脂多糖誘導小鼠肝損傷介質(zhì)水平變化及五靈膠囊的作用

1、脂多糖誘導小鼠肝損傷介質(zhì)程度變化及五靈膠囊的作用【摘要】目的討論脂多糖LPS誘導小鼠肝損傷介質(zhì)程度變化及五靈膠囊的作用。方法小鼠尾靜脈注射ivLPS3.5g/kg，酶法檢測3，6，12和24h小鼠血清ALT、AST、ALP、TRIG，化學法測定肝組織內(nèi)DA、NS程度，免疫組化檢測肝組織內(nèi)TNF-，D14，iNS，eNS的陽性表達率。結(jié)果與正常組比擬,小鼠iv注射LPS后3h血清ALT，AST程度明顯升高并持續(xù)至12h，24h下降仍顯著高于正常組，ALP程度明顯持續(xù)下降。在12hDA含量顯著升高，24h下降但明顯高于正常組，而甘油三酯TG程度各時間點明顯升高，TNF-，D14，iNS，eNS陽性

2、表達率上調(diào)。五靈膠囊能明顯降低ALT，AST程度和DA含量，對ALP和TRIG程度無作用，抑制肝組織內(nèi)TNF-，D14，iNS，eNS陽性表達率。結(jié)論DA，TNF-，D14，iNS，eNS參與了LPS誘導肝損傷，五靈膠囊抑制LPS誘導肝損傷的作用機制與抑制活性遞質(zhì)生成有關(guān)。【關(guān)鍵詞】肝損傷一氧化氮合酶活性介質(zhì)脂多糖Abstrat：bjetiveTexplrethehangefediatrlevelsinhepatiinjuredieinduedbyLipplysaharide(LPS)andeffetsfulingapsule.ethdsLPSasgiventiebyinjetinithads

3、efLPS3.5g/kgviathetailvEin,3,6,12,24hurslater,thelevelsfALT,AST,ALPinserueredetetedbyenzyeethdandthententsfDA,NSinhepatitissuefieeredeterinedbyheistry,iunhistheistryethdaseplyedtdeterinetheexpressinfTNF-,D14,iNSandeNSinhepatitissue.Results3hursafterLPSasgiventie,paredithnralgrup,thelevelsfALTandASTe

4、rebviuslyelevatedandpersistedfr12hurs,andhiherereduedin24hursbutstillhighbviuslyasparedithnralgrup.ThelevelfALPereevidentlydereased,andthententfDAassignifiantlyinreasedat6hurandleredat24hursbutstillhigherthannral.ThelevelftriglyeridesasinreasedandtheexpressinfTNF-,D14,iNS,eNSinliverinjurytissueasark

5、edlyup-regulated.nlusinTheediatrsasDA,TNF-,D14,iNS,eNSpartiipatedinliverinjuryinduedbyLPS,theprtetiveehanisulingapsuleliverinjuryightberelatedithinhibitingthereleasefediatrs.Keyrds：Liverinjury;Nitrixidesynthase;Ativityediatrs;Lipplysaharid內(nèi)毒素血癥與肝損害可互為因果，從而對肝病的發(fā)生開展及預后產(chǎn)生重要的影響1。脂多糖lipplysaharideLPS致肝損傷

6、機制諸多學者認為：主要是通過激活枯否細胞KupfferellsK釋放細胞因子而介導肝細胞損害，LPS促進枯否細胞合成釋放TNF-,進而促進N生成加重肝損傷2。早期研究說明五靈膠囊對LPS誘導枯否細胞釋放細胞因子有明顯抑制作用3，五靈膠囊具有疏肝健脾，扶正活血的作用，對內(nèi)毒素血癥肝損傷及介質(zhì)TNF-，D14，iNS，eNS表達有無影響還未經(jīng)證實，本文對此進展了觀察，以便為臨床用藥提供根據(jù)。1材料動物：昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量252g，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學動物中心提供，動物合格證號：SK(軍)2002-05；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST、堿性磷酸酯酶ALP，甘油三酯TG,

