分子克隆3-在大腸桿菌中表達克隆化基因

1、在大腸桿菌中表達克隆化基因?qū)а?方案 1. 用 IPTG 誘導(dǎo)啟動子在大腸桿菌中表達克隆化基因 方案 2. 用 T7 噬菌體啟動子在大腸桿菌中表達克隆化基因 方案3.用九噬菌體PL啟動子在大腸桿菌中表達克隆化基因 方案4.用堿性磷酸酶啟動子（phoA）和信號序列在大腸桿菌中分泌表達外源蛋白附加方案：phoA融合蛋白的亞細胞定位方案 5. 谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化融合蛋白方案 6. 直鏈淀粉樹脂親和層析純化麥芽糖結(jié)合融合蛋白 方案7.用固化Ni2+吸收色譜純化帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白替代方案：用 pH 遞降的緩沖液從金屬親和柱洗脫多聚組氨酸標(biāo)簽蛋白附加方案：NTA- Ni2+瓊脂糖再生方案 8.

2、從包涵體中純化表達蛋白附加方案：重折疊從包涵體提取的溶解蛋白方案 9. 9 信息欄克隆基因的表達 大腸桿菌表達系統(tǒng)LacZ 融合離液劑導(dǎo)言方案 1. 用 IPTG 誘導(dǎo)啟動子在大腸桿菌中表達克隆化基因（一） 引言帶異丙基-卩-D硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)啟動子的質(zhì)粒表達外源蛋白的總量可以達到 全菌蛋白的30%以上。這些質(zhì)粒非常適于實驗室小規(guī)模操作，但IPTG價格昂貴，不能用于 大規(guī)模制備外源蛋白。（二） 實驗方案A. 材料緩沖液和溶液a）考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液b）IPTG （1mmol/L）c）1*SDS 凝膠加樣緩沖液d）10% SDS載體和細菌菌株a）帶有l(wèi)aclq或lacIq1等

3、位基因的適于轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株帶有l(wèi)acIq等位基因的IPTG誘導(dǎo)表達質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化實驗室的任何大腸桿菌菌株（如JM1, DH5F,TG1 等）。b）IPTG 誘導(dǎo)的表達載體c）陽性對照質(zhì)粒（表達已知大小的LacZ融合蛋白的IPTG誘導(dǎo)載體）培養(yǎng)基 （如何配制？分子克隆附錄及科技出版社。）a）含氨芐（50yg/m 1）的LB瓊脂平板b）含氨芐（50yg/m 1）的LB培養(yǎng)基c）含氨芐（50yg/m 1）的LB培養(yǎng)液4. 專用設(shè)備a）沸水浴b） 振蕩培養(yǎng)箱細胞和組織附加試劑B. 方法含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構(gòu)建PCR含重組質(zhì)粒通過誘導(dǎo)靶蛋白表達的優(yōu)化對照菌和重組菌分別挑取12個菌落，接入1m

4、l含氨芐青霉素（50yg/m 1）的LB培 養(yǎng)液，適當(dāng)溫度（2037 C）培養(yǎng)過夜（16h ）。a）大腸桿菌在室溫的生長速度比在37C慢4倍，所以20C培養(yǎng)過夜（16h）可能達 不到飽和。但低溫時，細菌代謝緩慢，不容易形成包涵體。取50卩1過夜培養(yǎng)物接入5 ml含氨芐青霉素（50yg/m 1）的LB培養(yǎng)液，2037 C振蕩 培養(yǎng)2h以上（到底多少？是以經(jīng)驗時間，還是以A55（來定？），至對數(shù)中期（A550=0.51.0）。吸出1ml未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物放在一個微量離心管中，按下面步驟9和10所述進行處 理。在剩余培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度1mmo1/L，2037C繼續(xù)通氣培養(yǎng)（是否還搖？）。（參

5、見下面IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化。）a）影響在大腸桿菌中獲得高水平表達的最重要因素可能是生長溫度，通過實驗確定最 佳溫度，是表達外源蛋白的關(guān)鍵。雖然在1542C之間都獲得過成功表達，但表達 某一種特定蛋白質(zhì)的最佳溫度范圍可能很窄，只有24C。b）溫度有時對表達水平起著決定作用，而有時卻對表達水平?jīng)]有任何影響，這其中的 原因還有待進一步研究，但可能是諸多因素單獨或同時作用的結(jié)果。由于這些不確 定因素的存在，理論推斷最佳生長溫度是不可靠的，必須進行反復(fù)的實驗。c）IPTG的濃度度表達水平影響非常大。1mmo1/L只是一個起點，也是一個比較高的濃 度。實驗中應(yīng)該在0.010.5mmo1/L的范圍內(nèi)

