循環(huán)腫瘤細胞檢測原理及其應用

1、循環(huán)腫瘤細胞的檢測原理及其應用知行合一、經(jīng)世致用Central South University01循環(huán)腫瘤細胞檢測的背景與意義Background and significance of the topic02循環(huán)腫瘤細胞富集原理及方法Principle and method of circulating tumor cell enrichment03循環(huán)腫瘤細胞鑒定原理及方法Principle and method of identification of circulating tumor cells04CellSearch系統(tǒng)在循環(huán)腫瘤細胞檢測中的應用Contents.目錄自強不息 厚

2、德載物Tsinghua University of China01循環(huán)腫瘤細胞檢測的背景與意義Background and significance of the CTCs知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityThomasAshworth在癌癥患者血液中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細胞體積和形態(tài)相似的細胞。他推測，這些細胞在癌癥轉移過程中發(fā)揮了非常重要的作用，但由于當時技術的限制，對這一現(xiàn)象的研究未能深入CTCs的首次發(fā)現(xiàn)2005年，Pachm anm將CTCs正式定義為自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。最終定義循環(huán)腫瘤細胞的發(fā)展（Circulatin

3、gTumorCells，CTCs）01自強不息 厚德載物Central South University惡性腫瘤遠處轉移是臨床上實體惡性腫瘤治療失敗或復發(fā)的主要原因之一該學說認為腫瘤轉移的發(fā)生和發(fā)展，是處于活躍或活化狀態(tài)的腫瘤細胞作為“種子”，當遇到適合的器官、組織的基質環(huán)境，即“土壤”時，就會在此定居、生長即發(fā)生腫瘤的轉移，從而部分解釋了腫瘤原發(fā)灶與轉移灶之間的關系種子和土壤學說循環(huán)腫瘤細胞的存在正是實體惡性腫瘤遠處轉移的根源02循環(huán)腫瘤細胞CTC癌細胞從原位脫離 侵犯血液循環(huán)，在循環(huán)中存活 滲出進入遠端器官 在繼發(fā)部位增殖研究意義：深入研究CTCs有助于對腫瘤轉移機制進一步了解，為抗腫瘤轉

4、移的治療提供新的依據(jù)；CTCs的檢測有助于早期轉移腫瘤患者的診斷、監(jiān)測術后患者腫瘤的復發(fā)與轉移；有助于評估抗腫瘤藥物的敏感性與患者預后以及選擇個體化的治療策略；。01循環(huán)腫瘤細胞檢測難點02循環(huán)腫瘤細胞檢測難點異質性 細胞表面抗原標志物表達差異攜帶不同的分子信息轉移潛力差異03不同形態(tài)：單細胞CTC細胞團CTM血小板包裹的CTC不同表型：上皮細胞表型間質細胞表型（經(jīng)歷EMT)混合表型*將惡性腫瘤細胞與紅細胞、白細胞、正常上皮細胞等區(qū)分開來。CTCs的鑒定：如何鑒定所獲取的細胞為CTCs?*從紅細胞和白細胞中富集惡性腫瘤細胞CTC的富集：如何獲取CTCs?04循環(huán)腫瘤細胞檢測自強不息 厚德載物T

5、singhua University of China02循環(huán)腫瘤細胞富集原理及方法Principle and method of circulating tumor cell enrichment自強不息 厚德載物05循環(huán)腫瘤細胞富集目前對于CTCs的富集主要根據(jù)：物理特性（密度和體積）分子生物學特性（免疫磁性和浸潤能力）自強不息 厚德載物06基于物理性質的分離捕獲方法一、基于腫瘤細胞大小及機械性能分離原理：主要依賴于CTCs (1530m) 相對于血細胞 (811m) 有較大的體積因此, 多種微孔濾膜、尺寸/形變依賴的微流控芯片裝置的方法得到了廣泛研究09基于物理性質的分離捕獲方法二、基于

6、細胞密度離心分離原理：基于血液中各種正常細胞與CTCs密度的差別，利用其在密度梯度介質（如Ficoll-Paque介質）中的沉降系數(shù)不同，將細胞懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力的作用，用分離液將CTCs與其它細胞層分離梯度分布：血漿成分單個核細胞（淋巴細胞、單核細胞、腫瘤細胞等）分離液中性粒細胞和最下層的紅細胞自強不息 厚德載物09基于物理性質的分離捕獲方法OncoQuick系統(tǒng)使用一種專用的50 mL試管，內置多孔屏障，其下為密度梯度分離液，使用時將標本置于屏障之上，從而避免在離心之前與分離液混合而污染優(yōu)點：操作簡便、成本低不足之處：一般要求血量較大，15-30ml；缺乏特異性,

