茯苓多糖調(diào)節(jié)2型糖尿病模型大鼠肝臟糖異生的機制研究

1、茯苓多糖調(diào)節(jié)2型糖尿病模型大鼠肝臟糖異生的機制研究韓思婕 潘翔 朱芊芊 張丹丹 張涵瑞 方敬賢 魏瓊 劉丹 葉曉川關(guān)鍵詞茯苓多糖;2 型糖尿病;氧化應(yīng)激;PI3K/Akt/FoxO1通路;糖異生2 型糖尿病占糖尿病發(fā)病例數(shù)的90%以上，由2 型糖尿病導(dǎo)致的并發(fā)癥大多與患者的高病死率有關(guān)1-2。目前，臨床上用于治療糖尿病的雙胍類藥物具有明顯的副作用3。而中藥在治病救人方面有幾千年的歷史，更是在防治2 型糖尿病及其并發(fā)癥方面具有多靶點、多途徑、個體化等不可替代的優(yōu)勢，因此，尋找標(biāo)本兼治、副作用小、療效穩(wěn)定的中藥及其有效成分治療糖尿病是國內(nèi)外研究的重點。茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（

2、Schw.）Wolf的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾、寧心的功效4。糖尿病屬中醫(yī)“消渴癥”范疇，而茯苓是中醫(yī)治療消渴癥的高頻用藥5。茯苓多糖為茯苓菌核中的主要成分，占菌核質(zhì)量的70%80%6，具有抗腫瘤、抗炎、保肝、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用7。有研究報道，茯苓多糖能通過調(diào)節(jié)腸道菌群來改善肥胖小鼠的糖脂代謝，減輕肝臟脂肪變性8。多項研究表明，茯苓多糖可以減輕糖尿病腎病小鼠的腎損傷9-11。在生理條件下，機體血糖水平通過體內(nèi)葡萄糖產(chǎn)生和攝取間的動態(tài)平衡來維持穩(wěn)定。糖異生是將一些非糖前體，如乳酸、甘油、生糖氨基酸等轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程，肝臟糖異生是導(dǎo)致內(nèi)源性葡萄糖生成增加的重要原因，而2 型糖尿病患者中糖

3、異生作用異?；钴S12。目前已有研究證明，抑制肝臟糖異生是治療2型糖尿病的有效策略13。另有研究證實，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1（forkheadbox transcription factor O1，F(xiàn)oxO1）信號通路可調(diào)節(jié)肝臟糖異生14。本研究主要探討茯苓多糖是否可以通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/FoxO1 通路，抑制糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和葡萄糖-6- 磷酸酶（

4、glucose-6-phosphatase，G6Pase）的蛋白表達，進而調(diào)節(jié)2 型糖尿病模型大鼠血糖，以期為闡明茯苓多糖發(fā)揮降血糖的作用機制提供數(shù)據(jù)支持。1 材料1.1 儀器LiDE110 型凝膠成像儀購自日本Canon 公司;Spark10M型酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan 公司;Centrifuge 5810R型高速離心機購自德國Eppendorf 公司;530 活力型手持血糖儀購自江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司;WTM-1812D型膜分離實驗設(shè)備、ST-2B-1812 型微濾膜元件、V0.2-2B-1812 型超濾膜元件均購自杭州沃騰膜工程有限公司;FD-1A-50 型冷凍干燥機購自北京博醫(yī)康

5、實驗儀器有限公司;Eclipse E100 型光學(xué)顯微鏡、DS-U3 型成像系統(tǒng)均購自日本Nikon公司。1.2 藥材與試劑茯苓藥材采自湖北省英山縣石頭咀鎮(zhèn)，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院葉曉川教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓P.cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核。鹽酸二甲雙胍片（批號ABU7707，規(guī)格0.5 g/片）購自中美上海施貴寶制藥有限公司;鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，批號301V021，規(guī)格1 g）購自北京索萊寶科技有限公司;三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、糖化血紅蛋白（glycosylated h