6、改變IPTG濃度，尋找最佳使用濃度。d）對于有些蛋白，必須誘導(dǎo)表達質(zhì)粒慢轉(zhuǎn)錄，才不致使細菌的生物合成系統(tǒng)過載。在誘導(dǎo)的不同時間（如1、2、4、6h）取lml樣品放于微量離心管中，測定A550，室 溫高速離心1min.（高速，具體是多少？）沉淀懸于100卩1 1*SDS凝膠加樣緩沖液，100C加熱3min，室溫高速離心1min，冰 上放置，帶全部樣品處理完后上樣。樣品加熱至室溫，取40憾或相當(dāng)于0.15OD550培養(yǎng)物的懸液上樣于10%SDS15V/cm電泳，至溴酚蘭遷移到分離膠底部。考馬斯亮藍染色或銀染，或免疫印跡，觀察表達產(chǎn)物條帶。a） 37C誘導(dǎo)30min的陽性對照，有一條分子量為26kD

7、a的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST） 帶， GST 的量在誘導(dǎo)過程中持續(xù)升高。誘導(dǎo)一定時間的重組菌應(yīng)有一條與預(yù)計大小 一致的帶，誘導(dǎo)動力學(xué)和蛋白穩(wěn)定性可能不同于GST對照。大量表達靶蛋白挑取一個重組大腸桿菌菌落接入含50 ml含氨芐青霉素（50yg/m 1）的LB培養(yǎng)液，在 250ml搖瓶中于2037 C過夜培養(yǎng)。取550ml過夜培養(yǎng)物接入450500ml含氨芐青霉素（50yg/m 1）的LB培養(yǎng)液，在 2L搖瓶中于2037C振蕩過夜培養(yǎng)，至對數(shù)中期（A550 =0.51.0）。（步驟14剩余的細 菌如何處理才能以后還可以繼續(xù)用？）以預(yù)實驗確定的最佳IPTG濃度、最佳時間和最佳溫度誘導(dǎo)表達靶蛋白

8、。誘導(dǎo)適當(dāng)時間后，于4C以5000g （5000r/min Sorvall GSA轉(zhuǎn)頭）離心15min收集 細胞，繼續(xù)后面的實驗方案：a）如果表達的是GST融合蛋白，繼續(xù)方案5。b）如果表達的是麥芽糖結(jié)合蛋白融合蛋白，繼續(xù)方案6。c）如果表達產(chǎn)物帶有組氨酸標(biāo)簽，繼續(xù)方案 7。18.（三） 注意事項 方案 2. 用 T7 噬菌體啟動子在大腸桿菌中表達克隆化基因（一） 引言（二）實驗方案材料緩沖液和溶液專用設(shè)備細胞和組織附加試劑方法（三）注意事項方案3.用九噬菌體PL啟動子在大腸桿菌中表達克隆化基因方案4.用堿性磷酸酶啟動子（phoA）和信號序列在大腸桿菌中分泌表達外源蛋白附加方案：phoA融合蛋

9、白的亞細胞定位方案 5. 谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化融合蛋白（一） 引言谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是一類以谷胱甘肽（-谷氨酰胺半胱酰胺甘氨酸）作為底物, 通過形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。GST對底物的親和力是亞毫摩爾級的，因此谷胱甘 肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對GST及其融合蛋白的純化效率很高?？梢杂煤坞x的 谷胱甘肽的緩沖液洗脫結(jié)合的GST融合蛋白。樹脂用含3mol/L NaCl的緩沖液再生。（二） 實驗方案A. 材料1. 緩沖液和溶液a） 二硫蘇糖醇 （ DTT, 1 mol/L）b) 谷胱甘肽洗脫液PBS (4 C)Triton X-100 (0.2%,V/V)e) DNa

10、se (5mg/ml) ：中文名稱？誰有？配制方法？f) RNase (5mg/ml)g) 溶菌酶 (儲備液濃度？)2. 專用設(shè)備a) 皮下注射針頭(18#，22#，25#)3. 細胞和組織4. 附加試劑10% SDSB. 方法谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的處理1. 輕輕取部分4在樹脂中每毫升樹脂 制備細胞抽提物每100ml培養(yǎng)物的細胞沉淀懸于4ml PBS。加入溶菌酶至終濃度1mg/ml,冰上放置30min。a) 采用溶菌酶的方法重復(fù)性好，而且不會引起細胞的災(zāi)難性裂解。用針筒將 10ml 0.2%Triton-X100 強行注入黏的細胞裂解物中,劇烈振蕩數(shù)次混勻。加 入 DNase 和 RNase 至終濃度 5 g/ml, 4C, 3000g (5000r/min Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭) 離心30min,去除不溶性細胞碎片。上清(細胞裂解物)轉(zhuǎn)移到一只新管中，加入DTT 至終濃度 1 mmol/L。a)加入Triton-X100的作用是放止蛋白聚集。純化融合蛋白細胞裂解物混合物(三) 注意事項方案 6. 直鏈淀粉樹脂親和層析純化麥芽糖結(jié)合融合蛋白(一) 引言(二) 實驗方案A. 材料緩沖液和溶液專用設(shè)備細