瘧疾檢驗(yàn)技術(shù)精品課件

1、瘧疾檢驗(yàn)技術(shù)第1頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六分子生物學(xué)、血清學(xué)技術(shù)發(fā)展迅猛,但是確診瘧疾的“金標(biāo)準(zhǔn)” 仍然是血液顯微鏡檢查顯微鏡檢查是唯一可鑒別4種瘧原蟲的方法厚薄血涂片的檢查仍被認(rèn)為是不可替代的瘧疾診斷的金標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)第2頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六厚薄血膜的制作 血片制作在制作血片前，首先要核對患者的姓名、年齡和住址第3頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六取血部位和血量采血部位和取血方法：耳垂或無名指，通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒

2、針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小。第4頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六厚血膜 用推片的一角，從取血部位刮取約4微升血量（相當(dāng)于火柴頭大?。?，使血滴與平置的載玻片接觸，再由里向外一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)24圈，涂成直徑0.81厘米大小圓形厚血膜。薄血膜再取一小滴血.將血置于第一張玻片離厚血膜適當(dāng)遠(yuǎn)的地方.將采血玻片(推片)的邊緣緊貼載玻片使 血液沿邊緣散開(如圖示).第5頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六正確的推片姿勢第6頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片位置第7頁，

3、共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六各種不同的瘧疾血片涂制法：標(biāo)準(zhǔn)血片門診發(fā)熱病人血片居民普查血片第8頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六厚薄血膜的標(biāo)準(zhǔn) 厚血膜血量適宜，不宜過多或過少 薄血膜平整,無皺折和空泡.紅細(xì)胞單層排列第9頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六血片染色 兩種染色方法:吉氏染色法瑞氏染色法 常用吉氏染色法第10頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六吉氏染液(原液)的配置 吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油 (純) 250ml 甲醇 (純) 250ml吉氏粉放入研缽中，加少量甘油充分研磨

4、, 然后邊加邊磨，直至甘油加完，將研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研缽中加入少許甲醇清洗研缽，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復(fù)數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，將染液充分搖勻，置于室內(nèi)，每天晃動(dòng)數(shù)分鐘，存放一周后經(jīng)過濾即可使用。保存時(shí)間越長染色效果越好。整個(gè)染色液配制時(shí)間不能少于5個(gè)小時(shí)第11頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六稀釋吉氏原液原液需經(jīng)pH7.0鹽酸緩沖液（PBS）或凈水稀釋后，方可用于厚薄血片染色。 吸取母液時(shí)，不要晃動(dòng)瓶子,以免沉淀物泛起影響染色效果.第12頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六操作1 （快染） 配制5%染液，（每張血片約需染

5、液2ml）：量筒內(nèi)量2ml緩沖液或凈水，直接滴加吉氏原液7滴，混勻，滴入待染標(biāo)本的厚薄血膜上，染色10min，清水細(xì)緩沖洗，晾干鏡檢。操作2 (慢染) 在染色量筒內(nèi)量2ml蒸餾水或凈水， 再滴加吉氏原液4滴，混勻，滴入待染標(biāo)本上，染色3040min。清水細(xì)緩沖洗，晾干鏡檢。吉氏染液濃度門診染色第13頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六將已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液稀釋液（3毫升吉氏原液加緩沖液或凈水97毫升，混勻）浸沒血片，同時(shí)對厚薄血膜染色30min（根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情況，酌情增減染色時(shí)間和濃度），然后用清水輕輕將染液漂洗干凈，將血片標(biāo)本（血膜面朝下）

