體細胞胚發(fā)生

1、體細胞胚發(fā)生1.3.2 植物體細胞胚的發(fā)生愈傷組織 體細胞胚 植株1.3.2 體細胞胚胎發(fā)生細胞培養(yǎng)再生完整的植株莖芽分化（器官分化）體細胞胚胎發(fā)生受精卵并非完成胚胎發(fā)育的必要因素。 在組織培養(yǎng)中，起源于一個非合資細胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)，叫胚狀體或體細胞胚。胚狀體的特點：（1）、它不同于合子胚，因為它不是兩性細胞 融合的產(chǎn)物；（2）、它不同于孤雌胚或孤雄胚，因為它不是 無融合生殖的產(chǎn)物；（3）、它不同于組織培養(yǎng)中通過器官發(fā)生途徑 形成的莖芽和根，因為它的形成須經(jīng)歷 與合子胚相似的發(fā)育過程，而且成熟的 胚狀體是一個雙極性結(jié)構(gòu)。一、體細胞胚胎發(fā)生的例證：1、無論補

2、加IAA與否，在含有椰子汁（10%） 的培養(yǎng)基上，石龍芮花器官個部分（包括 花藥）以及體細胞組織都能增殖形成愈傷 組織。2、在博落回中，在一定的激素濃度下，能形 成體細胞胚。3、柑桔屬植物是天然多胚現(xiàn)象（每個種子有一個以上的胚）的一個典型的例子。二、 體細胞胚胎發(fā)生的方式1、從培養(yǎng)中的器官、組織、細胞或原生質(zhì)體 直接分化成胚，中間不經(jīng)過愈傷組織階段。 如石龍芮再生植株表面長出不定胚。2、外植體先愈傷化，然后由愈傷組織細胞分化 成胚。如博落回葉肉和柑橘珠心愈傷組織。外植體的成苗途徑試管苗外植體愈傷組織根、芽芽根根 芽體細胞胚試管苗體細胞胚試管苗三、 影響體細胞胚胎發(fā)生的因子1生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 愈傷組

3、織的建立和增殖所需要的是一種含有生長素的培養(yǎng)基，通常所用的培養(yǎng)基是2，4D，濃度范圍。在此能使胚性細胞團數(shù)量不斷增加，但不出現(xiàn)成熟的胚。如果把胚性細胞團轉(zhuǎn)移到一種生長素含量很低（或完全沒有生長素的培養(yǎng)基，它們就能發(fā)育為成熟的胚。2 氮源 除生長素外，培養(yǎng)基中氮源的形態(tài)也會影響離體條件下的胚胎發(fā)生。只有當培養(yǎng)基中含有一定量的還原態(tài)氮時，才能出現(xiàn)胚胎發(fā)生過程。 在以KNO3為唯一氮源的培養(yǎng)基上建立起來的 愈傷組織，去掉生長素后不能形成胚。然而，若在 55mmol/LKNO3的培養(yǎng)基中加入少量的 (5mmol/L)NH4Cl形態(tài)的氮，胚胎發(fā)生過程就會出現(xiàn)。 還原態(tài)氮和氮化態(tài)氮最適合的比是10mmol

4、/LNH4Cl和40mmol/LKNO3 欲使胡蘿卜培養(yǎng)細胞形成體細胞胚，必須有一個最低數(shù)量的內(nèi)源NH4存在（每千克鮮重的組織約5 mmol/L）。如果內(nèi)源NH4達不到這個臨界值，細胞就不能進行胚胎分化。而要使細胞內(nèi)NH4達到這個水平，不但需要很少量的外源NH4存在（），還需要供應(yīng)相對濃度很高的NO3-(60mmol/L).3 其他因子1、高濃度的鉀（20 mmol/L ）是胚胎發(fā)生所必 需的。2、在培養(yǎng)基中溶解氮的含量應(yīng)低于一個臨界值 （），否則將有利于生根，而不利 于成胚。3、在培養(yǎng)基中加入活性炭也能提高胡蘿卜細胞 發(fā)生的頻率。4、如果外加與枸櫞胚珠所產(chǎn)生的濃度相當?shù)囊?醇，能顯著抑制胡蘿

