病毒的分子生物學(xué)

1、病毒的分子生物學(xué)第1頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.1 病毒分子生物學(xué)研究的內(nèi)容 病毒分子生物學(xué)是用現(xiàn)代分子生物學(xué)的新理論、新技術(shù)和新方法對病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能，基因組的復(fù)制、表達和調(diào)控，病毒與宿主的相互作用關(guān)系等進行研究的一門學(xué)科。 第2頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五人類對病毒的研究成果在現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展史上，做出了重大的貢獻。許多分子生物學(xué)上的重大突破都是以病毒作為模式或研究材料而進行的。 第3頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五其研究成果除了揭示許多重要的分子生物學(xué)過程之外，對人類認識病毒感染、致病的分子本

2、質(zhì)，為病毒引起疾病的診斷、預(yù)防和治療提供了理論基礎(chǔ)，促進了基因工程疫苗和抗病毒藥物的研制和發(fā)展。 第4頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五病毒分子生物學(xué)研究領(lǐng)域12.1.1 病毒基因組的結(jié)構(gòu)12.1.2 病毒基因組的復(fù)制和表達調(diào)控12.1.3 病毒對宿主細胞的影響12.1.4 病毒與腫瘤發(fā)生12.1.5 病毒的基因工程疫苗與病毒載體第5頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.1.1 病毒基因組的結(jié)構(gòu)不同類型的病毒，其基因組有很大差異。在核酸類型上，有DNA病毒(如腺病毒)，有RNA病毒(如反轉(zhuǎn)錄病毒)，但對每一種病毒來說，它只能含有一種核酸。第6頁，共

3、56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五從核酸結(jié)構(gòu)上看，有的是單鏈核酸，有的是雙鏈核酸，有的是線狀，有的是環(huán)狀。一些單鏈RNA病毒的基因組還具有不同的極性，有的是正鏈RNA，有的是負鏈RNA。 第7頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五有的正鏈RNA病毒基因組5端有帽子結(jié)構(gòu)，也有的正鏈RNA病毒基因組3端有poly(A)尾結(jié)構(gòu)。 第8頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五相對于能獨立生活的微生物來說，病毒的基因組非常簡單。病毒核酸的相對分子質(zhì)量約為1.61071.6108，僅為一般細菌基因組的1l/10。 第9頁，共56頁，2022年，5月20日，

4、8點41分，星期五12.1.2 病毒基因組的復(fù)制和表達調(diào)控病毒進入活的易感宿主細胞后，借助于宿主細胞本身提供的原料、能量、酶等，以自我復(fù)制的方式進行繁殖。第10頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五病毒基因的表達包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個過程。正鏈RNA病毒的基因組除了作為模板復(fù)制出子代RNA之外，還有mRNA的作用。作為翻譯的模板，一般先翻譯出單一的大分子肽鏈，然后再由蛋白酶降解為不同功能的結(jié)構(gòu)蛋白等。 第11頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五負鏈RNA病毒的基因組無mRNA的功能，必須由復(fù)制出的互補RNA(cRNA)來發(fā)揮mRNA的作用。 第12頁，共56頁

5、，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.1.3 病毒對宿主細胞的影響病毒只能在活細胞中存活，因此，病毒與宿主細胞之間有著十分密切的關(guān)系。病毒利用宿主細胞的細胞器、能量和酶等進行自身的復(fù)制，并通過宿主細胞的蛋白表達系統(tǒng)來表達自身所需的蛋白質(zhì)，這些過程都將會對宿主細胞的形態(tài)和功能產(chǎn)生重大的影響。 第13頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五病毒對宿主細胞的影響主要體現(xiàn)在病毒對宿主細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的影響以及病毒對宿主細胞功能的影響兩個方面。 第14頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.1.4 病毒與腫瘤發(fā)生 人類和動物腫瘤的形成除了與遺傳和環(huán)境因素相

6、關(guān)外，某些DNA和RNA病毒也可以通過不同的機制誘發(fā)惡性腫瘤。 有些病毒直接作用于細胞的基因組，使細胞增殖，最終導(dǎo)致腫瘤形成；有些病毒則通過抑制機體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)變，形成腫瘤。第15頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五有些病毒常伴隨一些特定腫瘤的發(fā)生，但它們與腫瘤的關(guān)系還未得到確認.例如在艾滋病病人中引發(fā)的Kaposis肉瘤?？傊?，大約15%的惡性腫瘤與病毒有關(guān)，因此研究腫瘤的病毒病因具有十分重要的意義。第16頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.1.5 病毒基因工程疫苗與病毒載體基因工程疫苗是指用基因工程的方法，表達病原微生物的一段基因

7、序列，將表達產(chǎn)物(多數(shù)是無毒性、無感染能力，但具有較強的免疫原性)用作疫苗，例如正在使用的大多數(shù)乙型肝炎疫苗就是基因工程疫苗。第17頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五常見的基因工程疫苗包括亞基疫苗和肽疫苗兩類。以流感疫苗為例，其途徑就是把病毒的免疫原蛋白(HA抗原、NA抗原)的mRNA提取出來，再制備cDNA,克隆到大腸桿菌中，高效表達該抗原。 第18頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五由于基因工程疫苗具有安全性好、產(chǎn)量高、成本低，以及良好的免疫原性，它必將成為傳統(tǒng)疫苗的有效替代疫苗。 第19頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12

