多克隆抗體技術(shù)

1、 13 第九章 多克隆抗體技術(shù)Polycloneantibodies preparation technique一、 概述一多克隆抗體的概念抗原刺激機(jī)體，產(chǎn)生免疫學(xué)反響，由機(jī)體的漿細(xì)胞合成并分泌的與抗原有特異性結(jié)合力量的一組球蛋白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結(jié)合力量的免疫球蛋白就是抗體?？乖ǔＪ怯啥鄠€(gè)抗原打算簇組成的，由一種抗原打算簇刺激機(jī)體，由一個(gè) B 淋巴細(xì)胞承受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體Monclone antibod抗原打算簇刺激機(jī)體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機(jī)體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原打算簇的多樣性以

2、外，同樣一類抗原打算簇，也可刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD 等五類抗體。二免疫動(dòng)物供免疫用的動(dòng)物主要是哺乳動(dòng)物和禽類，常選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等。動(dòng)物的選擇常依據(jù)抗體的用途和量來(lái)打算，也與抗原的性質(zhì)有關(guān)。如要獲得大量的抗體，多承受大動(dòng)物；如要是獲得直接標(biāo)記診斷的抗體，則直接承受本動(dòng)物；如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必需用異源動(dòng)物制備抗體；假設(shè)難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以承受純系小鼠制備；一般試驗(yàn)室承受的抗體，多用兔和羊制備。免疫用的動(dòng)物最好選擇適齡的安康雄性動(dòng)物，雌性動(dòng)物特別是妊娠動(dòng)物用于制備免疫抗體則格外不適宜，有時(shí)甚至不產(chǎn)生抗體。由于

3、對(duì)免疫應(yīng)答的個(gè)別差異，免疫時(shí)應(yīng)同時(shí)選用數(shù)只動(dòng)物進(jìn)展免疫?？乖嵌喾N多樣的，而且千差萬(wàn)別。就其化學(xué)成分而言，有蛋白質(zhì)抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原，如要制備用于篩選細(xì)菌表達(dá)的 cDNA文庫(kù)或免疫印跡的抗血清，最好選用可降解的蛋白質(zhì)抗原。不同的抗原，其免疫原性的強(qiáng)弱均不一樣，這種免疫原性的強(qiáng)弱取決于抗原的分子量、化學(xué)活性基團(tuán)、立體構(gòu)造、物理外形和彌散速度等。抗原的免疫劑量是依照賜予動(dòng)物的種類、免疫周期以及所要求的抗體特性等不同而不同。劑量過(guò)低，不能引起足夠強(qiáng)的免疫刺激，免疫劑量過(guò)多，有可能引起免疫耐受。在肯定

4、的范圍內(nèi)，抗體的效價(jià)是隨注射劑量的增加而增高。蛋白質(zhì)抗原的免疫劑量比多糖類抗原寬。一般而言，小鼠的首次免疫劑量為 50g400g/次，大100g1 000g200g1 000g/1525。免疫劑量與注射途徑有關(guān)，一般而言，靜脈注射劑量大于皮下注射，而皮下注射又比掌內(nèi)和跖內(nèi)皮下注射劑量大，也可承受淋巴結(jié)內(nèi)注射法。加佐劑比不加佐劑的注射劑量要小，對(duì)家兔而言，承受弗氏完全佐劑，則需注射0.5mg1mg/kg./次， 如承受弗氏不完全佐劑則注射劑量應(yīng)大 10 倍以上。如要制備高度特異性的抗血清, 可選用低劑量抗原短程免疫法。如需要獲得高效價(jià)的抗血清，宜承受大劑量長(zhǎng)程免疫法。免疫周期長(zhǎng)者，可少量屢次。免

5、疫周期短者，應(yīng)大量少次。兩次注射的間隔時(shí)間應(yīng)長(zhǎng)短適宜,一次激發(fā)的敏感作用。一般間隔時(shí)間應(yīng)為57 2 周左右。注射的Ig 純度高，則一般不易引起過(guò)敏反響，如注射血清，即使是少量，在再次免疫時(shí)，極易引起過(guò)敏反響，所以肯定要實(shí)行措施。四佐劑的應(yīng)用對(duì)可溶性抗原而言，為了增加其免疫原性或轉(zhuǎn)變免疫反響的類型、節(jié)約抗原等目的，常承受加佐劑的方法以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。佐劑的類型 目前實(shí)踐中常應(yīng)用的佐劑有氫氧化鋁膠、明礬、弗氏佐劑、脂質(zhì)體和石蠟油等。也有承受結(jié)合桿菌等分枝桿菌、白喉?xiàng)U菌以及細(xì)小棒狀桿菌等。 弗氏不完全佐劑incomplete Freund”s adjuvant,IFA羊毛脂1 份石蠟油5

