細(xì)胞同步化實(shí)驗(yàn)原理及步驟

1、實(shí)驗(yàn)十七 細(xì)胞同步化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模豪斫饧?xì)胞同步化的基本原理。掌握同步化實(shí)驗(yàn)技術(shù)。加深對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)期的理解，進(jìn)一步掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞同步化是指自然的或經(jīng)人為選擇或誘導(dǎo)造成的細(xì)胞周期同步化，前者稱自然同步化，后者稱人工同步化。而人工同步化又可分為：選擇同步化和誘導(dǎo)同步化。誘導(dǎo)同步化：是指利用藥物阻斷代謝，把細(xì)胞阻斷于細(xì)胞周期的某一點(diǎn)上，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)液中使細(xì)胞同步化的方法。例如用羥基脲和過(guò)量胸腺嘧啶核苷均可將細(xì)胞阻斷在G1/S交界處，從而獲得S期細(xì)胞的同步化；利用秋水仙素將細(xì)胞阻斷在分裂中期；培養(yǎng)基中缺乏異亮氨酸則可將細(xì)胞阻斷于G1期。下面介紹阻斷細(xì)胞于S期的TdR阻斷

2、法。TdR阻斷法：在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入過(guò)量的TdR，則能抑制細(xì)胞DNA合成。其機(jī)制為2mM TdR引起DNA合成減慢的原因。因?yàn)樗答佉种贫姿岷塑者€原酶活性（見(jiàn)圖）。這個(gè)抑制DNA合成可以被加入脫氧胞嘧啶核苷（dCdR）而解除。因?yàn)閐CdR排除了胞嘧啶核苷二磷酸鹽轉(zhuǎn)化為脫氧胞嘧啶核苷二磷酸鹽的必要性。二次給予過(guò)量的TdR法：第一次阻斷時(shí)間相當(dāng)于G2，M和G1期時(shí)間的總和這就使得為些部分的細(xì)胞都積累在G1/S區(qū)域。然后通過(guò)細(xì)胞洗滌而釋放，使所有被累積在G1/S期細(xì)胞以及原先停留在S期的細(xì)胞都能通過(guò)S期。然后第二次給予過(guò)量的TdR，則使細(xì)胞大部分被積累在G1/S處，后按上述方法使抑制釋放就能得到較

3、高同步化的S期細(xì)胞。選擇同步化；主要是有絲分裂選擇法。單層培養(yǎng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞分裂活躍，分裂細(xì)胞變園，隆起，與培養(yǎng)器的附著性降低，稍加振蕩，M期細(xì)胞則脫落而懸浮于培養(yǎng)液中，傾出培養(yǎng)液貯于4冰箱中保存，再加入新鮮培養(yǎng)液37繼續(xù)培養(yǎng)，30分鐘后，再依上法收集M期細(xì)胞，反復(fù)上述操作，便可獲得一定數(shù)量的中期細(xì)胞，以供研究。此法的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞不受藥物等的傷害。三、試劑和器材 試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基，Eagle培養(yǎng)基，小牛血清，PHA，TdR（H3TdR）,CdR，雙抗。 器材：37培養(yǎng)箱，培養(yǎng)瓶，吸管，移液管，恒溫水浴鍋，倒置顯微鏡，離心管。 實(shí)驗(yàn)材料：人外周血細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，CHO

4、細(xì)胞或其它細(xì)胞。四、操作步驟（一）阻斷細(xì)胞于G1/S期交界處的TdR雙阻斷法：在含有10%小牛血清，0。3ml PHA（濃度同前面的實(shí)驗(yàn)）的5ml RPMI-1640培養(yǎng)液中接種0。30。4ml人外周血。置37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72小時(shí)。72小時(shí)后，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入TdR至終濃度2mM，繼續(xù)培養(yǎng)17-19小時(shí)。移培養(yǎng)物于有蓋離心管底，1000rpm離心8分鐘，收集細(xì)胞沉淀，用新鮮的不含TdR的培養(yǎng)液（37）懸浮細(xì)胞，1000rpm離心，收集細(xì)胞，如此洗滌細(xì)胞3-4次，去除TdR。加入新鮮溫浴好的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)9小時(shí)后，加入TdR再次阻斷16小時(shí)。用新鮮培養(yǎng)液（不含TdR）清洗三次，進(jìn)行釋放，這時(shí)

5、的細(xì)胞大部分處于G1/S交界處，隨釋放時(shí)間的推移，同步化細(xì)胞逐漸進(jìn)入S期。（二）機(jī)械振蕩法收集M期同步化細(xì)胞：選用CHO細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清Eagle培養(yǎng)中，使用若干大型100ml的方型培養(yǎng)瓶，每瓶接種細(xì)胞數(shù)為2106個(gè)。37恒溫培養(yǎng)約30小時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期，這是細(xì)胞呈單層帖壁生長(zhǎng)。將水平方向輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，棄去舊培養(yǎng)液，換入新鮮溫浴的培養(yǎng)液，37繼續(xù)培養(yǎng)，此目的在于除去漂浮和游離的間期細(xì)胞，死亡細(xì)胞或細(xì)胞碎片。培養(yǎng)15分鐘以后，取出，水平方向輕輕搖動(dòng)10-15次，將帶有振蕩下來(lái)的細(xì)胞的胰液收入無(wú)菌離心管，4保存。再向培養(yǎng)瓶中加入新鮮溫浴培養(yǎng)液。為獲得較多的M期細(xì)胞，可以每隔15分鐘，按步驟4收集一次細(xì)胞懸液，貯存。將所有細(xì)胞懸液置于