廣西部分地區(qū)野生茶樹遺傳關(guān)系EST-SSR標(biāo)記分析

1、廣西部分地區(qū)野生茶樹遺傳關(guān)系EST-SSR標(biāo)記分析黃壽輝溫立香彭靜茹張芬秀菊等，2006）,常年水熱資源豐富，自然條件優(yōu)越，孕育著豐富的野生、半 野生茶樹種質(zhì)資源。經(jīng)過長期自然逗擇和自身進(jìn)化，廣西各地野生茶樹資源在 表型、農(nóng)藝性狀、內(nèi)含物含量上具有豐富的差異性（覃秀菊等，2006；彭靖茹 等，2019）。但對于廣西野生茶樹種質(zhì)資源的研究多數(shù)僅限于調(diào)查、收集和簡 單分布地理位置和形態(tài)的描述，對于其遺傳特性的研究鮮見報(bào)道。用于茶樹種質(zhì)資源遺傳分析與評價(jià)的方法主要有形態(tài)學(xué)標(biāo)記法、生化標(biāo)記法和 DNA分子標(biāo)記法三種，由于形態(tài)學(xué)標(biāo)記法過多依賴鑒定者的經(jīng)驗(yàn)，且鑒定結(jié)果 易受生產(chǎn)方式和環(huán)境影響（劉本英，20

2、09）,故其鑒定的可靠程度不高。生化 標(biāo)記法由于受限于蛋白質(zhì)種類偏少，因此其檢測位點(diǎn)較少，多態(tài)性不夠豐富， 不能有效區(qū)分親緣關(guān)系非常密切的茶樹資源（喬婷婷，2010）。DNA分子標(biāo)記 直接反映基因組DNA水平遺傳變異，多態(tài)性豐富、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，且不 隨發(fā)育時(shí)期而變化，不受環(huán)境影響，鑒于此，DNA分了標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用 在包括茶樹在內(nèi)的各類作物種質(zhì)資源遺傳分析和鑒定上（姚明哲，2009）。目 前，應(yīng)用于茶樹遺傳分析的分子標(biāo)記主要有RAPD、AFLP、ISSR和EST-SSR標(biāo)記（王麗鴛等，2004；姚明哲和陳亮，2003；粱慧玲和梁月榮，2003）,其中EST- SSR相對其他標(biāo)記具有等

3、位點(diǎn)多、共顯性、重復(fù)性好、多態(tài)性高、數(shù)量豐富等 優(yōu)勢（Powell et al. , 1996）,且可直接從EST數(shù)據(jù)庫中篩選獲得SSR,開 發(fā)成本相對較低（Varshney et al. , 2005）,另外EST-SSR序列為基因組的 表達(dá)序列，其差異性直接反映出基因表達(dá)的差異（Saha et al. , 2005； Gao et al. , 2004） o EST-SSR應(yīng)用于茶樹遺傳分析屢見報(bào)道：如金基強(qiáng)等（2007）首次基于EST-SSR引物對浙江、福建等地的優(yōu)良茶樹品種資源進(jìn)行了 分析，結(jié)果充分說明EST-SSR標(biāo)記可有效分析茶樹種質(zhì)資源，能真實(shí)反映不同 品種間的遺傳差異；劉振等(

4、2008)利用EST-SSR標(biāo)記對60份中國西南茶區(qū)的 茶樹資源進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，研究結(jié)果表明EST-SSR標(biāo)記非常 適用于茶樹遺傳多樣性和親緣關(guān)系的研究，同時(shí)結(jié)果也顯示我國西南茶區(qū)的茶 樹種質(zhì)資源多樣性非常豐富，值得深入開發(fā)研究。姚明哲等(2009)通過EST- SSR標(biāo)記對45份江北茶區(qū)的茶樹初級核心種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析， 提出可進(jìn)一步對初級核心種質(zhì)進(jìn)行篩選，選擇更有遺傳代表性的資源，構(gòu)建江 北茶區(qū)的核心種質(zhì)，從而提高江北茶區(qū)優(yōu)異資源發(fā)掘和利用的效率。陳熙等(2016)基于EST-SSR分子標(biāo)記對陜西茶樹資源遺傳多樣性進(jìn)行分析，指出陜 西茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性處于較

5、高水平，從群體種選育良種是可行的。利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)開展廣西野生茶樹資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析， 可充分認(rèn)識廣西野生茶樹種質(zhì)資源的遺傳特性，對廣西茶樹資源的分子鑒定、 品種遺傳改良、種質(zhì)保護(hù)、核心種質(zhì)的構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀基因定位以及分子 標(biāo)記輔助育種都具有重要的參考價(jià)值和理論指導(dǎo)意義。該研究利用EST-SSR技 術(shù)對廣西部分野生茶樹資源進(jìn)行遺傳特性研究，旨在揭示廣西野生茶樹種質(zhì)資 源的遺傳基礎(chǔ)，為今后核心種質(zhì)資源收集利用提供理論支撐。1材料與方法1. 1材料供試的31份茶樹種質(zhì)資源(表1) , 14份取自分布在廣西金秀、寧明、六堡鎮(zhèn) 的野生茶，另外17份為國家級優(yōu)良品種。于2018年春

