病毒載量檢測方法及其意義

1、病毒載量檢測方法及其意義第1頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五病毒載量（viral load）代表的是病毒的負(fù)荷，即體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量。實(shí)際上，體內(nèi)復(fù)制的病毒的數(shù)量是不能直接測量的，一般用每毫升血漿中HIV RNA的拷貝數(shù)代表HIV的病毒載量。 第2頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五一、通常的病毒載量測定方法bDNA方法(分枝DNA雜交試驗(yàn))NASBA(核酸序列擴(kuò)增試驗(yàn))Cobas Amplicor HIV-1 Monitor(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))熒光定量PCR第3頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五bDNA 是一種夾心式的核

2、算雜交反應(yīng)過程，用于直接定量檢測血漿中HIV-1 RNA 的含量。首先，通過離心將血漿中的HIV-1 富集起來。HIV-1 病毒基因組RNA從病毒顆粒中釋放出來后，首先會(huì)被一組合成的寡核苷酸探針又稱捕獲探針?biāo)Y(jié)合并連接在微孔板上，然后通過另外一些靶定探針使病毒RNA與預(yù)放大探針結(jié)合。捕獲探針包括十七個(gè)可與基因組特異結(jié)合的捕獲位，靶定探針包括81個(gè)可與基因組特異結(jié)合的靶定區(qū)，分別靶定在病毒RNA pol 基因的不同區(qū)段。放大探針結(jié)合到預(yù)防大探針上，從而形成支鏈DNA復(fù)合體。隨后多拷貝的堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的探針與該復(fù)合體雜交結(jié)合。與化學(xué)發(fā)光底物共同孵育，所產(chǎn)生的光強(qiáng)度與樣品中HIV-1RNA的

3、量成正比，以相對光強(qiáng)度單位（RLUs）表示的光度值被分析系統(tǒng)記錄下來，試劑盒中含有已知濃度的經(jīng)-丙內(nèi)酯（BPL）處理的HIV-18E5/LAV病毒液作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中HIV-1 RNA的量可對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。 擴(kuò)增HIV-1 M組的A-H亞型。第4頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測的定量范圍為50至500,000HIV-1 RNA拷貝/ml。檢測結(jié)果以如下形式報(bào)告：低于最低定量限的值報(bào)告為“500,000” HIV-1 RNA拷貝/毫升。高于500,000HIV-1 RNA拷貝/毫升的樣本位于檢測的最高定量限以上，必須適當(dāng)稀

4、釋以獲得確切的量值。在人血漿中稀釋高濃度樣本，稀釋用血漿需經(jīng)VERSANT HIV-1 RNA3.0 Assay (bDNA) 檢測鑒定不含HIV-1 RNA，按照實(shí)驗(yàn)流程重新檢測，得出的結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)以確定初始樣本的病毒載量。第5頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR實(shí)驗(yàn)包括以下步驟：樣本制備靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA用HIV-1特異互補(bǔ)引物進(jìn)行靶cDNA PCR擴(kuò)增通過比色進(jìn)行與探針結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物的測定第6頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五COBAS AMPLICOR HIV-1 MONI

5、TOR 試劑對HIV-1病毒RNA的定量檢測是采用HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品來完成的。HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品是包括作為HIV-1靶RNA引物結(jié)合部位和HIV-1擴(kuò)增子單一探針結(jié)合區(qū)的非感染性RNA轉(zhuǎn)錄物。將已知拷貝數(shù)的HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品加到每一個(gè)樣本中和HIV-1靶序列一起共同進(jìn)行樣本制備、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增、雜交和檢測。COBAS AMPLICOR 分析儀根據(jù)HIV-1定量標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)據(jù)計(jì)算每一個(gè)樣本的HIV-1RNA 的含量?？蓴U(kuò)增HIV-1 M組的A-H基因亞型。第7頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)：能夠定量400-750000拷貝/毫升的 HIV RNA，需要0

6、.2毫升血漿。超敏試驗(yàn)：能夠定量50-75000拷貝/毫升的HIV RNA,需要0.5毫升血漿。 第8頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五NucliSens EasyQ HIV-1實(shí)驗(yàn) 是使用NASBA技術(shù)的靶擴(kuò)增試驗(yàn)。NASBA技術(shù)選擇性地直接擴(kuò)增RNA而沒有PCR步驟，用2個(gè)寡核苷酸引物、3個(gè)酶、三磷酸脫氧核苷和合適的緩沖液進(jìn)行一步夾心雜交。首先用異硫氰酸胍和氧化硅顆粒提取高純度RNA，RNA通過重復(fù)的合成和轉(zhuǎn)錄雙鏈DNA中間體得到擴(kuò)增。在AMV-RT的作用下，HIV-1gag區(qū)的引物P1介導(dǎo)由標(biāo)本RNA合成cDNA，RNA鏈被RNAse降解。引物P2結(jié)合啟動(dòng)第二條DN