7、靈敏度也較低；CTCs遷移可能至血漿層、紅細胞層和粒細胞；操作過程中易導致缺乏相應密度的腫瘤細胞丟失自強不息 厚德載物10基于物理性質的分離捕獲方法三、基于細胞電學性能分離原理：細胞可被看作是一種電中性的但是可以被極化的電介質粒子。因此, 當細胞處于電場中時, 將產生電偶極矩，電偶極矩的大小和方向主要依賴于細胞的介電性能。不同的細胞具有不同的介電性能，這成為分離腫瘤細胞的依據(jù)在實際應用中, 當不同的細胞處于電場中時, 他們將受到不同的電場力。因此, 腫瘤細胞可以通過電旋轉 (Electrorotation) 或者雙向電泳 (Dielectrophoresis, DEP) 的方法得到分離富集優(yōu)點

8、：血液中捕獲腫瘤細胞的效率達到70%；無標記，細胞保存良好活性不足之處：細胞的介電性能會逐漸變化，必須在較短的時間內完成；承載介質的電導率必須適當?shù)目刂圃谝粋€較低的范圍02基于分子生物學特性的分離捕獲方法免疫磁珠分離：最常見且有效地檢測捕獲脫落腫瘤細胞的方法陽性富集捕獲腫瘤細胞負性篩選去除非腫瘤細胞（如白細胞、紅細胞）腫瘤細胞表面特異性抗原標志物的表達抗原-抗體特異性結合，理論上可以同時實現(xiàn)對腫瘤細胞捕獲和檢測。自強不息 厚德載物02免疫磁性分離自強不息 厚德載物原理：CTCs具有某些特殊的生物標志物，包括上皮細胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，E

9、pCAM）、細胞角蛋白（Cytokeratin，CK）以及腫瘤特異性抗原因此利用腫瘤細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結合，繼而在外加磁場中與磁珠吸附的細胞滯留在磁場中或定向移動到指定區(qū)域從而使腫瘤細胞得以從血液中分離出來自強不息 厚德載物02免疫磁性分離CellsearchTM系統(tǒng)/CTC芯片（CTC-chip）芯片的表層分布了78 000個包被抗EpCAM抗體的微柱點血液樣本流經(jīng)芯片時，抗體與腫瘤細胞結合粘附在芯片上自強不息 厚德載物02免疫磁性分離優(yōu)點：方便、有效；可獲取較高純度的腫瘤細胞；富集到具有完整的細胞形態(tài)不足之處：單克隆抗體昂貴；尚無具有普適性的腫瘤細胞表面抗原；敏

10、感性一定程度上受到CTCs表面抗原表達的制約；CTCs經(jīng)歷上皮間質化過程(EMT)中，丟失EpCAM這些特異性的分子03循環(huán)腫瘤細胞鑒定原理及方法Principle and method of identification of circulating tumor cells自強不息 厚德載物自強不息 厚德載物Tsinghua University of China02CTCs的鑒定自強不息 厚德載物如何鑒定所獲取的細胞為CTCs?免疫細胞化學技術（ICC）逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）流式細胞術（FCM）定量聚合酶鏈反應（qPCR）自強不息 厚德載物Tsinghua University

11、of China02免疫細胞化學技術（ICC）自強不息 厚德載物原理是以顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和細胞化學呈色反應，對相應抗原進行定位、定性和定量的技術。目前選擇的循環(huán)腫瘤細胞的相關抗原包括EpCAM、上皮角質蛋白（CKs）、上皮細胞膜特異性抗原、腫瘤相關糖蛋白（TAG）或特異性標志物（如HER2、抗乳球蛋白等） CTC的免疫熒光染色特性：EpCAM CK DAPI CD45 白細胞的免疫熒光染色特性：EpCAM CK DAPI CD45優(yōu)點：在于腫瘤細胞膜未被破壞，可以進行細胞大小和形態(tài)學分析不足之處：腫瘤細胞表面抗原表達的不均一性，在一定程度上降低了檢測的敏感性