6、emoglobin，HbA1c）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、肝糖原試劑盒（批號分別為20220423、20220426、20220422、20220420、20220425、20220426、20220420）均購自南京建成生物工程研究所;蘇木素-伊紅（HE）染液套裝、RIPA 裂解液（批號分別為G1003、CR2103126）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司;TBST緩沖液（批號21128946）購自合肥白鯊生物科技有限

7、公司;兔抗磷酸化PI3K（p-PI3K）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（批號分別為ab182651、ab181602）均購自英國Abcam 公司;兔抗磷酸化Akt（p-Akt）、兔抗磷酸化FoxO1（p-FoxO1）（批號分別為#4060、#9461）均購自美國CST 公司;兔抗G6Pase（批號LS-C446262）購自美國LSBio 公司;兔抗PEPCK（批號14892-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號AS1107）購自南非Aspen 公司;磷酸和氫氧化鈉均為食品級;水為純水。1.3 動物SPF 級SD 大鼠購自湖北省醫(yī)學(xué)實驗動

8、物中心，動物許可證號為SCXK（鄂）2022-0018，動物合格證號為42000600040888。動物實驗經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為HUCMS202203009。大鼠飼養(yǎng)于（202）、相對濕度50%70%、12 h 明暗交替環(huán)境中，自由飲水、攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后用于實驗。2 方法2.1 茯苓多糖的制備茯苓丁粉碎后經(jīng)80%乙醇回流提取2 次（提取時間分別為2、1 h），濾過，取濾渣，揮干至無醇味后用氫氧化鈉溶解，常溫下充分?jǐn)嚢韬筮^濾。濾液用磷酸調(diào)至pH=7，沉淀用純水洗滌數(shù)次，濾過后的洗滌液經(jīng)WTM-1812D型膜分離實驗設(shè)備微濾、超濾后，與上述沉淀合并，冷凍干燥后得茯苓多

9、糖。采用苯酚-硫酸法測得茯苓多糖含量為95.60%。2.2 分組、造模與給藥大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后，禁食4 h（每次禁食均換墊料以避免墊料內(nèi)遺漏有飼料，影響禁食效果），取大鼠尾尖靜脈血，用530 活力型手持血糖儀檢測空腹血糖，作為大鼠基礎(chǔ)血糖值。將大鼠按照禁食4 h 后基礎(chǔ)血糖水平組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）為標(biāo)準(zhǔn)，分為空白對照組、模型組、二甲雙胍組（陽性對照，劑量為200mg/kg）和茯苓多糖低、中、高劑量組（劑量分別為100、200、400 mg/kg），每組8 只，各給藥組的劑量依據(jù)來自前期預(yù)實驗。除空白對照組外，其余各組大鼠采用高脂飼料聯(lián)合STZ 誘導(dǎo)構(gòu)建2 型糖尿病大鼠模型：

10、大鼠飼喂高脂飼料，第21 天時禁食不禁水12 h，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果腹腔注射STZ 40 mg/kg;3 d 后檢測造模大鼠空腹血糖值均大于11.3 mmol/L，表明造模成功;繼續(xù)飼喂高脂飼料至第28 天，鞏固造模。造模同時，模型組和空白對照組大鼠每日灌胃等體積水，各給藥組大鼠每日灌胃相應(yīng)劑量的藥物，每日1 次，連續(xù)灌胃42 d。2.3 日常狀態(tài)觀察及體質(zhì)量檢測實驗期間觀察大鼠的飲水量、尿量、飲食量、毛色、精神狀態(tài)等情況，并每日測定大鼠的體質(zhì)量。2.4 空腹血糖檢測和口服葡萄糖耐量試驗各組大鼠在給藥前、給藥后（給藥結(jié)束前1 d）檢測空腹血糖?？诜咸烟悄土吭囼灒航o藥前1 d 禁食4 h 后取大鼠