6、插于晾干板上晾干，包裝，鏡檢。 成批血片染色第14頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六質(zhì)量好的染色 : 核呈紅色,胞漿呈藍(lán)色 如果血片偏紅,說明染液偏酸性如果血片偏藍(lán),說明染液偏鹼性外觀吉氏染色血片第15頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六染色過程將血片平置于染色板上。用吸管吸取已稀釋的吉氏液約2ml于厚薄血膜上，染色10 min。用清水細(xì)緩沖去染液。置玻片于插板上，自然晾干。血片干燥后, 用甲醇固定薄血膜。第16頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六血片制作與染色注意事項(xiàng) 使用前載玻片一定要清潔，不然會(huì)影響 血片制作和鏡檢結(jié)果 厚血膜

7、干燥時(shí)不要加熱，加熱會(huì)使原蟲變形，影響鏡檢結(jié)果 配置母液時(shí)過濾可除去雜質(zhì)顆粒，有助于提高鏡檢質(zhì)量 固定薄血膜時(shí)不要將甲醇觸碰到厚血膜 沖洗染液時(shí)，不要沖走厚血膜。第17頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六原蟲密度計(jì)算估計(jì)瘧原蟲感染程度有三種方法：半定量計(jì)數(shù)法 檢查厚血膜白細(xì)胞原蟲密度計(jì)數(shù)法檢查厚血膜紅細(xì)胞感染率計(jì)算法檢查薄血膜第18頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六用厚血膜每個(gè)視野中所觀察到瘧原蟲的平均數(shù)粗略地估計(jì)出瘧原蟲密度。這種方法簡便，缺點(diǎn)是計(jì)數(shù)的瘧原蟲數(shù)受血膜厚薄影響，只能定性，不宜作定量分析。國內(nèi)常用。此方法將密度分為6級(jí)：1.全厚血膜查見瘧

8、原蟲數(shù)在10個(gè)以內(nèi)，記錄實(shí)際數(shù)字2.全厚血膜查見瘧原蟲數(shù)在10個(gè)以上，但平均每個(gè)視野不到1個(gè)蟲，記錄“少”3.平均每個(gè)視野15個(gè)蟲，記錄“”4.平均每個(gè)視野610個(gè)蟲，記錄“+”5. 平均每個(gè)視野11100個(gè)蟲，記錄“+ ”6. 平均每個(gè)視野100個(gè)蟲以上，記錄“+ ”。半定量計(jì)數(shù)法第19頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六白細(xì)胞瘧原蟲密度計(jì)數(shù)法（WHO推薦）白細(xì)胞瘧原蟲密度計(jì)數(shù)法重要性 用于瘧疾研究 用于臨床診斷 用于抗瘧后瘧疾考核第20頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六在厚血膜，按要求選擇視野，計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞中的瘧原蟲數(shù)（可分有性體和無性體），

9、如果原蟲密度較低，可增加白細(xì)胞計(jì)數(shù)（500 1 000 個(gè)）。白細(xì)胞瘧原蟲計(jì)算公式： 瘧原蟲數(shù) 患者每微升血的白細(xì)胞數(shù) 計(jì)數(shù)的白細(xì)胞數(shù) = 瘧原蟲數(shù)/l血。 如果不知患者的白細(xì)胞數(shù)，則每微升血以8 000個(gè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)(國際標(biāo)準(zhǔn)) 。白細(xì)胞瘧原蟲密度計(jì)數(shù)法（WHO推薦）第21頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六白細(xì)胞瘧原蟲計(jì)數(shù)法舉例假設(shè)計(jì)數(shù)200 WBC中有35個(gè)瘧原蟲，在不知患 者白細(xì)胞數(shù)的情況下，以每微升血8000個(gè)白細(xì) 胞為數(shù), 由此計(jì)算出每微升血液瘧原蟲密度為：35（原蟲數(shù)）x 8000200（白細(xì)胞數(shù)） =1400 / l答：該患者原蟲密度為1400 / l。第22

