RFLP,EST,RAPD,AFLP,微衛(wèi)星SSR,線粒體DNA標(biāo)記

1、RFLP限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism,縮寫RFLP）技術(shù)的原 理是檢測DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶 切位點(diǎn)變異的突變?nèi)琰c(diǎn)突變（新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn)）和一段DNA的重新組織（如插入 和缺失造成酶切位點(diǎn)間的長度發(fā)生變化）等均可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。技術(shù)路線:缺點(diǎn)：RFLP分析對樣品純度要求較高，樣品用量大，且RFLP多態(tài)信息含量低，多態(tài)性水平過分依賴于限制性 內(nèi)切酶的種類和數(shù)量，加之RFLP分析技術(shù)步驟繁瑣、 工作量大、成本較高，所以其應(yīng)用受到了一定的限制RFLP原理圖示:South

2、ern BlotGenome.=restriction m士eprobed, regionmigTatinnRFLP原理圖示:Southern BlotGenome.=restriction m士eprobed, regionmigTatinnRAPD原理：RAPD技術(shù)的全稱是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA),此技 術(shù)建立于PCR基礎(chǔ)之上，使用一系列具有10個(gè)左右堿基的單鏈隨機(jī)引物，對基因組的DNA全部 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測多態(tài)性。由于整個(gè)基因組存在眾多反向重復(fù)序列，因此須對每一隨機(jī) 引物單獨(dú)進(jìn)行PCR。單一引物與反向重復(fù)序列結(jié)合。使重

3、復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴(kuò)增。引物 結(jié)合位點(diǎn)DNA序列的改變以及兩擴(kuò)增位點(diǎn)之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導(dǎo)致擴(kuò)增片段 數(shù)目和長度的差異，經(jīng)聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分離后通過EB染色以檢測DNA片段的多 態(tài)性。原理示意圖：DNAtemplsdteDNAtemplsdtePCR reactionproduct Bproduct Aproduct B若位點(diǎn)2處堿基發(fā)生改變，則DNAtemplate444PCR reactionproduct B技術(shù)路線：DNA的提取選擇隨機(jī)引物PCRDNAtemplate444PCR reactionproduct B技術(shù)路線：DNA的提取選擇隨機(jī)引物PCR反應(yīng)

4、凝膠電泳 圖譜分析IRAPD的缺點(diǎn)：RADP圖譜中某些弱帶重復(fù)性較差，而且目前該法在引物長 度和序列及應(yīng)用的引物數(shù)目、擴(kuò)增反應(yīng)條件等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面未 標(biāo)準(zhǔn)化，影響了不同條件下結(jié)果的可比性；每個(gè)標(biāo)記含有的信 息量??；有假陽性或假陰性結(jié)果；顯性標(biāo)記，無法區(qū)分從一個(gè) 位點(diǎn)擴(kuò)增的DNA片段是純合的還是雜合的，無法進(jìn)行等位基因 分析。用在種以上類群間的比較時(shí)無法得到可靠的遺傳距離AFLP原理：AFLP的全稱是擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Leng th Polymorphism)，此技 術(shù)是建立在基因組限制性片段基礎(chǔ)上的PCR擴(kuò)增。由于不同物種的基因組DNA大小不同，基 組DN

5、A經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后,產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與 酶切DNA片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對摸板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，選 擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性,只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸 與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙 烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無來檢出多態(tài)性.原理示意圖：.II RE site #1|II RE site #2IGenomic DNA.Restricted DNA.Complimentary adaptors.Ligated fragment(5)

6、.Primer 1IC4|v Primer 2(6).(7).cPrimerlXC* Primer 2技術(shù)路線:AFLP前增殖萃取材料DNA 用兩種限制 酵素切DNANN設(shè)計(jì)較長的 選擇性引子NNN(5).Primer 1IC4|v Primer 2(6).(7).cPrimerlXC* Primer 2技術(shù)路線:AFLP前增殖萃取材料DNA 用兩種限制 酵素切DNANN設(shè)計(jì)較長的 選擇性引子NNN用PCR將DNA放大和轉(zhuǎn)接子黏*事進(jìn)行電泳分析NN用兩種 選擇性引子$用Marker定位AFLP的缺點(diǎn)：此技術(shù)受到專利保護(hù)，應(yīng)用受到限制，試劑盒價(jià)格昂貴。 另外，操作中通常要利用同位素標(biāo)記，對樣品D