11、尾尖靜脈血，用530 活力型手持血糖儀檢測灌胃葡萄糖前（0 h）的血糖;然后灌胃2.5 g/kg 葡萄糖，分別在灌胃0.5、2 h 時檢測血糖，計算口服葡萄糖耐量試驗曲線下面積（area under curve，AUC）：AUC=0.25（血糖0 h+4血糖0.5 h+3血糖2 h）。AUC越大說明2 型糖尿病模型大鼠對葡萄糖的代謝能力越弱，側(cè)面反映糖尿病的病程。2.5 臟器指數(shù)計算末次給藥后，取大鼠腹部主動脈血，再解剖得大鼠心臟、肝臟、腎臟組織，用生理鹽水清洗、濾紙擦拭、稱定質(zhì)量后，置于-80 冰箱保存。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量1 000。2.6 HbA1c、TG、TC、MDA、GSH-P

12、x、SOD水平及肝糖原含量檢測取“2.5”項下血樣和肝臟組織。用肝素抗凝管取全血24 mL，以1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，留沉淀的紅細(xì)胞，再用生理鹽水按上述方法洗滌23 次，得壓積紅細(xì)胞。取壓積紅細(xì)胞1 mL，加冷雙蒸水1.5 mL，用漩渦混勻器充分混勻1 min 制得溶血液，置于-20 冰箱保存，用于檢測HbA1c 水平。用普通采血管取全血5mL，以3 000 r/min 離心10 min，小心吸取上清液即為血清，置于-80 冰箱保存，用于檢測血脂指標(biāo)TG、TC水平和抗氧化指標(biāo)MDA、GSH-Px、SOD 水平。取肝臟組織約100 mg檢測肝糖原含量。各指標(biāo)檢測操作均嚴(yán)

13、格按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。2.7 肝臟和胰腺組織病理學(xué)觀察隨機選擇“2.5”項下每組3 只大鼠的肝臟和胰腺組織，用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，HE染色、二甲苯透明后，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞情況和胰島細(xì)胞變性壞死情況，并用顯微鏡照相系統(tǒng)拍照（每個樣品隨機選取3 個區(qū)域），進行病理學(xué)等級評分。其中肝臟病理等級評分采用Knodell 組織學(xué)活動指數(shù)評分系統(tǒng)并參考文獻15：級為界面性炎癥及橋接壞死的程度，按04 分評定;級為小葉內(nèi)肝細(xì)胞變性和壞死的范圍及匯管區(qū)的炎癥狀況，按04 分評定;級為纖維化程度，按04 分評定。胰腺病理等級評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻16：級為胰島形態(tài)損壞的程度，按

14、04分評定;級為胰島細(xì)胞排列紊亂及細(xì)胞核游離的程度，按04 分評定;級為胰島細(xì)胞數(shù)量減少及細(xì)胞壞死的程度，按04 分評定。以上評分越接近0 分代表病理程度越輕，越接近4分代表病理程度越重。2.8 肝臟組織PI3K/Akt/FoxO1 通路相關(guān)蛋白表達水平檢測采用Western blot 法檢測。取“2.5”項下部分凍存肝臟組織，加RIPA裂解液，冰浴徹底勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，振蕩，冰浴30 min，同時用移液器反復(fù)吹打，確保勻漿液完全裂解。以12 000 r/min 于4 離心5min，收集上清液，即為總蛋白溶液。取部分總蛋白溶液用BCA試劑盒測定總蛋白含量，剩余部分沸水浴5 min使

15、蛋白變性，變性后置于-80 冰箱保存，備用。取變性蛋白40 g，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，其中分離膠電壓80 V，濃縮膠電壓120 V;用0.45 m的PVDF膜300 mA轉(zhuǎn)膜90 min，用牛奶封閉1 h，分別加入p-PI3K、p-AKT、p-FoxO1、PEPCK、G6Pase 和GAPDH一抗（稀釋度分別為1 500、1 1 000、1 500、1 500、1 2 000、1 10 000），于4 孵育過夜;次日，用TBST 漂洗3 次，加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1 10 000），于常溫下繼續(xù)孵育1 h 后，用TBST漂洗3 次，滴加新鮮配制的ECL混合溶