12、熒光染料熒光染料自強不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強不息 厚德載物Central South University流式細胞術（FCM）原理：根據(jù)白細胞表達CD45抗原、CK陽性CTCs表達EpCAM，采用不同熒光素標記的抗CD45和抗EpCAM，通過流式細胞術分析和分選CK陽性細胞的CTC（CD45- EpCAM+）優(yōu)點：可在檢測的同時進行細胞形態(tài)、DNA倍數(shù)分析不足之處：需要的血液樣本量大；缺乏規(guī)范的臨床操作方法；腫瘤細胞表面抗原表達的不均一性，在一定程度上降低了檢測的敏感性自強不息 厚德載物Tsinghua University of Chin

13、a02自強不息 厚德載物逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）原理：是基于組織或腫瘤特異性mRNA的表達或某些基因改變后DNA水平的異常，這些mRNA不表達于正常外周血細胞，所以在外周血中檢測到特異mRNA可以間接提示CTCs的存在。優(yōu)點：靈敏度高、可重復性好、價格低廉不足之處：mRNA不穩(wěn)定；需破壞CTCs，無法計數(shù)及形態(tài)學觀察；取樣時上皮細胞污染、腫瘤標志物在外周血的非正常表達可造成假陽性04CellSearch系統(tǒng)在循環(huán)腫瘤細胞檢測中的應用The CellSearch system and its application 自強不息 厚德載物自強不息 厚德載物02自強不息 厚德載物90年代中期

14、開始摸索捕獲、分析CTC的方法1999-2003 大量臨床實驗建立起CellSearch與CTC的臨床相關數(shù)據(jù)2004 獲得美國FDA批準用于臨床2009 Cleveland Clinic十大醫(yī)學突破第一名2009 Prix Galien USA最佳醫(yī)學技術獎2010.1 中國 CTC在復發(fā)轉移乳腺癌上的應用注冊實驗2011.5 CTC在小細胞肺癌上的應用實驗研究2012.8 獲得中國CFDA批準用于臨床1983 磁流體CellSearch CTC 檢測技術發(fā)展歷程自強不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強不息 厚德載物CellSearch檢測技術的基本

15、原理檢測外周血循環(huán)中的上皮源性的循環(huán)腫瘤細胞循環(huán)腫瘤細胞表型EpCAM+ and Cytokeratins 8, 18+, and/or 19+CD45-完整的細胞上皮源性細胞碎片也會被捕獲到，但并不會被計數(shù) 腫瘤細胞白細胞抗 EpCAM 磁珠EpCAM 抗原CD45 抗原CK 抗原抗 CD45-APC 染料抗 CK-PE 染料熒光染料EpCAM 上皮細胞粘附分子 APC 異藻藍蛋白熒光染料 CK 細胞角蛋白 PE 藻紅蛋白熒光染料DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料） 自強不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強不息 厚德載物知行合一、

16、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch系統(tǒng)概覽第一個標準化，自動化的循環(huán)腫瘤細胞捕獲計數(shù)平臺自強不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch自動樣本處理過程自強不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch自動化結果分析系統(tǒng)自動將被捕獲的、經(jīng)過染色的細胞置入MagNest 裝置的樣本盒中由于 M

17、agNest 的磁場作用，捕獲的靶細胞將移動至樣本盒的分析表面，形成單細胞層系統(tǒng)自動分析后得到結果并由操作人員進行最終判讀自強不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch檢測結果CTCs： DAPI + CK- PE+ CD45- APC-自強不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central South UniversityCellSearch CTC 檢測結果 Cutoff 值Unfavorable5 CTCs/7.5mlFavorable0-4 CTCs/7.5ml基線 CTC 檢測結果大于等于5個細胞病人預后不好，總生存期和無進展生存期較短基線 CTC 檢測結果小于5個細胞的病人預后良好，總生存期和無進展生存期較長此 Cutoff 值基于臨床研究實驗得出，并已被 FDA 和 CFDA 批準用于臨床實踐 臨床應用轉移性癌癥的監(jiān)護無進展生存期總生存期未來: 疾病管理自強不息 厚德載物Tsinghua University of China02自強不息 厚德載物知行合一、經(jīng)世致用Central