黃芩莖葉總黃酮對原代培養(yǎng)大鼠肝細胞損傷的保護作用

1、黃芩莖葉總黃酮對原代培養(yǎng)大鼠肝細胞損傷的保護作用【關鍵詞】黃芩莖葉總黃酮；,肝細胞；,原代培養(yǎng)；,保護作用；,機制摘要：目的研究黃芩莖葉總黃酮SSTF對原代培養(yǎng)大鼠肝細胞氧化損傷的保護作用及其機理。方法采用胰蛋白酶消化、別離大鼠肝細胞進展原代培養(yǎng)，用H22和l4體外誘導肝細胞損傷，同時加以不同濃度的SSTF對肝細胞保護，檢測培養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉移酶ALT活性、肝細胞內丙二醛DA含量和谷胱甘肽過氧化物酶GSHpx活性，TT法測定肝細胞增殖活性。結果與模型組比擬，SSTF明顯抑制H22和l4引起的肝細胞培養(yǎng)液中ALT活性的升高，肝細胞存活率明顯升高，還可明顯恢復H22引起的肝細胞DA含量的升高和G

2、SHpx活性的降低明顯。結論SSTF對培養(yǎng)大鼠肝細胞損傷有明顯的保護作用，其機制可能與其抗脂質氧化作用有關。關鍵詞：黃芩莖葉總黃酮；肝細胞；原代培養(yǎng)；保護作用；機制StudynthePrtetiveEffetandPssibleehanisfSutellariabaialensisSte-leafTtalFlavnidnPriaryulturedRatHepatytesInjuredbyH22rl4Abstrat：bjetiveTstudytheprtetiveeffetandpssibleehanisfSutellariabaialensisste-leafttalflavnid(SSTF)

3、npriaryrathepatyesinjuredbyH22rl4.ethdsPriaryhepatytesereislated,ulturedbytrypsindigestinandinduedbyH22rl4.VariusnentratinsfSSTFereaddedtthepriaryulturedhepatytes.Thententsfalndialdehyde(DA)andativityfglutathinperxidase(GSH-px)inhepatytesandtheativityfALTinulturalsupernatanteredeterinedbygeneralethd

4、s,theviabilitiesfhepatytesereeasuredbyTT.Resultsparedithdelgrup,SSTFuldrestrerearkablyALTlevelinsuperatantfulturalhepatytes,dereaseDAntentandelevateGSHpxativityfhepatytes,hepatyteviabilitiesinreasedsignifiantlybySSTF.nlusinSSTFhasaprtetiveatinnpriaryrathepatyesinjuredbyH22rl4.Theseightbeassiatedithi

5、tsantilipperxidatinfuntin.Keyrds：SSTF;Hepatytes;Priaryultured;Prtetiveeffet;ehanis.黃芩莖葉總黃酮Sutellariabaialensisste-leafttalflavnid，SSTF是承德醫(yī)學院中藥研究所從唇型科植物黃芩的莖葉局部提取的有效成分，整體實驗已證實SSTF具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化及保肝等作用14。為進一步研究SSTF保肝作用及其機制，本文采用胰蛋白酶消化法別離肝本質細胞進展體外培養(yǎng)，用l4和H22體外誘導肝細胞氧化損傷模型，在細胞程度上證實SSTF對肝細胞損傷的保護作用及其機制，為進一步說

6、明SSTF的藥理作用及中藥新藥的研發(fā)和應用提供可靠根據(jù)。1材料與方法1.1藥品與試劑SSTF含總黃酮73%：承德醫(yī)學院中藥研究所提供，臨用前以蒸餾水配制，用飽和碳酸氫鈉調pH=7.6；Hanks液高壓滅菌，4保存；0.80gL-1胰蛋白酶：用Hanks液溶解，過濾除菌，調pH7.2，分裝,-30保存；1%PVP：北京華美公司提供；根底培養(yǎng)液：RPI1640培養(yǎng)基10.0g，用超凈水900l溶解，5.6%NaH3調pH至7.2，定溶到1000l，過濾除菌，臨用前每80l，參加新生小牛血清20l，青霉素100gl-1，鏈霉素100gl-1，胰島素5gl-1；TT：SIGA公司；ALT，DA，GSH

7、-Px測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。1.2動物23d齡SD大鼠乳鼠，雌雄不限，清潔級，承德醫(yī)學院實驗動物管理中心提供。1.3儀器2培養(yǎng)箱TaibaiLNA122D日本，D100半自動生化分析儀美國Bayer公司，721微機型分光光度計上海光學儀器五廠，離心機TGL.16G上海。1.4肝細胞別離培養(yǎng)5取新生SD大鼠10只，75%酒精中浸洗后斷頭處死，無菌別離肝臟，迅速置Hanks液中，用Hanks沖洗數(shù)次除去血污，剝除被膜和纖維成分，將肝臟剪成111左右的組織塊，參加0.80gL-1胰蛋白酶和1%PVP，37消化58in，參加數(shù)滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細胞懸液，經(jīng)200尼龍篩網(wǎng)過濾后

8、用培養(yǎng)液洗3次，1800r/in離心5in，搜集肝細胞并計數(shù)，按1109個L-1，接種于鋪有多聚賴氨酸的24孔和96孔板中，37，5%2條件下培養(yǎng)，4h首次換液去除血細胞，以后每24h換液1次。1.5SSTF對H22誘導肝細胞損傷的影響取上述原代培養(yǎng)48h肝細胞，設H22損傷模型組、SSTF(50gL-1，100gL-1，200gL-1)3個劑量保護組、正常對照組，每組設8個復孔。模型組和保護組參加H220.5lL-1，同時保護組參加不同濃度的SSTF，正常對照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，搜集24孔板中培養(yǎng)上清液檢測ALT活性，搜集肝細胞測定DA含量和GSH-PX活性，TT比色法測定9

