandDegranulationpromotingAdaptorProtein）的抗體和細(xì)胞核染料7-AAD染色細(xì)胞。然后利用Imagestream檢測樣品。在散點(diǎn)圖上設(shè)門，找到Thyl.l和ADAP雙陽性的T細(xì)胞，然后在這些細(xì)胞中尋找細(xì)胞雙聯(lián)體。IDEAS分析軟件提供了AspectRatio參數(shù)，即細(xì)胞橫縱軸長度之比，來區(qū)分不同形態(tài)的細(xì)胞（圖7.A）。散點(diǎn)圖中具有更高的7-AAD信號和較小AspectRatio值的群體就是細(xì)胞雙聯(lián)體（圖7.B）。AspectRatio（MinorAx汐M蜀ptAxis）III二邈HbAspectRatio（MinorAx汐M蜀ptAxis）

13、III二邈HbiijLgta14ur二題I弟托亦沖7AA0由于是在T細(xì)胞群基礎(chǔ)上尋找細(xì)胞雙聯(lián)體，所以得到的雙聯(lián)體中不僅有T細(xì)胞和APC的雙聯(lián)體，也有兩個(gè)T細(xì)胞組成的雙聯(lián)體，因此還需要做進(jìn)一步分析。利用IDEAS分析軟件提供的DeltaCentroid參數(shù)，即兩個(gè)熒光圖像中心之間的距離，可以方便的區(qū)分上述兩種雙聯(lián)體（圖8.A）。如果雙聯(lián)體上都是T細(xì)胞，兩者都表達(dá)ADAP分子，那么ADAP信號的中心與細(xì)胞核信號中心之間的距離就很近；如果雙聯(lián)體由T細(xì)胞和APC構(gòu)成，其中只有T細(xì)胞表達(dá)ADAP，因此ADAP信號的中心與細(xì)胞核信號中心之間的距離就比較遠(yuǎn)。圖8.B中編號為7058的雙聯(lián)體就是兩個(gè)T細(xì)胞組成

14、的，ADAP和7-AAD代表的細(xì)胞核之間的DeltaCentroid只有2個(gè)象素，而編號5527的雙聯(lián)體由T細(xì)胞和APC組成，ADAP和細(xì)胞核之間的DeltaCentroid達(dá)到7.1個(gè)象素。AOAP處t：t7AADADAPX7AADEMaCtmrixdRMSADA*AOAP處t：t7AADADAPX7AADEMaCtmrixdRMSADA*r74.ADphMCirtlroriiKA0API7AA0T：*PCPairCirtlroriiKA0API7AA0AtM-FE7AADe*MfakCmbwdJUIfl.ADAF這樣，研究人員就可以在散點(diǎn)圖上設(shè)門，通過觀察細(xì)胞圖像來確認(rèn)設(shè)門的準(zhǔn)確性。圖中右

15、上方的細(xì)胞群，也就是ADAP和細(xì)胞核之間的DeltaCentroid值和ADAP的AspectRatio值都較大的細(xì)胞群就是T細(xì)胞和APC結(jié)合的雙聯(lián)體，占總細(xì)胞群體的19.1%（圖9）。T細(xì)胞與APC之間要產(chǎn)生相互作用，除了需要形成細(xì)胞雙聯(lián)體，還要有信號分子在細(xì)胞結(jié)合部位富集，以形成免疫突觸（ImmuneSynapse）。通過軟件分析兩個(gè)細(xì)胞結(jié)合部位的ADAP信號占整個(gè)細(xì)胞ADAP信號的比例，以及ADAP的AspectRatio值，研究人員找到了已經(jīng)形成免疫突觸的T細(xì)胞與APC雙聯(lián)體，其比例約占整個(gè)細(xì)胞群體的17.6%（圖10）。ADAP/7AADADAP/7AADADAP/7AADADAP/