7、A鏈合成，反義RNA通過T7多聚酶啟動(dòng)雙鏈DNA合成，這個(gè)循環(huán)不斷重復(fù)，使得靶RNA在等溫條件下大量擴(kuò)增100萬到1000萬倍，然后直接用化學(xué)發(fā)光法確定核酸量，通過HIV特異的gag和pol區(qū)的3個(gè)內(nèi)標(biāo)同時(shí)擴(kuò)增而達(dá)到定量目的。它具有高度敏感性和廣闊的動(dòng)態(tài)范圍。 最近NucliSens HIV-1定量實(shí)驗(yàn)有了較大改進(jìn)，將NASBA核酸擴(kuò)增技術(shù)與實(shí)時(shí)(real-time)檢測技術(shù)結(jié)合起來,能夠?qū)z測進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。結(jié)果表達(dá)方式由每毫升標(biāo)本的拷貝數(shù)（cp/ml）改變?yōu)槊亢辽龂H單位（IU/ml）。 可擴(kuò)增HIV-1 M組的A-G亞型。 第9頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五Nuc

8、liSens 核酸分析系統(tǒng)利用三項(xiàng)技術(shù)：專利的BOOM核酸提純技術(shù):手 工 manual 半自動(dòng)miniMAG 自 動(dòng) easyMAG“擴(kuò)增RNA”的NASBA技術(shù)使用熒光分子信標(biāo)（molecular beacon)對擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測技術(shù)第10頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五三種病毒載量檢測技術(shù)比較廠家bioMerieuxRocheSimens(Bayer)商品名Nuclisens Easy QCOBAS Amplicor HIV-1 Monitor 1.5Versant 3.0擴(kuò)增和檢測原理擴(kuò)增：NASBA檢測：Real Time. Molecular Beacon

9、實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測擴(kuò)增：RT-PCR檢測：底物顯色先擴(kuò)增再檢測無需擴(kuò)增：bDNA分枝信號(hào)放大系統(tǒng)檢測：化學(xué)發(fā)光先雜交，再檢測線性范圍50-3,000,000IU/ml(v1.1)線性范圍廣，無需稀釋標(biāo)本重復(fù)檢測，報(bào)告國際單位，易于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)25-10,000,000IU/ml(v2.0)普通方法：400-750,000Copies/ml超敏方法：50-75,000Copies/ml線性范圍有限，高濃度樣本需稀釋檢測，超敏方法需要用低溫超速離心機(jī)離心1個(gè)小時(shí)50-500,000Copies/ml核酸提取硅膠固相吸附異硫氰酸胍裂解，提純效率高，核酸純度高，操作可見可與全自動(dòng)核酸提取儀配套使用，提純效率高，

10、操作簡便異丙醇沉淀異硫氰酸胍裂解，沉淀物不可見，易引起操作誤差，異丙醇化學(xué)毒性標(biāo)本只使用EDTA抗凝血漿不需純化核酸異硫氰酸胍裂解標(biāo)本只使用于EDTA抗 凝血漿第11頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五廠家bioMerieuxRocheSimens(Bayer)擴(kuò)增NASBA適用RNA,等溫?cái)U(kuò)增無需溫度循環(huán)，產(chǎn)物為RNA,全程在單一密封管內(nèi)進(jìn)行，無污染問題。在擴(kuò)增的同時(shí)進(jìn)行檢測，效率高RT-PCR產(chǎn)物為DNA，易發(fā)生污染，對實(shí)驗(yàn)室區(qū)域劃分嚴(yán)格bDNA不對目標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增，只進(jìn)行信號(hào)放大檢測分子信標(biāo)實(shí)時(shí)檢測熒光信號(hào)，敏感性高，檢測范圍廣辣根過氧化物酶標(biāo)記檢測探針，TMB底物顯色用