7、膽固醇(hl)試劑盒北京中生；丙二醛DA,一氧化氮合酶NS試劑盒南京建成；Rabbitanti-D14，TNF-，NSiNS，NSeNS一抗武漢博士德；S-P超敏試劑盒福州邁新；脂多糖LPSSiga公司；五靈膠囊中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院藥劑科提供，批號：20220122，稱取五靈膠囊2g，蒸餾水加熱溶解至10l為經(jīng)口給藥供試液。2方法2.1LPS誘導小鼠肝損傷血清酶實驗取昆明小鼠96只，隨機分成3組每組設(shè)4個時間點：3，6，12，24h：正常組、LPS組、五靈膠囊組，每組每時間點8只。正常組和LPS組分別ig蒸餾水10l/kg，五靈膠囊組ig五靈膠囊2.0g/kg，各組小鼠ig給藥1

8、次/d，連續(xù)給藥5次，小鼠禁食自由飲水，末次給藥2h后正常組各時間點小鼠尾靜脈注射(iv)生理鹽水2l/kg，其余2組各時間點小鼠ivLPS3.5g/kg，iv后分別于3，6，12，24h眼眶取血，放置30in，離心，別離血清，酶法測定TRIG，ALT，AST，ALP。2.2肝組織內(nèi)DA、TRIG、NS測定和免疫組化實驗迅速取上述實驗小鼠肝臟剔去膽囊，用冰冷生理鹽水洗去血漬，濾紙吸干水分，除肝大葉外的肝組織制成10%肝勻漿，10000r/in離心，取上清按試劑盒說明書測定DA、TRIG、NS：肝大葉用10%甲醛0.01l/L磷酸緩沖液固定48h，石蠟包埋、切片，脫蠟至水洗,分別與抗D14、抗T

9、NF-、抗iNS、抗eNS1100進展孵育，按試劑盒操作說明進展免疫組化反響，用二氨基聯(lián)苯胺DAB-0.3lH22/L系統(tǒng)顯色10in。蘇木素襯染、脫水透明后，中性樹膠封片。陰性對照片用PBS替代一抗。結(jié)果評定：標本無明確陽性反響者為陰性，在40倍鏡下以iaspr圖象分析系統(tǒng)程序掃描染色陽性細胞,每只小鼠肝組織掃描5個視野計數(shù)陽性細胞，結(jié)果以陽性細胞率表示。2.3統(tǒng)計學處理采用SPSS10.0版統(tǒng)計軟件，所測數(shù)據(jù)以s表示，采用單因素方差分析。3結(jié)果3.1LPS誘導小鼠肝損傷不同時間血清酶的變化及五靈膠囊的作用血清酶學測試結(jié)果顯示，小鼠ivLPS后3h血清ALT值上升最高，隨著時間的延長其值逐漸

10、下降，在24hALT值有所降低但仍明顯高于正常組，AST程度3h升高，12h達最高，24h下降仍明顯高于正常組；ALP3h明顯下降，隨著時間的延長其值下降更低。與LPS組比擬，五靈膠囊組3h血清ALT和AST值高于LPS組，6h與LPS組一致，12h明顯低于LPS組，24h繼續(xù)下降，五靈膠囊對LPS導致小鼠肝內(nèi)ALP下降無作用。見表1。表1肝損傷小鼠不同時間血清酶的變化及五靈膠囊的作用略轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3.2對LPS誘導肝內(nèi)DA，TRIG，NS含量影響小鼠ivLPS后3h，與正常組比擬，肝內(nèi)DA含量升高，12h顯著升高并到達頂峰，24h下降但明顯高于正常組(P0.05)。小鼠LPS攻擊后

11、3h肝內(nèi)TRIG含量無變化，6hTRIG值上升(P0.05)，12h到達最高，24h下降但仍明顯地高于正常組(P0.05)。肝內(nèi)NS在3h上升，12h達最高(P0.05)，24h降至正常。與模型組比擬,五靈膠囊組各時間點DA含量均明顯低于LPS組。對LPS誘導小鼠肝內(nèi)TRIG和NS含量增加無降低作用,見表2。表2LPS誘導肝內(nèi)DA，TRIG，NS程度變化及五靈膠囊的作用略3.3對LPS誘導肝內(nèi)TNF-，D14，iNS，eNS表達的影響免疫組化染色結(jié)果顯示，正常小鼠肝組織表達微量的TNF-，D14，iNS，eNS，在不同的時間段內(nèi)陽性表達率大致恒定。與正常組比擬，小鼠ivLPS后不同時間點肝組織