16、7AAD1651662IIBI024681(DCtnfrOidRMS_ADAP/7AADADAP/7AADADAP/7AADADAP/7AAD300513277311225868511982分子共定位與胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運(yùn)(AnalysisofMolecularColocalizationandIntracellularMolecularTrafficking)治療性抗體在細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)是分子共定位研究的一個(gè)重要方面。研究人員利用ImageStream研究了一種抗腫瘤治療型單抗“利妥昔”(Rituximab,RTX)的作用機(jī)制。前人的研究表明，RTX能與CD20特異性結(jié)合，其抗腫瘤活性與補(bǔ)體依賴型細(xì)

17、胞毒性(Complement-dependentcytotoxicity，CDC)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，從慢性淋巴細(xì)胞性白血病病人血液中分離的B細(xì)胞與AF488標(biāo)記的RTX孵育，然后分別被PE標(biāo)記的抗補(bǔ)體C3b的抗體(7C12)和作為陰性對照的抗CD45的抗體染色。經(jīng)ImageStream的檢測，通過Similarity參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，RTX與CD45沒有分布上的一致性(圖11.A)，而與C3b具有明顯的共定位特征(圖11.B)，表明RTX與CD20陽性細(xì)胞的結(jié)合可能激活了補(bǔ)體信號通路，并導(dǎo)致C3b補(bǔ)體在RTX結(jié)合處富集，從而形成共定位。ARTX/C045SimiUniyBrijhDetai

18、lRTXiCD4SBPTX!7C12ARTX/C045SimiUniyBrijhDetailRTXiCD4SBPTX!7C127細(xì)ndhtJIkrhRlXLIE1ii6i昭艮1|7Anr11如iLriE-A耳Mu人血液樹枝狀細(xì)胞(plasmacytoiddendriticcells,pDC)是免疫系統(tǒng)病毒響應(yīng)的重要部分。雖然它只占外周血細(xì)胞的0.2%不到，但卻在HSV響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究人員利用ImageStream對病毒響應(yīng)過程中pDC細(xì)胞對病毒碎片的內(nèi)攝(Internalization)和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)中，將從人外周血中分離的pDC細(xì)胞與CpGB分別在4C和37C進(jìn)行孵

19、育，然后使用PE標(biāo)記的抗pDC細(xì)胞標(biāo)記BDCA的抗體和FITC標(biāo)記抗內(nèi)涵體標(biāo)記CD71或抗溶酶體標(biāo)記CD107a的抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色，最后用ImageStream進(jìn)行檢測。利用散點(diǎn)圖上設(shè)門找到BDCA陽性的pDC細(xì)胞群，然后分析CpGB的Internalization參數(shù)，及其與CD71和CD107a的Similarity參數(shù)，生成散點(diǎn)圖。所謂CpGB的Internalization參數(shù)，指細(xì)胞內(nèi)部CpGB的信號占總的CpGB信號的比例。結(jié)果顯示，4C孵育會(huì)抑制CpGB的內(nèi)攝37C孵育0.5小時(shí)后，在24.6%的pDC細(xì)胞中，CpGB定位于內(nèi)涵體；37C孵育2小時(shí)后，在18.8%的pDC細(xì)胞中

20、，CpGB定位于內(nèi)涵體(圖12.A)。37C孵育0.5小時(shí)后，在26.9%的pDC細(xì)胞中，CpGB定位于溶酶體；37C孵育2小時(shí)后，在66.8%的pDC細(xì)胞中，CpGB定位于溶酶體（圖12.B）。這說明CpGB被pDC細(xì)胞內(nèi)攝后，首先進(jìn)入內(nèi)涵體，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中。CpGB.4.9hr4CpGB.4.9hr437CLO3TCCl；ImagesCl；Images：RsClilnnag：RoginR6Cdhnjj;：R?RB.CpGB.QSbi.4CMCp&fiO.Shr,4C也KMtaVian-ijj-RB.CpGB.QSbi.4CMCp&fiO.Shr,4C也KMtaVian-ijj-i*-