11、樣品OD值和定標(biāo)物OD值的比值計(jì)算結(jié)果，需要稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測范圍小，并且受酶活性、底物氧化顯色的影響各級(jí)探針與被檢物核酸雜交，檢測發(fā)光信號(hào)強(qiáng)弱雜交孵育時(shí)間長，需要16個(gè)小時(shí)標(biāo)本數(shù)量每次檢測8的整數(shù)倍標(biāo)本直至48個(gè)不需要陰陽性對照每次檢測12或24個(gè)標(biāo)本需要設(shè)一個(gè)陰性、一個(gè)弱陽性和一個(gè)強(qiáng)陽性對照每次檢測12的整數(shù)倍標(biāo)本需設(shè)一個(gè)陰性、一個(gè)弱陽性和一個(gè)強(qiáng)陽性對照試劑盒包裝48人份/盒每次試驗(yàn)8人份分裝獨(dú)立包裝，長期穩(wěn)定48人份/盒每次試驗(yàn)12人份分裝一旦打開試劑盒，需要在1個(gè)月內(nèi)使用完48人份，否則試劑失效192人份/盒每次試驗(yàn)12人份分裝工作效率6.5小時(shí)48份標(biāo)本8小時(shí)24份標(biāo)本48小時(shí)192

12、份標(biāo)本第12頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五二、病毒載量檢測的意義早期診斷 嬰兒的早期診斷：感染HIV的母親所生嬰兒小于18個(gè)月時(shí)，不能按照常規(guī)檢測程序進(jìn)行抗體檢測來確證是否感染了HIV。這種情況下，采集嬰兒不同時(shí)間的樣本進(jìn)行HIV核酸檢測。 也可使用集合法對采供血機(jī)構(gòu)的原料血漿及HIV抗體陰性的高危人群樣品進(jìn)行核酸檢測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)窗口期感染者，降低“殘余危險(xiǎn)度”，預(yù)防傳播。第13頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五疑難樣本的輔助診斷 在感染早期或疾病終末期出現(xiàn)抗體不確定反應(yīng)時(shí)，RNA的測定結(jié)果可幫助提供HIV感染早期或終末期的證據(jù)。但在一般情況下，抗

13、體檢測足以對HIV感染與否作出正確診斷。第14頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五病程監(jiān)控及預(yù)測 HIV感染后病毒載量的變化具有一定的規(guī)律，這種變化與疾病的進(jìn)程密切相關(guān)。定期進(jìn)行病毒載量檢測有助于確定疾病發(fā)展的階段，以確定相應(yīng)的治療方案。HIV病毒載量與6年發(fā)病率的關(guān)系：病毒載量(拷貝/毫升) 6年發(fā)病率（%）30000 80第15頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五指導(dǎo)抗病毒治療及療效判定 通常在病毒載量達(dá)到一定水平后（如35000-50000拷貝/毫升）抗病毒治療才顯示良好的治療效果。治療后通過病毒水平的檢測能夠確定治療是否有效。理想的結(jié)果是治療24

14、周后，病毒水平會(huì)控制在檢測線以下。第16頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五.耐藥性監(jiān)測 可用于HIV耐藥性檢測和監(jiān)測。治療后病毒載量得不到有效控制時(shí)被認(rèn)為治療失敗。引起治療失敗的原因之一是病毒對治療藥物的敏感性降低或不敏感，也就是產(chǎn)生了耐藥。對病毒載量1000拷貝/毫升的樣本進(jìn)行耐藥性檢測對臨床醫(yī)生修改治療方案有一定的幫助。第17頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五三、影響病毒載量測定結(jié)果的因素 樣本類型： 血漿和血清標(biāo)本都可用來測定病毒載量，但是血清的檢測結(jié)果大約是血漿的50%（ 30-80% ），可能是因?yàn)檠耗痰倪^程中HIV顆粒被包裹在纖維蛋白

15、網(wǎng)絡(luò)中，導(dǎo)致血清中病毒的濃度下降。因此，測定病毒載量應(yīng)該首選血漿標(biāo)本，血漿也是臨床使用的唯一標(biāo)本。血清標(biāo)本對于研究也是可以接受的，重要的是每位病人使用的標(biāo)本類型應(yīng)始終保持一致。 第18頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五抗凝劑 ：抗凝劑能夠顯著影響測定的結(jié)果。肝素鈉處理的血漿不適合做Amplicor HIV-1 Monitor試驗(yàn)，因?yàn)楦嗡厥荘CR反應(yīng)的一個(gè)潛在的抑制劑。如果必須用RT-PCR方法測量肝素處理的血漿，可以向標(biāo)本中加入肝素酶以分解肝素。另外，肝素處理的血漿中病毒顆粒降解的速率顯著高于EDTA鈉鹽和枸櫞酸鈉處理的血漿，一般情況下不同抗凝劑處理的血液6小時(shí)之內(nèi)HI