6、 份混合，高壓滅菌后保存。用時(shí)加熱溶化，冷卻至50左右，加抗原進(jìn)展乳化處理。 弗氏完全佐劑complete Freund”s adjuvant,CFA弗氏不完全佐劑10ml卡介苗10mg200mg10010min 滅活處理。初次免疫時(shí)，最好用弗氏完全佐劑，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反響。再次免疫時(shí)，一般不用完全佐劑，而承受弗氏不完全佐劑。但在爭(zhēng)辯分枝桿菌及相關(guān)抗原時(shí)，一般不用弗氏完全佐劑，以免卡介苗的干擾。分子層組成，這種構(gòu)造使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩性物質(zhì)，他們被包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部的水相中，或插入類脂雙分子層或吸附、聯(lián)接在脂質(zhì)體的外表，起到明顯的免疫增加作用。 油佐劑 ：承受植物油和礦物

7、油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。目前應(yīng)用最廣的礦物油。10 號(hào)白油(石蠟油)100ml硬脂酸鋁2g司本806ml混合加熱溶化，分裝。用時(shí)按以下配方進(jìn)展乳化。油相3份水相4%吐溫80 1 份先把油相攪拌起來(lái)，然后緩慢參加水相乳化。司本是油分散劑，吐溫是水分散劑，均有利于乳化。乳化 將抗原與佐劑混合的過(guò)程稱為乳化。乳化的方法很多，可承受研缽乳化；可直接在旋渦振蕩器上乳化；可用組織搗碎器乳化。少量時(shí)，特別是弗氏佐劑 與抗原乳化時(shí)，常承受注射器乳化，用兩個(gè)注射器，一個(gè)吸入抗原液，一個(gè)吸入佐 劑，兩注射器頭以膠管連接，留意肯定扎緊，然后來(lái)回抽吸。當(dāng)大量乳化時(shí)，可采 用膠體磨進(jìn)展。乳化好的標(biāo)志是取一滴

8、乳化劑滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散。如消滅平展集中即為未乳化好。乳化過(guò)的物質(zhì)放置一段時(shí)間在保存期內(nèi)消滅油水分層也是未乳化好的表現(xiàn)。依據(jù)抗原的性質(zhì)、免疫原性和動(dòng)物的免疫反響性來(lái)打算免疫途徑、免疫次數(shù)和間隔時(shí)間等。免疫途徑包括皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射、靜脈注射、腹腔注射以及淋巴結(jié)內(nèi)注射等。抗原量少，則一般多承受加佐劑，淋巴結(jié)內(nèi)或淋巴結(jié)四周、或足掌、或皮內(nèi)、皮下多點(diǎn)注射，如抗原量多，則可承受皮下、肌肉、以至靜脈注射。注射間隔時(shí)間 帶佐劑的皮內(nèi)、皮下注射，一般為間隔24佐劑的皮下或肌肉注射，一般為12 周間隔時(shí)間；肌肉或靜脈免疫的，可5 天左右的間隔時(shí)間?？梢园迅鞣N注射途徑聯(lián)合起來(lái)應(yīng)用，最終以到達(dá)效價(jià)

9、要求為目的。六抗體的鑒定抗體的效價(jià)鑒定 不管是用于診斷還是用于治療，制備抗體的目的都是要求較高效價(jià)。不同的抗原制備的抗體，要求的效價(jià)不一。鑒定效價(jià)的方法很多，包括有試管凝集反響、瓊脂集中試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。常用的抗原所制備的抗體一般都有約成的鑒定效價(jià)的方法，以資比較。如制備抗抗體的效價(jià)，一般就承受瓊脂集中試驗(yàn)來(lái)鑒定。抗體的特異性鑒定 抗體的特異性是指與相應(yīng)抗原或近似抗原物質(zhì)的識(shí)別力量。抗體的特異性高，它的識(shí)別力量就強(qiáng)。衡量特異性通常以穿插反響率來(lái)表示。 穿插反響率可用競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)測(cè)定。以不同濃度抗原和近似抗原分別做競(jìng)爭(zhēng)抑制曲 IC50假設(shè)所用抗原濃度IC 濃度為pg/IC 濃度幾乎是無(wú)5

10、050窮大時(shí)，表示這一抗血清與其他抗原物質(zhì)的穿插反響率近似為 0，即該血清的特異性較好?？贵w的親和力 是指抗體和抗原結(jié)合的結(jié)實(shí)程度。親和力的凹凸是由抗原分子的大小、抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原打算簇之間立體構(gòu)型的適宜度打算的。有助于維持抗原抗體復(fù)合物穩(wěn)定的分子間力有氫鍵、疏水鍵、側(cè)鏈相反電荷基因的庫(kù)侖力、范德華力和空間斥力。親和力常以親和常數(shù)K 表示，K 的單位是L/mol，通常K的范圍在 1081010/mol，也有多達(dá) 1014/mol。抗體親和力的測(cè)定對(duì)抗體的篩選，確定抗體的用途，驗(yàn)證抗體的均一性等均有重要意義。七抗血清的凍存1/1/分裝小瓶，置-20以下的低溫保存，數(shù)月至數(shù)年內(nèi)抗體效價(jià)無(wú)明