21、.Images!RrgmnR5Oilimjjpy：RegionR6RSr亡VGR,亡H匚応氐良弓址址Cp%OiS37CCpW,toht.iKCflImages!RrgmnR5Oilimjjpy：RegionR6RSr亡VGR,亡HKJU-jrB:iH*01JkIH1Oft.0:LL,1ipC耳直j|711RA:CuGBO.il4CM1!-iCB鼻LL*riFft7;fCS.2.Mu.J7C細(xì)胞形態(tài)學(xué)(QuantitativeMorphology)細(xì)胞形態(tài)的改變是免疫響應(yīng)的一個(gè)方面。當(dāng)病原體侵入機(jī)體后，首先被入侵的細(xì)胞會(huì)釋放出一些化學(xué)信號，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞發(fā)生形變，并向病原體入侵的部位移動(dòng)。一些研究

22、人員研究了化學(xué)誘導(dǎo)物MCP-1引發(fā)的細(xì)胞變形。該實(shí)驗(yàn)采用FITC標(biāo)記的抗CD14抗體染色細(xì)胞，然后用ImageStream檢測。利用Circularity參數(shù)對CD14陽性細(xì)胞群體進(jìn)行分析。所謂Circularity參數(shù)，是指細(xì)胞平均半徑比上細(xì)胞半徑的變量。結(jié)果顯示，MCP-1處理后，變形的細(xì)胞從9.5增加到60.9(圖13.)。偽足形成實(shí)驗(yàn)也是細(xì)胞形態(tài)研究的一個(gè)領(lǐng)域。相關(guān)研究人員對一個(gè)IL-3依賴性細(xì)胞系在IL-3饑餓3小時(shí)后重新供給IL-3,觀察細(xì)胞偽足形成的情況。細(xì)胞被PE標(biāo)記的抗偽足標(biāo)記分子Podo的抗體和DRAQ5染色,然后用ImageStream進(jìn)行檢測。利用上述的AspectRa

23、tio和DeltaCentroid參數(shù)繪制散點(diǎn)圖，將偽足形成過程中的細(xì)胞分成Uniform、Capped及Pseudopod等三類（圖14.A）。結(jié)果顯示，隨著IL-3孵育時(shí)間的延長，Uniform細(xì)胞逐漸減少，而形成偽足的細(xì)胞逐漸增加（圖14.B）。P好uda-pD-dnn第4640弗3025201510虧*P好uda-pD-dnn第4640弗3025201510虧*rhRa,0冷inUmiporiC；Hppd15Mn30MinUm*II3SrfruuF.iliCellPhenotypeFrequndcsduringRecovery60Mm雅氐生物謹(jǐn)wwwflWiolrade.cxfl熒光原

24、位雜交(FISHInSuspension)通過使用ImageStream，高通量FISH可以應(yīng)用到懸浮細(xì)胞中。相關(guān)研究人員利用12號染色體的一個(gè)探針與人外周血單核細(xì)胞進(jìn)行雜交，利用IDEAS軟件進(jìn)行自動(dòng)數(shù)點(diǎn)分析，結(jié)果顯示了該位點(diǎn)在遺傳上非常穩(wěn)定(圖15.)?；虮磉_(dá)分析(GeneExpressionAnalysis)綠色熒光蛋白(GFP)是用于基因表達(dá)分析的常用標(biāo)記。錐形蟲(Trypanosome)是一種與多種人類疾病相關(guān)的單細(xì)胞病原體。相關(guān)研究人員利用GFP研究了兩種基因P19和NP19在錐形蟲體內(nèi)的表達(dá)情況。該實(shí)驗(yàn)中，錐形蟲分別被P19-GFP和NP19-GFP轉(zhuǎn)染，然后用DRAQ5染色，