12、內(nèi)TNF-陽性表達率持續(xù)急劇升高(P0.05)；D14在3h陽性表達率最高，6h有所下降，12h和24h又顯著升高(P0.05)；iNS，eNS陽性表達率高于正常值3倍，6h和12h下降，24h顯著升高。五靈膠囊在12，24h可明顯地降低TNF-，D14，iNS，eNS陽性表達率。見表3。表3LPS誘導肝內(nèi)TNF-，D14，iNS，eNS陽性表達的變化及五靈膠囊的作用略4討論以往研究顯示LPS致肝損傷機制主要是通過激活K釋放TNF-，IL-1，IL-8，PAF等細胞因子和介質(zhì)誘導肝細胞損害，同時也引起肝細胞各種代謝功能改變。有研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射LPS后肝細胞蛋白合成、糖代謝均受影響，最終可導致動

13、物死亡。本試驗顯示小鼠ivLPS后3h，ALT和AST程度明顯升高并持續(xù)至12，24h下降但仍顯著高于正常，ALP值那么與前二者相反而明顯地降低，隨著時間的推移而逐漸降低，肝細胞損傷嚴重ALP值就愈低。小鼠ivLPS后3h肝內(nèi)DA，NS和TRIG值升高并不顯著，6、12h3指標含量明顯增加，24hDA和TRIG值仍高于正常組，NS下降至正常。小鼠ivLPS3h血清酶ALT與AST明顯升高，說明肝細胞損傷開場，肝內(nèi)DA、NS和TRIG并未急劇升高，提示在3h內(nèi)反響肝損傷血清酶程度的上升與三介質(zhì)無關(guān)；在6，12，24h肝內(nèi)DA、NS與TRIG值明顯增加，血清ALT與AST程度也顯著升高，肝內(nèi)脂質(zhì)代

14、謝紊亂，提示在此時三者參與肝損傷。卞建明等4發(fā)現(xiàn)TNF-對肝細胞DNA的代謝呈雙相調(diào)節(jié)，低濃度TNF-有刺激DNA合成的作用，而高濃度的TNF不但使DNA合成受阻，還造成肝細胞損傷，TNF-可通過抑制線粒體呼吸鏈復合物而使肝細胞能量代謝障礙5。D14是K外表存在的受體，在LPB存在下D14與LPS結(jié)合并迅速與細胞膜上其他具有信號轉(zhuǎn)導才能的LPS相關(guān)受體如TLR2，2整合素、L-seletin等結(jié)合形成復合物，將LPS轉(zhuǎn)遞給這些信號轉(zhuǎn)導分子介導K激活分泌炎性細胞因子。誘導型N合酶iNS在生理情況下表達微量，只有在LPS和某些因子誘導下肝本質(zhì)和非本質(zhì)細胞才大量生成，從而產(chǎn)生持久的生理效應6。本實驗

15、顯示組織中TNF-，D14，iNS，eNS陽性表達率在324h持續(xù)高表達，與肝功酶程度波動一致，肝組織iNS、eNS陽性表達率與肝內(nèi)總NS的結(jié)果趨向一致。提示這些因子與介質(zhì)參與了肝損傷過程。五靈膠囊對3h肝功酶酶程度無作用，至6h逐漸影響LPS所致小鼠肝損傷，各肝功酶酶程度下降，至12h產(chǎn)生明顯的抑制作用，提示五靈膠囊并非直接作用血液內(nèi)肝功酶而使酶程度下降，而是作用于LPS損傷肝細胞的某些環(huán)節(jié)而降低ALT和AST程度。ALP來自細胞器功能酶，五靈膠囊不能阻止ALP下降提示其對LPS所致細胞器損傷無作用。五靈膠囊在12，24h明顯降低DA和NS含量，TNF-、D14、iNS、eNS陽性表達率下降，同時AST、ALT酶程度也相應下降，提示五靈膠囊抑制LPS所致肝損傷與降低炎性因子和介質(zhì)有關(guān)。實驗發(fā)現(xiàn)小鼠ivLPS后甘油三酯TG那么急劇上升，TRIG升高可能是LPS導致清道夫受體下調(diào)，干擾血清脂蛋白在肝內(nèi)修飾，甘油三酯在肝內(nèi)代謝的改變導致血清中TRIG升高，另一種可能是LPS引起胰島素抵抗造成脂質(zhì)紊亂，五靈膠囊不能抑制LPS誘導小鼠體內(nèi)TRIG升高，其原因有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1孫晶，李虹.慢性肝病患者血清細胞因子變化與臨床意義J.中國免疫學雜志，2000，167：390.2張明森，王宇明，顧長海，等.內(nèi)毒素誘導產(chǎn)生一氧化氮介導體外肝細胞損害J.解放軍醫(yī)學