16、液（魯米諾與過氧化氫體積比1 1 混合）至膜的蛋白面，暗室中曝光，根據(jù)不同的光強度調(diào)整曝光條件，顯影、定影。將膠片進行掃描存檔，采用AlphaEase FC 軟件處理系統(tǒng)導(dǎo)出目的蛋白和內(nèi)參GAPDH的灰度值，采用Excel 軟件計算，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。2.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以xs 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)=0.05。3 結(jié)果3.1 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠日常狀態(tài)和體質(zhì)量的影響實驗期間，大鼠均有較強的行動力?？瞻讓φ战M大鼠皮毛健

17、康有光澤，實驗前后飲食量幾乎無變化。模型組大鼠表現(xiàn)狂躁，出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，毛色不華，部分呈淺黃褐色并伴有掉毛現(xiàn)象，體質(zhì)量較空白對照組顯著減輕（P0.05）。給予相應(yīng)劑量藥物后，二甲雙胍組大鼠多飲、多食、多尿、毛色不華等狀態(tài)改善，但體質(zhì)量與空白對照組比較仍顯著減輕（P0.05），并伴有便溏現(xiàn)象。與模型組比較，茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠狂躁狀態(tài)改善，多飲、多食、多尿、毛色不華等現(xiàn)象得到緩解，體質(zhì)量回升，其中茯苓多糖中劑量組分別與模型組、二甲雙胍組比較，以及茯苓多糖高劑量組與二甲雙胍組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。結(jié)果見表1。3.2 茯苓多糖對2型糖尿病模型大鼠臟器指數(shù)的影響與空

18、白對照組比較，模型組大鼠肝臟、腎臟臟器指數(shù)均顯著升高（P0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組大鼠腎臟臟器指數(shù)和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝臟（除茯苓多糖低劑量組外）、腎臟臟器指數(shù)均顯著降低（P0.05）。結(jié)果見表1。3.3 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠口服葡萄糖耐量的影響灌胃葡萄糖溶液00.5 h 期間，各組大鼠的血糖水平均呈逐漸增加的趨勢;而在灌胃0.52 h 期間，其血糖水平又均呈逐漸降低的趨勢。與空白對照組比較，模型組大鼠在灌胃葡萄糖溶液0、0.5、2 h 時的血糖水平和AUC均顯著升高（P0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低（除0 h 時外）、中、高劑量組大鼠在灌胃葡萄

19、糖溶液0、0.5、2 h 時的血糖水平和AUC均顯著降低（P0.05）。結(jié)果見表2。3.4 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠空腹血糖和HbA1c的影響給藥前，各組大鼠空腹血糖水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。給藥后（給藥結(jié)束前1 d），與空白對照組比較，模型組大鼠空腹血糖、HbA1c 水平均顯著升高（P0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖中、高劑量組大鼠空腹血糖水平，以及二甲雙胍組和茯苓多糖中劑量組大鼠HbA1c 水平均顯著降低（P0.05）。結(jié)果見表3。3.5 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠血脂水平、抗氧化水平及肝糖原含量的影響與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、M

20、DA水平和肝糖原含量顯著升高，GSH-Px、SOD 水平顯著降低（P0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠TC、TG、MDA水平和肝糖原含量均顯著降低，SOD水平顯著升高（P0.05）;茯苓多糖中劑量組大鼠GSH-Px 水平顯著升高（P0.05）。結(jié)果見表4。3.6 肝臟和胰腺組織病理學(xué)觀察結(jié)果大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果見圖1。由圖1 所示，空白對照組大鼠肝小葉形狀規(guī)則，肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝索排列整齊、呈放射狀分布。模型組大鼠肝小葉不明顯，肝細(xì)胞排列散亂，肝索結(jié)構(gòu)消失，肝竇擴大，細(xì)胞間呈不同程度的皺縮，導(dǎo)致空泡較多，可見淋巴細(xì)胞浸潤。二甲雙胍組大鼠肝索明顯，但中央靜脈周