25、在ImageStream上進(jìn)行檢測，其中GFP在通道3(Ch3)檢測，DRAQ5在通道6(Ch6)檢測。分析時(shí)，首先在散點(diǎn)圖上找到GFP陽性的細(xì)胞群，然后利用Similarity參數(shù)分析GFP信號分布與細(xì)胞核的相似度，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NP19-GFP的細(xì)胞，平均的Similarity值達(dá)到2.1366，在84.5%的細(xì)胞中GFP信號定位于細(xì)胞核(圖16.B),而轉(zhuǎn)染P19-GFP的細(xì)胞，這兩項(xiàng)數(shù)值分別為0.843和14.7%(圖16.A)。這個(gè)結(jié)果表明，P19蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，而NP19定位于細(xì)胞核。GFPBCWinriitCwwBl13|4GFPBCWinriitCwwBl1SimianlyC

26、3&TtvidlC5t弘ChGsimiiantyC3&G6nveshou51%ChfiPopulationStatisticsPupmatDflCounlPupmatDflCounl%TbtaJOFPwatooSimilarGFP138&XT$47PoPwIbUddCaunt%Tdb1%Gale(JGFP9031&Q7B37763645MeanSimilarityScoresPopu；at-gnSidDevPopu；at-gnSidDevGFP0W07696SimirarfiGP211S2C伽1PopularsnMeanIGFP2136flS-milaraGFP23587I07334物通細(xì)胞凋

27、亡（ApoptosisAnalysis）細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡的組織生理過程，表現(xiàn)為細(xì)胞膜外翻、細(xì)胞質(zhì)起泡及染色體的斷裂和濃縮主要發(fā)生在細(xì)胞分化（如胚胎發(fā)生），自體調(diào)節(jié)，細(xì)胞損傷響應(yīng)（如病毒感染，DNA損傷）等重要生理過程，是細(xì)胞生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域。目前，利用流式細(xì)胞術(shù)可以檢測的細(xì)胞凋亡標(biāo)志主要有AnnexinV,TUNEL,Caspase等。ImageStream可以檢測所有這些凋亡標(biāo)記，而與傳統(tǒng)流式檢測相比，其具有兩方面獨(dú)特的優(yōu)勢一是能夠區(qū)分假陽性和假陰性，二是能準(zhǔn)確區(qū)分凋亡和壞死。細(xì)胞凋亡檢測過程中，常常會(huì)遇到假陽性和假陰性的情況。假陽性一般是由于正常細(xì)胞上黏附了凋亡小體，從而在

28、流式檢測時(shí)誤認(rèn)為是陽性。如圖十七所示的情況，一些正常細(xì)胞表面附著了TUNEL陽性碎片，從而顯示TUNEL陽性。對于這種情況，可以利用IDEAS軟件中的DeltaCentroid參數(shù)來區(qū)分真假陽性（圖17.）。類似的情況也同樣出現(xiàn)在AnnexinV和Caspase檢測中，凋亡小體會(huì)附著在正常細(xì)胞表明，造成假陽性，而一些已經(jīng)出現(xiàn)了染色體斷裂和濃縮的凋亡細(xì)胞卻是AnnexinV或Caspase陰性的，從而造成假陰性結(jié)果。由于ImageStream能夠獲得細(xì)胞圖像，并對圖像進(jìn)行分析，因此可以排除這些假陽性和假陰性結(jié)果。大多數(shù)的利用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的方法，比如AnnexinV法，都很難區(qū)分晚期凋亡和壞

29、死細(xì)胞，因?yàn)檫@兩類細(xì)胞都表現(xiàn)為凋亡標(biāo)記和細(xì)胞核染料的雙陽性。但這兩種細(xì)胞在細(xì)胞核形態(tài)上存在明顯區(qū)別：晚期凋亡細(xì)胞由于染色體的斷裂和濃縮，細(xì)胞核不完整，而是塌縮為幾個(gè)小的區(qū)域，相反壞死細(xì)胞的細(xì)胞核很完整。根據(jù)這個(gè)特征，ImageStream可以通過對細(xì)胞核形態(tài)進(jìn)行分析，清晰的區(qū)分細(xì)胞凋亡的不同階段，區(qū)分晚期凋亡和壞死細(xì)胞（圖18）。LaieApostolicHarlyApoptoti: HYPERLINK http:/www.e LaieApostolicHarlyApoptoti: HYPERLINK http:/www.e www.eNcrotic細(xì)胞周期分析(CellCycleAnalys