9、6孔板中肝細胞的存活率。1.6SSTF對l4誘導肝細胞損傷的影響設l4損傷模型組、SSTF(50，100，200gL-1)3個劑量保護組、正常對照組，每組設8個復孔。肝細胞培養(yǎng)24h后換液，模型組和SSTF組參加l4(二甲基亞楓配制)，終濃度為10lL-1，同時SSTF組參加不同濃度的SSTF，正常對照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6h，搜集24孔板中培養(yǎng)上清液檢測ALT活性，TT比色法測定96孔板中肝細胞的存活率。1.7統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以(s)表示，用SPSS計算機軟件進展統(tǒng)計學分析,組間比擬采用t檢驗，P0.05有統(tǒng)計學意義。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.2結果2.1SSTF對損傷肝細胞的影響H22

10、作用肝細胞4h后，模型組肝細胞損傷明顯，大量細胞壞死，肝細胞活性明顯下降，培養(yǎng)上清液內ALT釋放量明顯升高，肝細胞內DA含量明顯升高，GSH-Px活性明顯降低；而參加SSTF保護后，各保護組ALT活性明顯降低，DA含量明顯降低，GSH-Px活性明顯升高。并且SSTF在劑量范圍內與模型組比擬肝細胞活性顯著進步，且劑量越高，細胞存活率越高，存在明顯的劑量依賴性。說明SSTF可以保護肝細胞、穩(wěn)定肝細胞膜的構造和功能。并且具有明顯的去除自由基抗脂質過氧化作用。表1SSTF對H22損傷肝細胞的影響略與對照組比擬*P0.01，與模型組比#P0.05，#P0.01；n=62.2SSTF對l4損傷肝細胞的影響

11、原代培養(yǎng)肝細胞與l4作用6h后，可使培養(yǎng)上清液內ALT釋放量明顯升高，肝細胞存活率明顯下降；而SSTF各保護組，ALT活性明顯降低，肝細胞活性明顯升高，說明SSTF對l4肝細胞損傷有明顯保護作用。表2SSTF對l4損傷肝細胞的影響略與對照組比擬*P0.01,與模型組比#P0.05，#P0.01；n=63討論在多種因素(藥物、毒物、乙醇等)引起的肝細胞損傷中，氧化應激是它們的共同損傷機制6。肝細胞受到氧化損傷時，自由基及其過氧化反響產(chǎn)物破壞細胞膜和細胞構造，導致細胞腫脹壞死,并可使細胞內去除自由基酶SD，SH-Px的活性下降，導致其去除自由基才能下降，使肝細胞損傷進一步加重，膜通透性升高，肝細胞

12、內ALT，ST等酶外逸，細胞腫脹死亡7。H22是一種重要的活性氧，極易通過細胞膜與細胞內鐵離子反響形成高活性H損傷肝細胞，l4在肝細胞內代謝也可產(chǎn)生為具有高度反響活性的l3，l3等自由基引起肝細胞損傷8。據(jù)此，我們采用原代培養(yǎng)大鼠肝細胞，以H22和l4體外誘導肝細胞氧化損傷模型，選擇培養(yǎng)上清液中ALT活性、肝細胞DA含量和GSH-Px活性作為判斷肝細胞損傷和SSTF保護作用的檢測指標。本研究結果顯示，H22和l4損傷肝細胞后，均可使培養(yǎng)上清液中ALT活性明顯升高，細胞存活率明顯下降，而給予SSTF保護后，培養(yǎng)上清液中AST活性可明顯降低，肝細胞活性明顯進步。說明SSTF對肝細胞氧化損傷有明顯的

13、保護作用；研究說明，黃酮類化合物具有很強的除自由基和抑制脂質過氧化特性9，SSTF是含有多個羥基的黃酮類化合物，具有較強的抗氧化作用2。本研究結果進一步顯示，SSTF能明顯抑制H22損傷肝細胞內DA含量的升高和GSH-Px活性的降低，說明SSTF之所以對肝細胞氧化損傷有一定的保護作用，其機制可能是：SSTF通過進步去除自由基酶的活性，拮抗自由基引起脂質過氧化反響,保護了肝細胞構造和功能的完好性，防止肝細胞遭受各種氧化損傷。參考文獻：1周曉霞，李素婷，周曉慧，等.黃芩莖葉總黃酮抗炎作用的實驗研究J.中國中醫(yī)藥信息雜志，2000，74：27.2李素婷，王海林，楊鶴梅,等.黃芩莖葉總黃酮對腦缺血的保

14、護作用J.中國中醫(yī)根底醫(yī)學雜志,2001，71：35.3佟繼銘，劉玉玲，周崇坦，等.黃芩莖葉總黃酮對家兔實驗性動脈粥樣硬化的預防作用J.中草藥,2022,36(1)：93.4李素婷，楊鶴梅，石艷華，等.黃芩莖葉總黃酮保肝作用的實驗研究J.中國中醫(yī)藥信息雜志，2022，117：593.5那廣水，于洪儒，王洪新，等.一種小鼠原代肝細胞培養(yǎng)方法J.錦州醫(yī)學院學報，2022，243：22.6TribbleDL,ATY,JnesDP.ThepathphysilgialsigifianeflipidperxidatininxidativeellinjuryJ.Hepatlgy,1987，7：377.7KalfFG,PastGB,Snyde