10、頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六薄血膜不同區(qū)域的紅細(xì)胞瘧原蟲感染率有較大差別，通常血膜后端和邊緣部瘧原蟲密度常比前半部或中央部高，所以，鏡檢時(shí)不宜只檢查一個(gè)角落，應(yīng)順玻片的橫軸檢查。鏡檢時(shí)，應(yīng)當(dāng)記錄下所觀察到的各種瘧原蟲蟲期，不要籠統(tǒng)地記錄為Pv或Pf。紅細(xì)胞感染率計(jì)算法（薄血膜）第23頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六1. 按以下公式計(jì)算： 紅細(xì)胞原蟲感染率（%）= 瘧原蟲數(shù) X 100 計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞數(shù)2. 顯微鏡下選擇紅細(xì)胞排列整齊密集，無重迭的視野（ 300-500紅細(xì)胞/視野）3. 按一定順序移動(dòng)血片記數(shù)紅細(xì)胞的同時(shí)，記錄瘧原蟲數(shù)4. 如果

11、能見到瘧原蟲，但是記數(shù)500010000個(gè)紅細(xì)胞時(shí)卻沒有感染紅細(xì)胞，那么設(shè)定感染率為 紅細(xì)胞感染率計(jì)算法（薄血膜）第24頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六如何確定瘧原蟲血片為陰性 檢查全部厚血膜未查見瘧原蟲 最少檢查100個(gè)厚血膜油鏡視野未查見 瘧原蟲第25頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六人類四種瘧原蟲的 基 本特征第26頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六感染人的瘧原蟲有四種: 惡性瘧原蟲 P. falciparum 間日瘧原蟲 P. vivax三日瘧原蟲 P. malariae 卵形瘧原蟲 P. ovale 第27頁，共56

12、頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六惡性瘧 P.falciparum 四種瘧原蟲中致病力最強(qiáng) 無免疫力者感染后出現(xiàn)急性癥狀,不及時(shí)治 療可危及生命 在我國主要流行云南省和海南省 第28頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六間日瘧 P.vivax 間日瘧原蟲分布于我國大部分地區(qū)， 主要是中部地區(qū) 引起間日瘧, 病程呈良性, 但有復(fù)發(fā) 第29頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六三日瘧 P.malariae 三日瘧在我國已基本消滅主要發(fā)生在晚秋及初冬, 無復(fù)發(fā) 卵形瘧 P.ovale又稱蛋形瘧原蟲, 在我國已基本消滅引起癥狀與間日瘧相似, 但很少復(fù)發(fā)第

13、30頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六 四種瘧原蟲的 診斷要點(diǎn) 第31頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六環(huán)狀體釬細(xì), 紅細(xì)胞不漲大一個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)可有幾個(gè)環(huán)狀體 環(huán)狀體內(nèi)可有2個(gè)核 環(huán)狀體可貼在紅細(xì)胞邊緣 血片中沒有其他發(fā)育期滋養(yǎng)體 配子體呈新月形或臘腸形 可出現(xiàn)茂氏點(diǎn)惡性瘧（P.falciparum）鑒定 要點(diǎn)第32頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六紅細(xì)胞通常漲大 薛氏點(diǎn)明顯 成熟環(huán)狀體粗大滋養(yǎng)體有阿米巴樣偽足可見不同發(fā)育期的原蟲 間日瘧（P. vivax ）鑒定要點(diǎn)第33頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六環(huán)

14、狀體可呈方形帶狀形是特點(diǎn) 成熟滋養(yǎng)體呈菊花狀,內(nèi)含612個(gè)裂殖子 紅細(xì)胞不漲大，略縮小有時(shí)有西門氏點(diǎn) 三日瘧（P.malariae）診斷要點(diǎn)第34頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六卵形瘧（P. ovale）診斷要點(diǎn)紅細(xì)胞略漲大或不變大 紅細(xì)胞邊緣呈車輪狀環(huán)狀體有時(shí)呈現(xiàn)魚眼狀薛氏點(diǎn)明顯 成熟滋養(yǎng)體類似三日瘧原蟲,但更粗大原蟲呈卵圓形 第35頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六 薄血膜中瘧原蟲寄生時(shí) 紅細(xì)胞的變化間日瘧原蟲三日瘧原蟲惡性瘧原蟲卵形瘧原蟲漲大,色淺淡,略變形 可見薛氏點(diǎn)(除早期環(huán)狀體時(shí)) 多重感染少見 瘧色素黃褐色,散在,呈小桿狀正常,或略小