30、is)使用細(xì)胞核染料進(jìn)行細(xì)胞染色，然后利用流式細(xì)胞儀檢測，這是細(xì)胞周期分析的常用方法，但這種方法不能區(qū)分有絲分裂的不同階段。傳統(tǒng)的有絲分裂細(xì)胞分析方法是顯微鏡下觀察，但有絲分裂細(xì)胞數(shù)量很少，肉眼進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，效率低下且很難保證準(zhǔn)確性。ImageStream可以將細(xì)胞周期分析和有絲分裂細(xì)胞分析結(jié)合起來。如圖19所示，研究人員利用ImageStream對40000個(gè)HL60細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，然后進(jìn)一步在其中找到了392個(gè)處于有絲分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并將這些細(xì)胞區(qū)分為有絲分裂前期、中期、后期及末期等不同階段。*&QcoVQDQOH丄二*&QcoVQDQOH丄二-0000003421-X3u4nb4

31、l白細(xì)胞亞群分析(CellClassification)白細(xì)胞亞群分析是流式細(xì)胞術(shù)最常見的應(yīng)用之一，利用ImageStream進(jìn)行細(xì)胞分群，不僅可以獲得每個(gè)亞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，還能直觀的看到細(xì)胞圖像(圖20)。PeripheralBlood10000100010M106CMSAF08_kilarMilyLymptwcylesMomcyiesNfLrtrQphil&10000100010M106CMSAF08_kilarMilyLymptwcylesMomcyiesNfLrtrQphil&EcsirkOphirtEcsirkOphirt冬物通ywweW二、分選微型模式生物微型模式動(dòng)物、模式植物種子、

32、大體積細(xì)胞及微球的分選在生命科學(xué)研究中有著非常廣泛的應(yīng)用，但是由于這些對象體積太大，普通流式細(xì)胞儀難以對其進(jìn)行分選，而手工鏡下分選耗時(shí)耗力，效率底下，準(zhǔn)確性難以保證，因此美國UnionBiometrica公司的COPAS生物分選系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。COPAS系統(tǒng)是目前市面上唯一的能夠分選20-1500pm生物微粒的全自動(dòng)、高通量分選系統(tǒng)，可以檢測微粒的尺寸、光密度及熒光信號,并根據(jù)用戶設(shè)定的域值，將相應(yīng)的微粒噴入96孔板或其它容器中，整個(gè)過程對于微粒的生物活性不會(huì)產(chǎn)生任何負(fù)面影響。COPAS技術(shù)平臺(tái)是基于流式細(xì)胞技術(shù)開發(fā)的，但它與普通流式細(xì)胞技術(shù)相比，做了兩個(gè)重要的改進(jìn)以適應(yīng)大體積生物微粒分析與分選的需要。第一，系統(tǒng)管路直徑增大以適應(yīng)20-1500pm大小的生物微粒，這比普通流式細(xì)胞儀用于分選單個(gè)真核細(xì)胞的管路大的多。每一個(gè)COPAS系統(tǒng)都針對不同尺寸范圍的微粒進(jìn)行管路的優(yōu)化設(shè)計(jì)，以便在高速高通量分選時(shí)獲得最好的檢測靈敏度與準(zhǔn)確性。第二，專利的氣流分選裝置一COPAS技術(shù)的核心，那就是（圖21）。當(dāng)不需要收集分選微粒時(shí)，分選系統(tǒng)會(huì)通過氣體將液流吹入廢液槽中；當(dāng)需要分選的微粒經(jīng)過