5、卜培養(yǎng)物的胚胎發(fā)生， 而非揮發(fā)性的物質(zhì)如IAA、ABA、GA 也能 抑制其胚胎發(fā)生。四、 體細胞胚胎發(fā)生的解剖學和細胞學 在胡蘿卜懸浮培養(yǎng)中，可以看到大量球形胚自由地飄浮在培養(yǎng)液中，說明胚是起源于單個細胞。但在對胡蘿卜和石龍芮離體條件下體細胞胚胎發(fā)生的詳細研究表明，雖然胚是單細胞起源的，但在誘導期和胚胎發(fā)生早期，這些細胞與相鄰細胞之間仍然保持著胞質(zhì)聯(lián)系。胞間聯(lián)系的脫離只發(fā)的多細胞時期。 在胡蘿卜懸浮培養(yǎng)中，對愈傷組織形成和生長的解剖學和組織學研究表明，在培養(yǎng)中存在兩種類型的細胞：、自由分散在培養(yǎng)基中的大而高度液泡化的 細胞，一般不具胚胎發(fā)生能力；、成簇成團存在的體積小而細胞質(zhì)致密的細 胞，具成

6、胚能力。 能夠成胚的細胞團可稱為胚性細胞團。 在含有生長素的培養(yǎng)基中，胚性細胞團雖不能發(fā)育為成熟的胚，但它本身可通過細胞的增殖和細胞團破碎不斷延續(xù)。 胚性細胞團在破碎之前包含兩種不同類型的細胞。 處在中央的那些細胞具有一個單個大液泡，小而致密的核。 在胚性細胞團的外圍，則是成群的非常活躍的分生細胞。 由于中央細胞體積增大，彼此分離，可引起胚性細胞團解體。 然而，若把聚成小團的分生細胞或新形成的胚性細胞團篩選出來，轉(zhuǎn)移到不含生長素的培養(yǎng)基上，在它們的外層就會形成很多體細胞胚。體細胞胚的成熟過程 體細胞胚常常在原來的培養(yǎng)基上成熟和萌發(fā)。但有的物種幼齡或成熟的胚必須先經(jīng)歷一段低溫之后才能正常地長成小

7、植株。體細胞胚與合子胚的比較 體細胞胚與合子胚早期的分裂順序不完全相同。即使是合子胚本身，它們的早期胚胎發(fā)育過程也常常偏離正常的方式。 但不論早期的胚胎發(fā)育途徑如何，合子胚和不定胚一般都能發(fā)育成正常的成熟胚。與合子胚相似，球形期后的體細胞胚呈現(xiàn)一種固定的極性，根據(jù)指向愈傷組織或胚性細胞的中央，莖芽極朝外。與合子胚相比，成熟體細胞的進一步發(fā)育過程及形態(tài)特征也是相當正常的。 與合子胚不同的是，在培養(yǎng)中形成的體細胞胚常常具有兩個以上的子葉。若在培養(yǎng)基里加入0.1-1.0 的umol/L的ABA,則可抑制體細胞胚的異常增殖,阻止沿下胚軸長出不定胚以及形成大量異常子葉的現(xiàn)象，并可避免早熟萌發(fā)，從而使體細

8、胞胚能夠正常發(fā)育。1.3.4 影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素1.3.4.1 植物種類和基因型植物物種和品種基因型影響愈傷組織的分化 程林梅等（2001）的研究表明，利用不同基因型大豆品種的下胚軸作外植體進行組培時，培養(yǎng)基對愈傷組織的影響不明顯；細胞分裂素（KT）和NAA的配比濃度對其愈傷組織的分化影響顯著；不同基因型大豆植株再生作用差異明顯；外植體取材時間和取材部位對再生植株的形成也具有較大的影響，再生能力最強的取材部位時從子葉節(jié)到下胚軸6mm區(qū)段,當下胚軸長到23cm時取材最佳。不同基因型、激素濃度對大豆植株再生的影響*資料來源:基因型和激素濃度對大豆植株再生的影響.程林梅等，植物學通報2001

9、 .18(3):367-370.木本植物愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控 第一步：利用分化培養(yǎng)基（含有6-BA、CPPU、KT）使愈傷組織形成不定芽，增加繁殖系數(shù)。 第二步：當不定芽長大出現(xiàn)葉片后，再將伸長的苗從基部切下轉(zhuǎn)入含生長素類（如IAA、NAA）的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導根的生成。 蘆薈愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控 1、先用MS培養(yǎng)附加不同濃度的6BA，促進不定芽的生成。 不同濃度6-BA對庫拉索蘆薈增殖的影響蘆薈愈傷組織形態(tài)發(fā)生的人為調(diào)控2、然后將抽枝的小植株轉(zhuǎn)移到MS附加不同濃度NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導根的發(fā)生與生長 。 不同濃度NAA對庫拉索蘆薈生根的影響1.3.4.2 培養(yǎng)材料的生理狀態(tài)(