15、 正常染色時(shí)點(diǎn)彩不明顯多重感染少見 色素見于早期 ,黑色顆粒狀,多見于細(xì)胞周圍正常大小 常見多重感染 一些細(xì)胞呈黃色邊緣較厚 過度染色時(shí)茂氏點(diǎn)明顯 瘧色素顆粒較粗 新月形配子體外紅細(xì)胞膜見不到感染紅細(xì)胞略漲大或不變大 通常呈卵圓形 感染紅細(xì)胞邊緣破碎狀 薛氏點(diǎn)明顯瘧色素棕黃色,類似間日瘧原蟲第36頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六種周圍血中發(fā)育階段紅細(xì)胞形態(tài)瘧原蟲形態(tài)大小點(diǎn)彩胞漿瘧色素裂殖子數(shù)惡性瘧原蟲環(huán)狀體配子體正常常見茂氏點(diǎn)環(huán)狀體釬細(xì)，常見個(gè)核粗黑，配子體中明顯16-32間日瘧原蟲各期滋養(yǎng)體裂殖體和配子體漲大,可達(dá)正常的 1.5-2 倍薛氏點(diǎn)可出現(xiàn)阿米巴樣滋養(yǎng)體，淺藍(lán)

16、色，活潑金棕色不明顯12-24卵形瘧原蟲各期滋養(yǎng)體裂殖體漲大,可達(dá)正常的 1.25-1.5倍薛氏點(diǎn)可出現(xiàn)卵圓形滋養(yǎng)體，藍(lán)色較深，核較大深棕色明顯4-12三日瘧原蟲各期滋養(yǎng)體裂殖體和配子體正常西門氏點(diǎn)少見圓形，藍(lán)色深，核緊縮，滋養(yǎng)體帶狀深棕色，粗明顯6-12呈菊花狀第37頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六鏡檢示教以下血片采自現(xiàn)癥病例第38頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六This is a thin film from a 27 year old female backpacker, with a recent history of trekking

17、through Northern Thailand and high fever. A typical Plasmodium falciparum presentation.Numerous fine ring forms Double chromatin dots Marginal forms Red cells are not enlarged第39頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六A thin film from a 22 year old male holidaying in Lombok (Indonesia) one month previously. Int

18、ermittent fevers since returning. A typical Plasmodium vivax presentationSalient features are: Developing and thick (signet) ring forms Enlarged red cells 第40頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六Recent travel in Africa. Pyrexia of unknown origin. A typical Plasmodium ovale presentationDeveloping form of plas

19、modium Comet-like red cells Enlarged red cell 第41頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六Female patient, arrived from Brazil two weeks previously. Flu like symptoms since arrival. A typical Plasmodium malariae presentationBroad band form of plasmodium Red cells not enlarged第42頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六This is

20、 a thick film prepared from a 32 year old male recently returned from Vietnam. Numerous ring form of Plasmodium can be seen (as indicated by the arrows). Note size of neutrophils (for comparison).The only definitive diagnosis that can be made from this film is that Malaria is present. Thin films wou

21、ld have to be examined for species identification.第43頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六讀片練習(xí)第44頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago. 第45頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六3. History of round the world safari including S. America, Asia and Africa. General malaise. 第46頁

22、，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六4. Unspecified overseas travel. Presented with temperature 38.4C 第47頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六5. Male recently returned to Australia after backpacking through Asia. History of flu like symptoms. 第48頁，共56頁，2022年，5月20日，0點(diǎn)48分，星期六6. New Australian previously from Malaysia. Intermittent temperatures and head