7、NA質(zhì)量要求嚴(yán)格。4 微衛(wèi)星 SSR (simple sequence repeats)原理：微衛(wèi)星DNA是一種廣泛分布于真核生物基因組中的串狀簡單重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)單 元的長度在110bp之間，常見的微衛(wèi)星如TGTGTG= (TG)n或 AATAATAAT= (AAT)n等，不同數(shù)目的核心序列呈串聯(lián)重復(fù)排列，而呈現(xiàn)出長度多態(tài)性。在基因組中，因 每個(gè)SSR序列的基本單元重復(fù)次數(shù)在不同基因型間差異很大，從而形成其座位的多態(tài)性。 而且每個(gè)SSR座位兩側(cè)一般是相對保守的單拷貝序列，據(jù)此可設(shè)計(jì)引物，其關(guān)鍵是首先要 了解SSR座位的側(cè)翼序列(Flanking Region)，尋找其中的特異保守區(qū)。技術(shù)路

8、線：建立DNA文庫，篩選鑒定微衛(wèi)星DNA克隆，然后測定這些克隆的側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)特異性 引物來擴(kuò)增SSR序列。后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色，通過比較譜帶的相對遷移距離， 便可知不同個(gè)體在某個(gè)SSR座位上的多態(tài)性。微衛(wèi)星的優(yōu)點(diǎn)：微衛(wèi)星DNA數(shù)量多且均勻分布在基因組中。據(jù)估計(jì)，在基因組中平均3050kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星，為在整個(gè)基因組中定位更多的基因提供了極大的方便微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性，并且微衛(wèi)星位點(diǎn)檢測可以顯示 純合子和雜合子。微衛(wèi)星檢測容易、重復(fù)性較好、省時(shí)，適合于進(jìn)行自動化分析。通過GeneScan檢測，一個(gè)位點(diǎn)的檢測一般可在24h內(nèi)完成，且可 同時(shí)進(jìn)行多位點(diǎn)的檢測。5線粒體DNA標(biāo)記

9、原理：線粒體基因組是獨(dú)立于核基因組的遺傳物質(zhì)，它普遍存在于真核細(xì)胞中，線粒體內(nèi)包 含有DNA和轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)，是具有一定自主性的細(xì)胞器。線粒體基因組具有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)： 線粒體DNA分子小、拷貝數(shù)高；結(jié)構(gòu)和組織簡單而高度保守；母系遺傳，缺乏重組；DNA 突變率高.6EST(expressed sequence tag)表達(dá)序列標(biāo)簽原理：EST是從一個(gè)隨機(jī)選擇的cDNA克隆進(jìn)行5,端和3,端單一次測序獲得的短的cDNA 部分序列，代表一個(gè)完整基因的一小部分，在數(shù)據(jù)庫中其長度一般從20到7000bp 不等，平均長度為360 120bp OEST來源于一定環(huán)境下一個(gè)組織總mRNA所構(gòu)建 的cDNA文庫，

10、因此EST也能說明該組織中各基因的表達(dá)水平。技術(shù)路線：首先從樣品組織中提取mRNA,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下用oligo (dT)作為引物進(jìn)行 RT -PCR合成cDNA ,再選擇合適的載體構(gòu)建cDNA文庫，對各菌株加以整理，將每 一個(gè)菌株的插入片段根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行兩端一次性自動化測序， 這就是EST序列的產(chǎn)生過程。應(yīng)用：EST作為表達(dá)基因所在區(qū)域的分子標(biāo)簽因編碼DNA序列高度保守而具有自身的特 殊性質(zhì)，與來自非表達(dá)序列的標(biāo)記(如AFLP、RAPD、SSR等)相比更可能穿越家系 與種的限制，因此EST標(biāo)記在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種間比較基因組連鎖圖和比較質(zhì) 量性狀信息是特別有用。同樣，對于一個(gè)DNA序列缺乏的目標(biāo)物種，來源于其他物 種的EST也能用于該物種有益基因的遺傳作圖,加速物種間相關(guān)信息的迅速轉(zhuǎn)化。 具體說,EST的作用表現(xiàn)在：（1）用于