10、1)植株的發(fā)育年齡： 一般情況下，幼態(tài)組織比老態(tài)組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力，特別是生根能力。 (2)培養(yǎng)器官或組織類型： 同一植物的不同器官、組織或細胞，其形態(tài)發(fā)生的能力和方式常有所不同。如種子、幼胚和下胚軸較容易形成胚狀體，而莖段、葉片則比較困難。 (3)培養(yǎng)時間和細胞倍性 愈傷組織培養(yǎng)時間過長或繼代次數(shù)太多，往往會推遲或降低形態(tài)發(fā)生的能力，所以一般均取處于旺盛生長期的愈傷組織材料來誘導器官的形成。 1.3.4.3 培養(yǎng)基 一、 影響體細胞胚胎發(fā)生的因子1、生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 愈傷組織的建立和增殖所需要的是一種含有生長素的培養(yǎng)基，通常所用的培養(yǎng)基是2，4D，濃度范圍。在此能使胚性細胞團數(shù)量不斷增加

11、，但不出現(xiàn)成熟的胚。如果把胚性細胞團轉(zhuǎn)移到一種生長素含量很低（或完全沒有生長素的培養(yǎng)基，它們就能發(fā)育為成熟的胚。2 氮源 除生長素外，培養(yǎng)基中氮源的形態(tài)也會影響離體條件下的胚胎發(fā)生。只有當培養(yǎng)基中含有一定量的還原態(tài)氮時，才能出現(xiàn)胚胎發(fā)生過程。 在以KNO3為唯一氮源的培養(yǎng)基上建立起來的 愈傷組織，去掉生長素后不能形成胚。然而，若在 55mmol/LKNO3的培養(yǎng)基中加入少量的 (5mmol/L)NH4Cl形態(tài)的氮，胚胎發(fā)生過程就會出現(xiàn)。 還原態(tài)氮和氮化態(tài)氮最適合的比是10mmol/LNH4Cl和40mmol/LKNO3 欲使胡蘿卜培養(yǎng)細胞形成體細胞胚，必須有一個最低數(shù)量的內(nèi)源NH4存在（每千克

12、鮮重的組織約5 mmol/L）。如果內(nèi)源NH4達不到這個臨界值，細胞就不能進行胚胎分化。而要使細胞內(nèi)NH4達到這個水平，不但需要很少量的外源NH4存在（），還需要供應(yīng)相對濃度很高的NO3-(60mmol/L).3 其他因子1、高濃度的鉀（20 mmol/L ）是胚胎發(fā)生所必 需的。2、在培養(yǎng)基中溶解氮的含量應(yīng)低于一個臨界值 （），否則將有利于生根，而不利 于成胚。3、在培養(yǎng)基中加入活性炭也能提高胡蘿卜細胞 發(fā)生的頻率。4、如果外加與枸櫞胚珠所產(chǎn)生的濃度相當?shù)囊?醇，能顯著抑制胡蘿卜培養(yǎng)物的胚胎發(fā)生， 而非揮發(fā)性的物質(zhì)如IAA、ABA、GA 也能 抑制其胚胎發(fā)生。二、激素對愈傷組織分化的影響 植

13、物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在分化過程中的作用是極為明顯的，合適的植物生長物質(zhì)配比在器官分化中起著重要的作用。 如仙人掌科的金牛掌莖段培養(yǎng)中，當6-BA的濃度是NAA的50100倍時，莖段的愈傷組織可以再分化出仔球，而6-BA濃度過高(150倍)或過低(10倍)則無仔球形成。 愈傷分化不同濃度的激素對煙草愈傷組織的影響器官分化的植物激素控制理論大量的實驗結(jié)果表明： 大多數(shù)植物組織或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理論。 即：生長素與細胞分裂素的比例小時則產(chǎn)生苗，比例大時則生根，而兩種激素的比例適中時，則產(chǎn)生無結(jié)構(gòu)的愈傷組織。外植體愈傷組織芽根再生植株脫分化再分化高生長素(1,2-D)高(生長素/細胞

14、分裂素)低(生長素/細胞分裂素)器官發(fā)生途徑影響愈傷組織分化的其他因素1）、生長素對維管組織分化過程有顯著影響. 法國植物學家Camus（1949）最早將小營養(yǎng)芽嫁接在一種菊苣屬植物根的愈傷組織（由薄壁細胞構(gòu)成）表面，營養(yǎng)芽經(jīng)培養(yǎng)一段時間后分化出維管組織。 Wetmore等許多人的研究也證實芽之所以能誘導愈傷組織分化是因為它在生長時合成了某些植物激素。 一般說來生長素濃度和木質(zhì)部發(fā)生之間存在著一種反比關(guān)系，低濃度的生長素能刺激木質(zhì)部的發(fā)生。生長素對維管組織分化所起的作用在很大程度上取決于糖的存在。在洋丁香愈傷組織培養(yǎng)時，如果灌注到愈傷組織頂面缺口里的瓊脂含有的IAA和1%的蔗糖，愈傷組織只能形