8、.2 DNA病毒的分子生物學(xué)DNA病毒基因組有單鏈和雙鏈兩種結(jié)構(gòu)，并以線狀或環(huán)狀形式存在，大部分為單一分子，也有的由數(shù)個片段的DNA分子構(gòu)成分段的基因組。 第20頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五動物DNA病毒多為雙鏈DNA基因組，腺病毒、痘病毒、皰疹病毒都是雙鏈線狀DNA基因組，末端有重復(fù)序列，經(jīng)退火能形成環(huán)形分子。腺病毒(Aflenovirus)是一種典型的雙鏈DNA病毒，下面以腺病毒的基因表達調(diào)控為例，簡要介紹DNA病毒的分子生物學(xué)。 第21頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.2.1 腺病毒的發(fā)現(xiàn) 1953年，Rowe等人從外科手術(shù)摘除的兒

9、童腺體中分離到一種致病因子，可以使培養(yǎng)的細胞發(fā)生慢性進行性病變，稱之為腺體退化因子，后來證明這種致病因子是病毒，1956年，Enders等建議命名為腺病毒。 第22頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五腺病毒分布十分廣泛， 從各種胎生哺乳動物、鳥類和兩棲類動物中都已分離到。腺病毒科分兩個屬： 1、哺乳動物腺病毒屬 (Mastadenovirus) 2、禽腺病毒屬(Ariadenovirus)。 第23頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五腺病毒感染細胞后可關(guān)閉宿主細胞某些基因的表達，大量合成病毒蛋白質(zhì)，致使細胞的功能失常。腺病毒致癌的分子機理是目前分子病毒學(xué)

10、的一個重要研究領(lǐng)域。 第24頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.2.2 腺病毒的毒粒結(jié)構(gòu) 完整的腺病毒顆粒其相對分子質(zhì)量1.7108-1.85108，沉降常數(shù)約560S，在 CsCl中的密度為1.321.35g/cm3。腺病毒對熱和酸穩(wěn)定，能在腸道中存活。腺病毒顆粒無包膜，外邊是蛋白外殼，中間為緊密的核心顆粒，內(nèi)含單一拷貝的雙鏈DNA。 第25頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.2.3 腺病毒的基因組結(jié)構(gòu) 腺病毒基因組為線形雙鏈 DNA，人類腺病毒基因組包括早期基因 E1A、 E1B、E2A、E2B、E3 和 E4以及晚期基因 L1、L2、L

11、3、L4 和 L5。 第26頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.2.4 腺病毒的復(fù)制第27頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.2.5 腺病毒的基因轉(zhuǎn)錄 第28頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.2.6 腺病毒與腫瘤至今尚未發(fā)現(xiàn)腺病毒感染與任何人類腫瘤的關(guān)系。但許多的人類腺病毒卻可以使嚙齒動物的培養(yǎng)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化或使這些動物產(chǎn)生腫瘤。 第29頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.2.7 腺病毒作為基因治療的載體 腺病毒用作基因治療載體和疫苗研制有著廣闊的前景。腺病毒基因組的E1區(qū)和E3區(qū)可以作為外

12、源基因的插入?yún)^(qū)。E1區(qū)缺失的腺病毒可克隆約4.7 kb的外源DNA，而E3區(qū)缺失的腺病毒可以克隆約8 kb的外源DNA，一些特定的腺病毒株已被用于人類疫苗的研制。 第30頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五腺病毒作為基因治療載體有著以下幾方面的優(yōu)點：(1)腺病毒基因組研究的比較清楚，便于進行遺傳操作。(2)其感染一般不引起明顯的癥狀，與宿主染色體整合的機率很低，作為基因治療的載體比較安全。 第31頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五(3)可以感染不同類型細胞，易于進行體外培養(yǎng)，病毒感染細胞滴度高，可在細胞內(nèi)有效復(fù)制。(4)腺病毒感染細胞后可以高水平的表達

13、蛋白，在感染后期，宿主基因表達被關(guān)閉，易于高水平表達外源基因。 第32頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.3 RNA病毒的分子生物學(xué) RNA病毒基因組均呈線狀，有單雙鏈之分，有單一分子，也有的基因組是分段的。RNA的二級結(jié)構(gòu)對病毒基因表達調(diào)控有重要影響。 第33頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五下面介紹一種典型的RNA病毒，黃病毒科丙型肝炎病毒屬的成員丙型肝炎病毒(HCV)。 第34頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.3.1 HCV的發(fā)現(xiàn) 丙型肝炎病毒HCV(hepatitis C virus) 是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對病