16、V RNA的降解速率分別是1.8%/小時(shí)（EDTA）、3.3%/小時(shí)（枸櫞酸鈉）和5.0%/小時(shí)（肝素）。在血液處理方法相同的條件下，用EDTA鈉鹽抗凝的血漿結(jié)果顯著優(yōu)于枸櫞酸鈉和肝素，因此EDTA鈉鹽是首選的抗凝劑。第19頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五標(biāo)本處理時(shí)間：HIV-1在體內(nèi)進(jìn)行快速轉(zhuǎn)換，平均半衰期是大約6個(gè)小時(shí)。HIV-1在體外未處理的全血中也快速降解，全血中HIV RNA的降解速率在6小時(shí)之內(nèi)平均是9%（0.04log）,最大的降解速率是在采血以后6-8小時(shí)，采血以后30小時(shí)內(nèi)可能減少0.5log。因此為了減少病毒顆粒降解對檢測的影響，應(yīng)該在采血以后6小時(shí)

17、之內(nèi)分離血球和血漿。 第20頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五樣品的保存溫度：-70室溫凍融3次，HIV RNA變化的幅度小于0.2log。-70保存5個(gè)月，HIV RNA減少。保存12個(gè)月，HIV RNA減少一般不超過0.4log.血漿在室溫或4 保存3天，HIV RNA減少不超過0.5log。-20 保存2-3年，病毒載量大約減少50%左右。反復(fù)凍融影響更大。第21頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五四、病毒載量測定結(jié)果的分析和解釋 分析一個(gè)病人不同時(shí)間病毒載量測定的結(jié)果時(shí)，首先要考慮測定結(jié)果的變化是真實(shí)的生物學(xué)改變還是方法本身的變異或誤差。病毒載

18、量的變化超過0.5log（大約是3倍）就超過了實(shí)驗(yàn)和每日的正常變化，應(yīng)被視為有生物學(xué)意義的變化，而0.5log以內(nèi)的變化就很難與隨機(jī)的變異相區(qū)分。特別需要注意的是在接近檢測下限的時(shí)候，實(shí)驗(yàn)的變異對于解釋病毒載量變化的意義有更大的影響。例如，病毒載量從50cp/ml增加到150cp/ml，雖然變化的幅度達(dá)到0.5log，但真正反映的可能是實(shí)驗(yàn)的變異而不是抗病毒治療的失敗，因此對于接近檢測下限的測定結(jié)果需要進(jìn)行認(rèn)真分析。 第22頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五五、病毒載量測定的質(zhì)量管理 質(zhì)量保證 質(zhì)量保證指從接收樣品到發(fā)出報(bào)告的整個(gè)過程中，為確保最終結(jié)果的正確性所采取的全部

19、措施。質(zhì)量控制 制定和實(shí)施質(zhì)量控制計(jì)劃之前首先要對使用的方法和系統(tǒng)進(jìn)行深入的了解，包括方法的檢出限、偏性、誤差被接受和拒絕的統(tǒng)計(jì)學(xué)水平。質(zhì)量控制包括3個(gè)部分：對照（control）、程序（Procedure）和規(guī)則（rules）。 質(zhì)量評(píng)價(jià) 可以用已知HIV RNA濃度的血漿樣品進(jìn)行外部質(zhì)量評(píng)價(jià)。對質(zhì)量評(píng)價(jià)樣品的要求是：（1）覆蓋檢測的動(dòng)態(tài)范圍，一般要求5個(gè)log。（2）重復(fù)測定同一份樣品考察精密度。（3）包含HIV-1不同亞型的樣品。 第23頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五六、樣本采集及分裝注意事項(xiàng)樣本采集：用EDTA抗凝管采集樣本5ml ，立即顛 倒混勻8-10次，避免溶血。按照要求編號(hào)。樣本分裝：處理樣本時(shí)戴一次性無粉手套。核對樣本編號(hào)及數(shù)量。2-6個(gè)小時(shí)之內(nèi)用普通離心機(jī)3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘分離血漿（一定要保證足夠的離心時(shí)間）。用去RNA酶的帶濾芯吸頭吸出血漿，分裝到兩個(gè)已編號(hào)的去RNA酶的螺口管中，每管。編號(hào)要清晰。項(xiàng)目樣本按照項(xiàng)目要求編號(hào)；只做病毒載量檢測的樣本應(yīng)編抗病毒治療號(hào)。第24頁，共29頁，2022年，5月20日，8點(diǎn)41分，星期五七、樣本的儲(chǔ)存：近幾天需要檢測的血漿可放于2-8 3個(gè)月以內(nèi)檢測的血