葉酸介導(dǎo)靶向砒霜納米粒的實(shí)驗(yàn)研究

1、葉酸介導(dǎo)靶向砒霜納米粒的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的研究葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白的合成工藝，制備包裹砒霜的白蛋白納米粒并檢驗(yàn)其對靶細(xì)胞的殺傷作用。方法葉酸在縮合劑的作用下與牛血清白蛋白偶聯(lián)，通過正交設(shè)計(jì)選擇最正確配方；用去溶劑法制備包裹砒霜的納米粒，并觀察其對靶細(xì)胞特異性殺傷作用。結(jié)果采用最正確條件合成的葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白的偶聯(lián)率為30.31g/g，納米粒的砒霜包封率為10.3%，對靶細(xì)胞殺傷率為97%，對非靶細(xì)胞的殺傷力僅為23%。結(jié)論包裹有砒霜的葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白納米粒簡稱F-BSANP對靶細(xì)胞有特異性殺傷作用?！娟P(guān)鍵詞】砒霜；納米粒；葉酸；牛血清白蛋白Abstrat：bjetiveTstudyt

2、hesynthetipredurefflate-njugatedbvineserualbuin(F-BSA)andpreparatinfalbuinnanpartilesentrappingarsenitrixide，andtexainethepeuliartxiityfnanpartilesntargetingells.ethdsFliaidasnjugatedtbvineserualbuinviandensingagent，estudiedthebestsynthetifrulafF-BSAbytherthgnaltestdesignThenanpartileserepreparedbyd

3、eslvatinethd，andthepeuliartxiityfF-BSANPnA549asstudiedResultsTheaveragenjugatingratefflateinF-BSAadeinthebestfrulaas30.31g/gTheentrappingratefarsenitrixideas8.34%eexainedthepeuliartxiityfF-BSANPntargetingellsandntrlgrupells，respetively，andthedeathrateftargetingellsas97perent,hereasthatfntrlgrupasnly

4、23perentnlusinF-BSANPispeuliartthEirtargeting-ellsKeyrds：Arsenitrixide；Nanpartiles；Flate；Bvineserualbuin腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命和安康的常見病和多發(fā)病，是導(dǎo)致殘疾和早死的主要疾病之一。目前，臨床使用的抗腫瘤化療藥物均有較大的毒副作用，有些嚴(yán)重的毒副反響是限制藥物劑量或使用的直接原因。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等)膜外表上的葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于一般正常細(xì)胞，這為葉酸受體介導(dǎo)藥物靶向于腫瘤細(xì)胞的研究奠定了根底1。中藥砒霜三氧化二砷是中藥中的傳統(tǒng)毒藥，近年來有關(guān)

5、其抗腫瘤作用，尤其是在我國率先開展的三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL)的研究引起了人們的廣泛興趣；研究已發(fā)現(xiàn)砒霜能顯著抑制人肺癌的細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡2。但是,在治療過程中的嚴(yán)重毒副作用是影響其抗癌療效的主要原因。本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)中藥砒霜為治療藥物，將其包裹在用葉酸偶聯(lián)白蛋白制成的納米粒中，并進(jìn)展其對靶細(xì)胞殺傷作用的研究。為以后制備其它抗癌藥靶向制劑作鋪墊。1材料人肺癌細(xì)胞株A549購于武漢大學(xué)生命科學(xué)院中國典型培養(yǎng)物保藏中心；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；別離自正常人骨髓血骨髓血樣由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院一附院血液科提供；牛血清白蛋白上海新量化工試劑；葉酸上海新量化工試劑；1-乙基-3-3-二甲氨丙基

6、碳二亞胺鹽酸鹽簡稱EDHl上海三杰生物技術(shù)；SephadexG-25Pharaia；三氧化二砷購自上?；瘜W(xué)試劑采購供給站，P；胎牛血清杭州四季青生物工程材料；RPI1640培養(yǎng)基Gib；胰蛋白酶1250Ares。2方法和結(jié)果2.1葉酸偶聯(lián)白蛋白的合成2.1.1葉酸偶聯(lián)白蛋白的合成與別離將葉酸溶于pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，參加EDHl后攪拌活化5in，再參加50g/l牛血清白蛋白的PBS溶液，攪拌下反響數(shù)小時(shí)即得3。將反響液過SephadexG-25柱，搜集前段淡黃色有乳光局部4。2.1.2因素和程度確實(shí)定經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料和大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定葉酸用量、EDHl與葉酸摩爾比、反響時(shí)

7、間3因素各取3程度優(yōu)化工藝。見表1。表1因素程度略2.1.3評價(jià)指標(biāo)的選取與測定葉酸與牛血清白蛋白偶聯(lián)越多，納米粒對腫瘤的靶向性就越高。因此選擇葉酸與牛血清白蛋白偶聯(lián)率作為評價(jià)指標(biāo)。偶聯(lián)率的測定，將葉酸偶聯(lián)白蛋白溶于pH7.4的PBS中，用2.5%的胰蛋白酶消化2h后離心取上清液于358n處測紫外吸收。標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，計(jì)算偶聯(lián)率。偶聯(lián)率=被偶聯(lián)的葉酸量/g被偶聯(lián)的牛血清白蛋白量/g2.1.4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果按正交設(shè)計(jì)表L9(34)進(jìn)展實(shí)驗(yàn)，計(jì)算偶聯(lián)率見表2，方差分析結(jié)果見表3。表2正交設(shè)計(jì)略表3方差分析表略X1，X2和X3分別是各因素程度1、程度2、程度3偶聯(lián)率之和；X是各因素內(nèi)部程度1、程度2、