14、毒進行研究的成功實例。 第35頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.3.2 HCV基因組的結(jié)構(gòu)與功能 HCV是有外膜的單正鏈RNA病毒，基因組長約l0000 nt。HCV僅有一個幾乎為全基因組長度的翻譯可讀框ORF，編碼30103033個AA的多聚蛋白，經(jīng)過蛋白酶加工，切割成結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白。許多黑猩猩和人類HCV毒株已被完全測序。 第36頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.3.3 HCV基因組的復(fù)制 第37頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.4 反轉(zhuǎn)錄病毒的分子生物學(xué)反轉(zhuǎn)錄病毒基因組是線形正鏈RNA, 正鏈RNA沒

15、有mRNA活性，需要在自身的反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將正鏈RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，通過向宿主細胞基因組的整合，在宿主細胞RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄出mRNA。 第38頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五人類免疫缺陷病毒(HIV)是最典型也是最重要的反轉(zhuǎn)錄病毒。以下簡要介紹HIV的分子生物學(xué)。 第39頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.4.1 艾滋病與HIV 艾滋病是一種導(dǎo)致以全身免疫系統(tǒng)嚴重損害為特征的傳染性疾病，人類免疫缺陷病毒(HIV)是其病原體，感染者終生攜帶病毒，目前缺乏有效的治療手段。 第40頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星

16、期五12.4.2 病毒的結(jié)構(gòu)與生活周期 HIV顆粒呈球形，直徑約110 nm, HIV顆?？煞譃榘ぁ⒁職ず筒《竞诵娜糠?。核心內(nèi)部是兩個長度為9.2kb的單股正鏈RNA，核心外側(cè)為脂質(zhì)雙層組成的外膜，膜上有穿膜蛋白gp41和外膜蛋白gpl20。 第41頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五HIV的生活周期包括以下階段：吸附，侵入和脫殼，反轉(zhuǎn)錄，整合，病毒RNA和蛋白質(zhì)的合成，裝配，釋放，成熟。 第42頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.4.3 病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能 人免疫缺陷病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，分HIV-1型和HIV-2型。 第43頁，

17、共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五HIV基因組兩個相同的正鏈RNA每條鏈均包含了HIV結(jié)構(gòu)與功能所需的遺傳信息，兩條RNA單鏈被核衣殼蛋白所包裹，并通過其5端非共價結(jié)合，形成二聚體。 第44頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五在HIV基因組RNA的5端具有帽子結(jié)構(gòu)，3端有poly(A)尾巴，在反轉(zhuǎn)錄并整合后所形成的前病毒cDNA的兩端，為長末端重復(fù)序列(LTR)。LTR具有啟動子和增強子的雙重功能。第45頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五HIV基因組長約9.2 kb。能編碼至少17種蛋白質(zhì)，除具有與其他反轉(zhuǎn)錄病毒相似的gag、pot和

18、env基因外，還可編碼多種調(diào)節(jié)蛋白，因此HIV又被稱為復(fù)雜性反轉(zhuǎn)錄病毒。這些基因的排列十分緊湊，部分區(qū)域有重疊，除少數(shù)為斷裂基因外，多數(shù)基因是連續(xù)的。 第46頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五在HIV基因組中，有三個編碼結(jié)構(gòu)蛋白和酶的基因，分別稱為gag、pol和env，其中g(shù)ag與pol使用不同的閱讀框架，并有部分重疊。此外，還包括6個編碼調(diào)節(jié)蛋白的基因。 第47頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.4.4 HIV基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié) 在宿主體內(nèi)，病毒基因的表達及調(diào)節(jié)是病毒與細胞相互作用的集中體現(xiàn)。與那些簡單的反轉(zhuǎn)錄病毒相比，HIV具有更完善的表達調(diào)控

19、系統(tǒng)。第48頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五一方面可以直接利用宿主細胞的調(diào)節(jié)機制，另一方面又能編碼自身的調(diào)節(jié)蛋白。宿主細胞轉(zhuǎn)錄因子和病毒調(diào)節(jié)蛋白在病毒RNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯和翻譯后修飾等各個環(huán)節(jié)中都能發(fā)揮重要的作用。第49頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五而宿主以及與HIV共感染的其他病毒，也能借助于細胞因子和病毒基因產(chǎn)物來調(diào)節(jié)病毒基因的表達。由此形成了錯綜復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，可以精細地調(diào)節(jié)病毒基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的啟動、關(guān)閉及其速率，按照既定程序完成病毒復(fù)制的過程。第50頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五與真核細胞基因表達過程相對應(yīng)的是，HIV基因表達的調(diào)節(jié)表現(xiàn)為多級調(diào)控系統(tǒng)，存在著多個調(diào)控點，可大體劃分為轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)、翻譯水平調(diào)節(jié)和翻譯后水平的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，是HIV調(diào)節(jié)基因表達的主要環(huán)節(jié)。 第51頁，共56頁，2022年，5月20日，8點41分，星期五12.4.5 病毒基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控 HIV mRNA的加工和轉(zhuǎn)運是在病毒基因產(chǎn)物和細胞調(diào)節(jié)因子的協(xié)同作用下