21、圍有巨噬細(xì)胞，表明肝細(xì)胞有炎癥。茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝索和肝竇結(jié)構(gòu)較模型組有所恢復(fù)，細(xì)胞皺縮情況均有所改善。各組大鼠肝臟病理等級評分見表5。由表5可知，與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟病理等級評分均顯著升高（P0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝臟病理等級評分均顯著降低（P0.05）。大鼠胰腺組織HE染色結(jié)果見圖2。由圖2 所示，空白對照組大鼠胰島形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、呈橢圓形，細(xì)胞排列整齊、孔隙較小，細(xì)胞核大小相差不大。模型組大鼠胰島形態(tài)被破壞、變形呈葫蘆狀，中央可見空亮區(qū)和許多空泡，細(xì)胞核大小不一且游離于細(xì)胞邊緣。二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠胰島

22、形態(tài)、細(xì)胞核情況較模型組均有所改善。各組大鼠胰腺病理等級評分見表6。由表6 可知，與空白對照組比較，模型組大鼠胰腺病理等級評分均顯著升高（P0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠胰腺病理等級評分均顯著降低（P0.05）。3.7 茯苓多糖對2 型糖尿病模型大鼠肝臟組織中PI3K/Akt/FoxO1 通路相關(guān)蛋白表達的影響與空白對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中p-PI3K、p-Akt、p-FoxO1 蛋白表達水平均顯著降低（P0.05），PEPCK、G6Pase蛋白表達水平均顯著升高（P0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和茯苓多糖低、中、高劑量組大鼠肝臟組織中p-PI

23、3K、p-Akt、p-FoxO1（除茯苓多糖低劑量組外）蛋白表達水平均顯著升高（P0.05），PEPCK、G6Pase蛋白表達水平均顯著降低（P0.05）。結(jié)果見圖3、圖4。4 討論本研究采用高脂飼料聯(lián)合STZ構(gòu)建了2 型糖尿病大鼠模型，所得模型大鼠常伴有血脂異常、體質(zhì)量減輕，且伴有HbA1c 水平持續(xù)升高等癥狀，與以往文獻一致17。體質(zhì)量下降被認(rèn)為是糖尿病的典型特征，這與葡萄糖代謝缺陷和組織蛋白過度分解有關(guān)，而HbA1c 常作為糖尿病控制的監(jiān)測指標(biāo)18。在糖尿病的發(fā)生過程中，高血糖、高胰島素血癥和游離脂肪酸升高均可誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，而強氧化環(huán)境可能會導(dǎo)致胰島素抵抗等生理功能障礙和糖尿病并發(fā)癥發(fā)

24、生19。本研究結(jié)果顯示，茯苓多糖給藥后，能夠恢復(fù)大鼠體質(zhì)量，顯著降低2 型糖尿病模型大鼠的空腹血糖、HbA1c 水平，改善葡萄糖耐受情況，減輕氧化應(yīng)激水平。此外，茯苓多糖還可降低2 型糖尿病模型大鼠血清中的TC、TG 水平，遏制糖尿病病程中因糖脂代謝異常導(dǎo)致的膽固醇代謝異常，減輕胰腺組織的結(jié)構(gòu)破壞，從而發(fā)揮保護胰島細(xì)胞的作用。肝臟在能量平衡中起著至關(guān)重要的作用，而糖尿病病程發(fā)展中容易引起肝臟相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡20。因此，肝臟損傷程度和肝糖原含量間接反映了機體的胰島素活性和糖代謝能力21。本研究中，模型組大鼠肝糖原含量顯著升高，肝臟病理切片顯示肝細(xì)胞形態(tài)改變，肝小葉不明顯，肝細(xì)胞排列散亂，肝索結(jié)構(gòu)消失，肝竇擴大，表明2 型糖尿病模型大鼠的肝臟損傷可