8、程度3偶聯(lián)率之和的最大差距由表34可見,在考察的3個(gè)因素中,ED/flate影響最大(P0.05),而葉酸用量與反響時(shí)間幾乎沒有影響(P0.05),葉酸偶聯(lián)白蛋白合成工藝最正確程度組合為A3B31，以該工藝制備的葉酸偶聯(lián)白蛋白的葉酸偶聯(lián)率為30.31g/g。2.2納米粒的制備2.2.1砷標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定按新銀鹽法5測定并計(jì)算砷標(biāo)準(zhǔn)曲線，=9.106A+0.9083，r=0.9939，RSD為2.41%。在16g濃度范圍內(nèi)，線性良好。2.2.2載藥納米粒的制備6As23溶于牛血清白蛋白溶液中，調(diào)節(jié)pH值微堿性，室溫下緩緩參加無水乙醇，攪拌30in后再緩緩參加戊二醛溶液7，固化12h即得。制得包封率

9、為10.3%的納米粒。2.2.3包封率的測定取載藥納米粒用pH7.4的PBS分散，參加2.5%的胰蛋白酶消化2h，離心后取上清液新銀鹽法測定其吸光度A值，計(jì)算出砷含量。包封率%=納米粒中所包裹的As23量投入As23的量100%2.2.3空白回收率和加樣回收率的測定經(jīng)測定，空白回收率為100.8%，加樣回收率為97.9%。2.2.4納米粒的形態(tài)觀察和粒徑納米粒分散于蒸餾水中，用HITAHIH-600透射電子顯微鏡觀察粒子形態(tài)，并拍攝照片。納米粒形態(tài)圓整，分布均勻，粒徑大約200n左右。見圖12。2.3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)8將A549細(xì)胞培養(yǎng)于10%小牛血清的1640培養(yǎng)基中。設(shè)立空白對照組加生理鹽水、

10、載藥葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒3個(gè)劑量組10，1，0.1g/l、阻斷組(載藥1g/l的葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒+葉酸)、載藥白蛋白納米粒(BSANP)組1g/l、砒霜組1g/l。培養(yǎng)24h后，TT法測定各孔及本底A490，計(jì)算細(xì)胞抑制率。取正常人骨髓血3l，培養(yǎng)數(shù)天后別離貼壁細(xì)胞即得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞9。同法操作計(jì)算細(xì)胞抑制率。結(jié)果見表4。表4靶細(xì)胞與非靶細(xì)胞的抑制率(略)用t檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)展分析，結(jié)果顯示包裹砒霜的F-BSANP對靶細(xì)胞的抑制作用較非靶細(xì)胞明顯；較BSANP組，葉酸阻斷組與砒霜組也顯示出非常高的抑制作用，差異具有顯著性。3討論本實(shí)驗(yàn)中選擇人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為對照用的非靶細(xì)胞，主要是

11、因?yàn)槿斯撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖分化才能，與腫瘤細(xì)胞有相似之處。包裹有砒霜的F-BSANP組對靶細(xì)胞的殺傷作用較非靶細(xì)胞、BSANP組和砒霜組明顯，證明F-BSANP對靶細(xì)胞具有特異性殺傷作用；而包裹有砒霜的F-BSANP組對靶細(xì)胞的殺傷作用較葉酸阻斷組明顯也從側(cè)面證明納米粒的靶向性是通過葉酸介導(dǎo)入細(xì)胞而發(fā)揮作用；葉酸阻斷組和BSANP組也存在顯著差異，這可能是因?yàn)槿~酸和葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒與葉酸受體是競爭性結(jié)合，在這個(gè)過程中也有局部葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒與葉酸受體結(jié)合而把藥物介導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中，在溫和的條件下成功合成葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白；在保證生理活性的前提下制備的偶聯(lián)物可以做為靶向制

12、劑的一種高分子材料，對傳統(tǒng)中藥砒霜進(jìn)展包裹制成的納米粒具有明顯的主動(dòng)靶向性，并且平安性高；在體內(nèi)的過程及體內(nèi)的藥效有待于進(jìn)一步的研究。另外，以葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒做為載體將市場上的抗腫瘤藥物進(jìn)展二次開發(fā)，應(yīng)用前景廣闊。【參考文獻(xiàn)】1LeanP，ReddyJAFlate-targetedhetherapyJ.AdvDrugDelivRev，2022，56(8)：1127.2SngHJ，GuZY，HaHJ，etalEffetsfarsenitrixidentalityandexpressinfuPA、uPAR、RNAinhuanPUL-narygiantellarinaelllinePLA-801

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