15、成很少的木質(zhì)部分子。若保持生長素濃度不變，而將蔗糖水平增加到2%，則有利于木質(zhì)部的分化，但韌皮部很少。 當蔗糖增至2.5%3.5%時，木質(zhì)部與韌皮部都可以分化形成，而當蔗糖增至4%時，只有韌皮部的分化。影響愈傷組織分化的其他因素2） 細胞分裂素能刺激大豆子葉愈傷組織木質(zhì)部的分化。3） IAA與激動素之間能協(xié)同影響煙草愈傷組織木質(zhì)部的分化形成。生長素與赤霉素對植物愈傷組織的分化形成也存在著協(xié)同作用。乙烯也參與木質(zhì)部的形成，有人研究發(fā)現(xiàn)缺乏乙烯的番茄突變體植株木質(zhì)部內(nèi)沒有導管，但正常植株是具有導管的。4） 硝酸銀能抑制大豆愈傷組織木質(zhì)部的分化，加入蛋氨酸可以克服硝酸銀的抑制作用。、培養(yǎng)條件光照：愈

16、傷組織的誘導需弱光或不需光，分化需光。繼代培養(yǎng)一般需光。此時光對器官的作用是一種誘導反應(yīng)。溫度：一般采用2428的恒溫條件進行。濕度：較大，以免引起培養(yǎng)基干縮。 141 基因表達與位置效應(yīng) 基因表達(geneexpression)指儲存遺傳信息的基因經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個過程。 位置效應(yīng)1.4.2 器官分化信息傳遞 1.4.2.1 胞外信號分子 胞外通訊信號分子又稱第一信使(first messenger)。在植物細胞外的通訊信號分子，如植物激素主要通過維管束系統(tǒng)在細胞與器官間進行調(diào)節(jié)。它在植株的某些發(fā)育階段，于特，部位發(fā)生作用。植物激素信號由位于膜或其它部位的受體所接收，進一步

17、直接或間接地影響：因表達。當植物激素以直接的形式影響基因表達時，就會產(chǎn)生在轉(zhuǎn)錄、翻譯等水平上的不同，應(yīng)，從而控制酶的合成，影響代謝變化，最終產(chǎn)生某些生理反應(yīng)。 胞內(nèi)信號分子 胞內(nèi)通訊信號分子又稱第二信使(secondmessenger)o在植物體內(nèi)，它們主要通過鈣，號系統(tǒng)、磷酸肌醇信號系統(tǒng)等發(fā)揮作用，其中磷酸肌醇信號系統(tǒng)是以磷酸肌醇代謝為基礎(chǔ)進：信號轉(zhuǎn)移的。 5.10 細胞全能性的實際應(yīng)用5.10.1 概說 只有體細胞的全能性，體細胞能夠產(chǎn)生完整的植株，才有可能通過細胞水平上的操作（體細胞雜交、離體單細胞的突變等）進行農(nóng)作物的改良。 目前，在具有多胚性柑橘品種中，珠心細胞成胚是建立無病毒無性系

18、的唯一可行的天然途徑。5.10.2 人工種子 人工種子 人工種子是指通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得有胚芽、胚根、胚軸等結(jié)構(gòu)的植物胚狀體，并且用適當方法將胚狀體包裹起來，用以代替天然種子進行繁殖的一種結(jié)構(gòu)。人工種子的概念是1978年在加拿大舉行的第四屆國際植物組織、細胞培養(yǎng)會議上首次提出來的。目前研制的人工種子，是由胚狀體、作為保護性外殼的人工種皮和提供發(fā)育所需營養(yǎng)的人工胚乳三部分組成的。 人工種子有許多優(yōu)點。首先，它解決了有些作物品種繁殖能力差、結(jié)子困難或發(fā)芽率低 等問題。第二，人工種子可以工業(yè)化生產(chǎn)，提高農(nóng)業(yè)的自動化程度。第三，人工胚乳中除含有胚狀體發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)外，還可以添加各種附加成分，如固氮細菌、防病蟲農(nóng)藥、除草劑和植物激素類似物等，有利于幼苗茁壯成長，提高作物產(chǎn)量。第四，用人工種子播種可以節(jié)約糧食。例如，一個12 L的發(fā)酵罐在20 d內(nèi)生產(chǎn)的胡蘿卜胚狀體，可以制成1 000萬粒人工種子，滿足幾千公頃農(nóng)田的