6、季采摘一芽二葉新梢， 液氮迅速冷凍，然后置于-70七冰箱中保存?zhèn)溆谩? DNA提取 采用改進(jìn)的CTAB法(陳盛相，2009)提取茶葉DNA,使用分光光度計(jì)和1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量和濃度。然后稀釋DNA原液至50 ng - uL-1,于- 20。保存?zhèn)溆?。EST-SSR 標(biāo)記參照姚明哲(2009)報(bào)道的EST-SSR標(biāo)記，經(jīng)過材料篩選，選出15對多態(tài)性 高、帶型清晰的引物，引物信息如表2所示，委托華大基因科技有限公司合 成。PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測按(表3)配制EST-SSR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增各個(gè)循環(huán)參數(shù)：先 94寸預(yù)變性5 min, 94 (變性1 min,對應(yīng)溫度

7、退火30 s (各引物退火溫度 見表2) , 72 延伸2 min, 35個(gè)循環(huán)；然后72 延伸5 min, 4 保存。參 照黃壽輝(2013)方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠檢測、銀染顯色和拍照記 錄。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析每對SSR引物檢測一個(gè)位點(diǎn)，每條多態(tài)性條帶視為一個(gè)等位變異，采用人工讀 帶方法，將電泳圖上清晰的條帶記為“1”，同一位置無帶或不易分辨的弱帶計(jì) 為“0”，建立“0-1”原始數(shù)據(jù)矩陣。使用軟件Popgene32 (Yeh et al., 1999)統(tǒng)計(jì)每個(gè)引物在31份材料中擴(kuò)增的等位基因數(shù)(Na),觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He) , Shannon信息指數(shù)(I)。根據(jù)公式P

8、IC=1-(Pi) 2計(jì)算每個(gè)引物的多態(tài)性信息量(PIC),其中Pi是帶有第i個(gè)等位基 因群體的比例。根據(jù)公式DICE=2a/ (2a+b+c)計(jì)算品種間的DICE遺傳相似性 系數(shù)，其中a為品種i與品種j共有帶型數(shù)目，b為品種i特有帶型數(shù)目，c為 品種j特有帶型數(shù)目。用NTSYS-pc2. 1 (Rohlf, 2000)軟件進(jìn)行品種間多態(tài)性 和相似系數(shù)分析，通過非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPUMA)進(jìn)行聚類分析，建立親 緣關(guān)系樹狀圖。結(jié)合供試材料的形態(tài)學(xué)特征，對聚類分析結(jié)果進(jìn)行分析討論。2結(jié)果與分析1 EST-SSR擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性分析利用15對EST-SSR引物對31份實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行多態(tài)性檢測，部

9、分引物擴(kuò)增結(jié)果 見圖1。如表4所示，共檢測到68個(gè)等位位點(diǎn)。擴(kuò)出等位位點(diǎn)數(shù)最多的引物為 T395和T588,分別可以擴(kuò)出6個(gè)等位位點(diǎn)，其次是T6、T8、T185、T685、 T802、T1110,均可擴(kuò)出 5 個(gè)，T12、T21、T228、T641、T687 可擴(kuò)出 4 個(gè)， T663、TH3為3個(gè)，T13擴(kuò)出的等位位點(diǎn)最少，為2個(gè)，平均每個(gè)引物可擴(kuò)出 的等位位點(diǎn)數(shù)為4. 47個(gè)。在擴(kuò)增到的68個(gè)等位基因中有14個(gè)特異等位基因， 主要分布在寧明2號、寧明4號、六堡1號和金秀5號中，表明這幾個(gè)種質(zhì)在 某些位點(diǎn)與其他種質(zhì)有著很大差異，是研究等位基因功能差異的良好材料。對 于整個(gè)群體而言，群體的觀測

10、雜合度(Ho)變化范圍為0.18 (T113)0.63(T1110),平均為0.42；期望雜合度(He)的變化范圍為0.23 (T113)0. 74 (T588), 平均為0.55。Shannon信息指數(shù)(I)變幅在O 351. 53之間,平均0.97。多 態(tài)性信息含量(PIC值)是衡量引物擴(kuò)增位點(diǎn)多態(tài)性的重要指標(biāo)。當(dāng)PIC0.5 時(shí)，表明擴(kuò)增位點(diǎn)具高度多態(tài)性，0.25P明0.5時(shí),為中度多態(tài)性，PICem)plasm nameOriginG*m)plasni nameOrigin寧明1號廣西寧明縣桂香18號廣西桂林ingming 1Ningining, GuangxiGuixiang 18G