11、顯變化。留意避開反復(fù)凍融。也可將抗血清冷凍枯燥后保存。二、 抗Ig一抗原制備Ig 是免疫球蛋白，對(duì)異種動(dòng)物而言，是良好的抗原物質(zhì)。可以刺激異種動(dòng)物產(chǎn)生抗 IgIg 抗體，又叫其次抗體或抗抗體。在多數(shù)的間接標(biāo)記反響中，均需制備抗Ig二材料與試劑提取的動(dòng)物Ig弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑青霉素和鏈霉素試驗(yàn)動(dòng)物 兔其它材料及試劑三操作方法免疫方法 可以承受以下各種方法之一進(jìn)展免疫。1或皮內(nèi)50mg20.10mlIgG含量5mg/m106 點(diǎn)皮下注射含不完全佐劑的抗原，每點(diǎn) 0.50ml；710 天后，脊柱兩側(cè)重復(fù)注射一次；710 天后試血。不合格者重復(fù)步驟。每側(cè)約0.30m710各注射加有完全佐劑的

12、IgG 0.50ml(IgG 5mg/ml1 000U/ml、鏈20.10mlIgG含量5mg/m106 點(diǎn)皮下注射含不完全佐劑的抗原，每點(diǎn) 0.50ml；710 天后，脊柱兩側(cè)重復(fù)注射一次；710 天后試血。不合格者重復(fù)步驟。3跖內(nèi)側(cè)皮下注射含完全佐劑抗原0.50mlIgG量為5mg/m147 靜脈注射不含佐劑的抗原 2ml；測(cè)定血清抗體效價(jià)，不合格者重復(fù)步驟，并適當(dāng)遞增IgG量。效價(jià)測(cè)定 承受瓊脂集中法。 將血清倍比稀釋，參加外周孔。 中間孔加動(dòng)物Ig。 3724四結(jié)果判定抗Ig116132IgIgIg。Ig 與Ig 以及標(biāo)準(zhǔn)品Ig提取的Ig三、 豬瘟、豬丹毒、豬肺疫三聯(lián)血清的制備一材料及

13、試劑豬瘟疫苗豬丹毒菌苗豬肺疫疫苗肥豬二操作方法根底免疫 選安康的育肥豬數(shù)頭，進(jìn)展豬瘟、豬丹毒和豬肺疫三種疫苗的根底免疫。豬瘟疫苗實(shí)行肌肉注射法，豬丹毒和豬肺疫承受口服法進(jìn)展。710 天，進(jìn)展加強(qiáng)免疫。豬瘟疫苗、豬丹毒和豬肺200 頭份、100 100 頭份，肌肉或皮下注射。37 天后，進(jìn)展其次次強(qiáng)化注射，劑量同前。41012 天后，無(wú)菌放血和收集血液。放血前一天晚上停食，可飲水。5血液自然凝固、分別血清。按0.3%加石炭酸，無(wú)菌分裝，冰箱內(nèi)保存。三結(jié)果判定物理性狀檢查 血清清亮、透亮，呈草黃色或金黃色。37 天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。安全檢查 取血清樣 0.50ml35 7天，小白鼠應(yīng)安康存活。效力檢查

14、 豬丹毒和豬肺疫的小白鼠攻毒試驗(yàn)，保護(hù)率應(yīng)為100。四、雞城疫和雞傳染性法氏囊炎二聯(lián)高免卵黃抗體的制備一材料與試劑城疫滅活油佐劑苗患傳染性法氏囊炎的法氏囊組織傳染性法氏囊炎弱毒苗安康產(chǎn)卵雞群城疫血凝抗原傳染性法氏囊炎瓊擴(kuò)抗原其它二操作方法傳染性法氏囊炎組織滅活苗的制備 將有病變的法氏囊組織稱重，以組織搗15重量體積加滅菌生理鹽水，連續(xù)搗勻，然后用5 層滅菌紗布過(guò)濾，參加 0.30的甲醛，混勻，37感作 24h，中間振蕩數(shù)次。滅活后，以常規(guī)培育基進(jìn)展雜菌檢查，以小白鼠進(jìn)展安全檢查，合格后，置陰涼處備用。傳染性法氏囊炎滅活油佐劑組織苗的制備 將 10 2加硬脂酸鋁粉和 6的司本80 4比例參加吐溫80，以油相水相31 的劑量制成滅活油佐劑組織苗。先將油相攪拌起來(lái)，漸漸參加水相，充分?jǐn)嚢杓纯?。選取安康無(wú)主要傳染病，特別是無(wú)雞白痢、沙門氏菌病的高產(chǎn)雞群。 2ml。514 天后，從雞翅靜脈采血，采集血清做雞城疫血凝抑制試驗(yàn)和傳染性法氏囊瓊脂集中試驗(yàn)。血凝抑制價(jià)平均到達(dá) 12084，瓊擴(kuò)效價(jià)到達(dá) 116 以上，即為合格。如不合格，可連續(xù)重復(fù)步驟4。效價(jià)合格，收獲雞蛋。將雞蛋水洗后，浸