阿霉素對人膽管癌細胞株FRH0201的生物學特性的影響

1、阿霉素對人膽管癌細胞株FRH0201的生物學特性的影響【關鍵詞】膽道腫瘤阿霉素腫瘤細胞,培養(yǎng)液細胞周期細胞大小A125A19【摘要】目的：觀察阿霉素長時間作用對膽管癌細胞株FRH0201生物學活性的影響。方法：用2g/l的阿霉素同一濃度逐漸延長時間作用于人膽管癌細胞株FRH0201細胞，經(jīng)反復作用挑選出能在含1g/l的阿霉素培養(yǎng)液中生存72h，去掉阿霉素后仍能繼續(xù)穩(wěn)定傳代生長的細胞。無藥培養(yǎng)1月后進展生物學行為的監(jiān)測。觀察細胞形態(tài)學，繪制生長曲線和流式細胞儀測定細胞周期，酶聯(lián)免疫吸附法測定細胞的腫瘤標記物，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)的阿霉素的熒光強度。結果：阿霉素作用后FRH0201細胞形態(tài)學

2、有輕度改變，細胞倍增時間較親本細胞延長3h，與親本細胞相比S期細胞增多16.89%，G1期細胞減少29.33%、G2期細胞增多12.46%。A125和A199試驗組和親本組分別為9.14和8.60U/l，1.59和2.96U/l，細胞內(nèi)阿霉素濃度熒光強度平均值，親本細胞為1764.8，試驗組細胞為305.4。結論：阿霉素對膽管癌細胞株FRH0201的形態(tài)學及倍增時間無明顯影響，但使細胞進入S期、G2期的增多，細胞內(nèi)藥物濃度明顯降低，生長時間無明顯變化?！娟P鍵詞】膽道腫瘤阿霉素腫瘤細胞，培養(yǎng)液細胞周期細胞大小A125A199Theeffetsfadrayinnthehuanliverhilarh

3、langiarinnaelllineFRH0201【ABSTRAT】bjetive:TinvestigatetheeffetsfadrayinnelllinefFRH0201.ethds:Huanhilarhlangiarinnaelllineereulturedithadrayin(2g/l)thrughlastingdifferentties,finallythiselllineansurviveafter72hulturedintheultureliquidiththeadrayin(1g/l).Thentheediuasreplaedithafreshneithutadrayin,an

4、dtheellserentinuuslyulturedfr1nth.Theinvitrstudiesinludedthebservatinftheappearaneithptialirspe,TTellprliferatinassay,analysisftheellylebyFlytetry(FAS),assaysfturarkerusingenzyelinkediunsrbentassay(ELISA),thefluresenedensityfadrayin.Results:paredttheparentFRH0201ellline:Therphlgyshedtypialrphlgialha

5、rateristis,thedublingtieprlngedabut3h,theellylebyflytetryidentifiedinG1,G2andSphasefellyleere40.50%,19.74%and39.77%intrialgrup,and69.83%,7.29%and22.88%inparentgrup,respetively.Turarkerhasndifferenebeteenthe,thefluresenedensityfepirubiindesending5.2ties.nlusin:Theadrayinanaffettheellyleandausethehang

6、efetablis.【KEYRDS】BiliarytratneplassAdrayinTurells,ulturedellyleellsizeA125A199目前，肝門部膽管癌手術切除率已明顯進步，手術病死率明顯下降，但真正到達根治性切除的病例很少，部分復發(fā)率很高，現(xiàn)有的化療及放療未見明顯的效果。其原因可能與肝門部膽管癌的生物學特性有關1。為此，我們觀察阿霉素長時間作用對膽管癌細胞株FRH0201生物學活性的影響。1材料和方法1.1材料阿霉素購于深圳萬樂公司，TT購自愛博生物工程，胎牛血清購自杭州四季青公司。膽管癌細胞株FRH0201由本課題組吳小鵬教授構建2。1.2方法采用濃度一樣不斷增加作

7、用時間的方法確定阿霉素培養(yǎng)液終濃度為1g/l。首先分別向FRH0201細胞株的培養(yǎng)瓶內(nèi)參加不同濃度的阿霉素Adrayin,ADR，培養(yǎng)3d后觀察細胞死亡情況。結合阿霉素的血漿濃度，選擇可將50%的細胞抑制的藥物濃度I50作為耐藥細胞培養(yǎng)的起始濃度2g/l，將腫瘤細胞置于該培養(yǎng)液中和不含藥物的10%小牛血清RPI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細胞穩(wěn)定生長、進入對數(shù)生長期后，傳代兩次，再將挑選出的細胞在一樣藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過1，2，3，6，12，24，36，48，60，72h10個時間段約8個月的培養(yǎng)，最終使細胞可以在1g/l阿霉素培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個月在檢測細胞的生物

8、特性。1.3觀察指標1.3.1形態(tài)學觀察將兩株細胞分別爬片后經(jīng)HE染色，光鏡下進展形態(tài)學觀察。1.3.2細胞倍增時間的測定取對數(shù)生長期的親本細胞即未用藥的細胞和阿霉素作用的細胞與試驗組細胞各一瓶，0.25%胰蛋白酶消化，10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1104個/l的單細胞懸液，96孔板中每孔接種2001，37、5%2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。每天取3個復孔計數(shù)活細胞，計算平均值，連續(xù)觀察7d。以培養(yǎng)時間為橫軸，以細胞數(shù)的對數(shù)為縱軸，繪制半對數(shù)細胞生長曲線，于生長曲線上對數(shù)生長期內(nèi)取3組數(shù)據(jù)，根據(jù)最小二乘法進展直線回歸，在直線上任取兩點Nt、N，根據(jù)以下公式計算細胞的倍增時間(Td3。T代表N