11、uilin, Guangxi寧明2號廣西寧明縣云南大葉種云南劫庫iiig!iiing 2iiiginiiig, (hiangxiYuiiiiaiilaazli)iigMlia!i, l ujian紫鵑云南劫海Zijuan1*nghai. YunnanLIU BY, WANG LY, ZHOU J, et al. , 2008. Fingerprinting construction and genetic diversity analysis of Yunnan Dayezhong tea germplasm resources by ISSR markers J. J Plant Gene

12、Resour,： 458-464.劉本英，王麗鴛，周健，等，2008.云南大葉種茶樹 種質(zhì)資源ISSR指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析J.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，： 458-464.LIU Z, WANG XC, ZHAO LP, et al. , 2008. Genetic diversity and relationship analysis of tea germplasms originated from southwestern China based on EST-SSR J. Mol Plant Breed, 6(1)： 100-110.劉 振，王新超，趙麗萍，等，2008.基于EST-S

13、SR的西南茶區(qū)茶樹資源遺傳 多樣性和親緣關(guān)系分析J.分子植物育種，6 (1) ： 100-110.PENG JR, LI CC, TAN YW, et al. , 2019. Clustering analysis for wild ancient tea germplasm resources in Debao County and Longlin County, Guangxi based on SSR molecular markers J. J Southern Agric, 50 (1) ： 1-7.彭靖茹，李朝昌，檀業(yè)維，等，2019.基于SSR 分子標(biāo)記的廣西德?？h和隆林縣野生古

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21、 of China revealed by EST-SSR markers J. Acta Agric Boreal-Sin, (28) ： 91-96.周萌， 李友勇， 繇雪梅，等，2013.基于EST-SSR標(biāo)記的云南大茶樹遺傳多樣性分析J. 華北農(nóng)學(xué)報(bào),(28) ： 91-96.一全文完一摘要：為了明確廣西野生茶樹種質(zhì)資源的遺傳背景，該研究從廣西的寧明縣、 金秀縣、蒼梧縣收集到14份地方野生茶樹種質(zhì)資源，以17個(gè)國家級茶樹良種 作為參照，采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)，探討了廣西這三個(gè)地方野生茶樹與國 家級茶樹良種間的親緣關(guān)系以及廣西地方茶樹自身的遺傳多樣性。結(jié)果表明： 15對EST-S

22、SR引物共檢測到68個(gè)等位基因，平均每個(gè)引物可擴(kuò)增出4. 53個(gè)， 其中多態(tài)性位點(diǎn)為60個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)88. 2%。平均觀測雜合度、平均期望雜 合度、平均Shannon信息指數(shù)分別為0.42、0.55和0.97。PIC值在0. 23 0.74之間，平均為0.52,多態(tài)性較好。遺傳相似系數(shù)在0.530.9之平均 值為0.71, 31份供試材料在遺傳相似系數(shù)為0.71分為5組群，76%參照品種聚 在A組群，而廣西本地的野生茶樹資源則主要分布在B、C、D、E組群。利用該 研究中的4對核心引物即可將31份供試材料全部區(qū)分開，挑選其中10個(gè)多態(tài) 性較好的等位位點(diǎn)進(jìn)行編碼，構(gòu)建31份供試種質(zhì)的DNA分子

23、指紋圖譜。這表明 廣西野生茶樹資源與國家級茶樹良種間遺傳差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、遺傳基 礎(chǔ)寬、多樣性非常豐富，可作為茶樹育種的親本或開展茶樹功能基因研究的材 料。Key：野生茶樹，種質(zhì)資源，EST-SSR,遺傳多樣性，DNA分子指紋圖譜， 廣西：Q941, S571.1：A：1000-3142 (2019) 06-0821-10Abstract： In order to clarify the genetic background of wild tea tree germplasm resources in Guangxi, fourteen local wild tea tree germ

24、plasm resources were collected from Ningming County, Jinxiu County and Cangwu County, Guangxi. Taking seventeen state-level tea cultivars as reference, and adopting EST-SSR molecular marker technology, the research focused on the genetic relationship between these wild tea trees and the state-level

25、tea cultivars in three places of Guangxi and the genetic diversity of local tea trees in Guangxi. The experiment results showed that a total of 68 alleles were detected in fifteen pairs of SSR primers, and each primer could amplify 4. 53 by average, of which polymorphic site were 60, and the polymor

26、phic ratio was 88. 2%. The average observed heterozygosity, average expected heterozygosity, and average Shannon information index were 0. 42, 0. 55, and 0. 97 respectively. The PIC value was between 0. 23-0. 74 with an average of 0. 52, and the polymorphism was good. The genetic similarity coefficient was between 0. 53 and 0. 9, with an average value of 0.71. The test materials were divided into five groups at genetic similarity coefficient of 0. 71, among which 76% reference warietics were clustered in Group A, while the local wild tea tree resources in Gua