9、Nt的時間Td=TIg2/Ig(Nt/N1.3.3細胞周期分析取對數(shù)生長期的親本及實驗組細胞各1106個/l，制成單細胞懸液，按試劑盒說明進展操作，于流式細胞儀F上行細胞周期分析。1.3.4腫瘤標記物A125、A199分別將同等數(shù)量的親本及試驗組細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37、5%2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待細胞進入對數(shù)生長期后，分別搜集培養(yǎng)液各10l，1000r/in離心5in后取上清，用酶聯(lián)免疫吸附法進展A125及A199的檢測。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.1.3.5激光共聚焦顯微鏡檢測將親本細胞與試驗組細胞制備單層細胞爬片。將載玻片置于培養(yǎng)皿中10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1104個/l的單細胞

10、懸液，待細胞貼壁生長均勻布滿載玻片后參加2g/l阿霉素作用30in，PBS洗滌細胞2次，在磁共振共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強度表示。然后計算平均值。2結果2.1形態(tài)學改變倒置顯微鏡下對數(shù)生長期的FRH0201細胞呈鋪路石狀鑲嵌嚴密排列，細胞呈多邊形、梭形、圓形、不規(guī)那么形、三角形等各種形態(tài)，生長活潑，細胞體積變大，折光性差，核漿比例變大，細胞核增大。有多核細胞，有異常核分裂相。2.2細胞倍增時間實驗組細胞倍增時間為23.6h，延長了約3h。2.3細胞周期分析實驗組細胞與親本細胞相比：S期細胞增多16.89%，G1期細胞減少29.33%、G2期細胞增多12.46%。見圖1、2。2

11、.5激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強度表示，計算平均值。見圖3。3討論肝門膽管癌及膽囊癌術后化療是重要的輔助治療手段，但化療的敏感性不高。且可能存在個體性差異及可能誘發(fā)的腫瘤多藥耐藥性。為了臨床及根底方面對膽道惡性腫瘤綜合治療的研究，F(xiàn)RH0201細胞代表原發(fā)灶的所有細胞群體2，并已成功建立裸鼠動物模型3、4，我們用阿霉素對該細胞株進展干預，觀察對其生物學特性的影響。為了更接近臨床膽管癌化療反復間歇用藥的特點，對FRH0201細胞采用大劑量反復間歇同一濃度不同時間暴露，歷時8個月，獲得了穩(wěn)定生長的細胞。本次試驗不同于其它耐藥株固定藥物濃度，這更符合臨床用藥方式。在本實驗中我們發(fā)如

12、今低氧時，腫瘤細胞在含有阿霉素的培養(yǎng)基中可以繼續(xù)生長繁殖，一旦更換培養(yǎng)基后同樣劑量的藥物，細胞雖然可以繼續(xù)貼壁伸展。但藥物持續(xù)存在時卻出現(xiàn)凋亡細胞，隨著作用時間的延長，凋亡細胞逐漸減少。該細胞生物學特性的研究將為下一步耐藥株的建立，討論膽管癌耐藥機理及逆轉耐藥奠定基矗以往研究發(fā)現(xiàn)，與親本細胞株比擬，耐藥細胞株在形態(tài)、構造及代謝程度等方面均發(fā)生了顯著變化5。本實驗細胞在無藥培養(yǎng)1個月后生長穩(wěn)定，倍增時間稍有延長，其分泌的腫瘤標記物如A125、A199較親本細胞有所降低，這可能與藥物抑制細胞活性有關，也可能是藥物導致了細胞的分化有關，但是細胞排泄毒性藥物的作用得到了增強。我們推測這些生物學性狀的改

13、變與其耐藥表型親密相關，但其詳細機理尚有待進一步研究。經(jīng)流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，藥物處理前后試驗組G1期細胞比親本組約減少29.33%，G2期細胞比親本組增加12.46%，S期細胞增多16.89%，說明細胞通過細胞周期限制從G1期進入S期，然后阻滯于G2期，G2期的主要特征是RNA的合成和染色質的螺旋化，此期對外界環(huán)境敏感，易受各種因素的影響6。提示根據(jù)藥物對膽管癌細胞周期各期的影響，在臨床上可以更好地選擇不同的化療藥物，結合用藥以增加療效，減少副作用。在經(jīng)藥物作用挑選后1月，細胞內(nèi)抗腫瘤藥物濃度仍明顯降低，證明了細胞穩(wěn)定表達了某種機制，該機制可以使腫瘤細胞耐受阿霉素的殺傷作用，但詳細的機制需要進

14、一步證實。本實驗提示：1通過適當劑量的間歇的持續(xù)的沖擊應用抗腫瘤藥物，可以挑選出持續(xù)生長的細胞；2膽管癌細胞在阿霉素作用下，細胞內(nèi)的抗腫瘤藥濃度下降，這是腫瘤細胞在含抗腫瘤藥物的掊養(yǎng)液中生長繁殖的根底；3阿霉素可以影響細胞的分裂增殖周期。但該結論尚需今后進一步實驗得以證實。參考文獻1叢文銘，吳孟超，陳漢.肝內(nèi)膽管癌多基因變異表型分析J.中華醫(yī)學雜志，2001，81：271273.2JkbyB.ethdsinenzylgy.NeYrk:AadPress，1979.150.3吳小鵬，王占民，何曉冉.肝門部膽管癌細胞系FRH0201的建立及生物學特性研究J.中華醫(yī)學雜志,2022,85(25):17841785.4李志偉，王占民，吳小鵬，等.利用裸鼠建立人肝門部膽管癌肝門移植模型J.中國現(xiàn)代普通外科進展,2022,74:209.5UhiyaaKkubuN,atanabeT.Establishentandharaterizat