端腦腹側(cè)的膽堿能前體細胞的胚胎來源

1、端腦腹側(cè)的膽堿能前體細胞的胚胎來源【摘要】目的為探究膽堿能神經(jīng)元的胚胎來源，驗證放射狀膠質(zhì)細胞是否表達乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶。方法通過對孕14天E14大鼠胚胎端腦冠狀石蠟切片進展波形蛋白放射狀膠質(zhì)細胞標志性蛋白，vientin和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(膽堿能神經(jīng)元的標志性蛋白hAT)雙重?zé)晒饷庖呓M織化學(xué)染色，并通過重疊同一視野內(nèi)的熒光雙染的圖片來準確地表達放射狀膠質(zhì)細胞表達hAT的位置。結(jié)果E14大鼠端腦腹側(cè)腦室區(qū)有部分組織呈vientin/hAT免疫化學(xué)雙染陽性，這和資料中證實的膽堿能神經(jīng)元E14天出現(xiàn)于第三腦室的腹背側(cè)部的結(jié)論是一致的。結(jié)論E14大鼠端腦內(nèi)的放射狀膠質(zhì)細胞表達hAT。說明放射狀膠質(zhì)細胞具有

2、神經(jīng)干細胞性質(zhì)，它不斷地進展不對稱分裂，產(chǎn)生膽堿能表型的成神經(jīng)細胞，即膽堿能前體細胞?！娟P(guān)鍵詞】膽堿能神經(jīng)元；放射狀膠質(zhì)細胞；乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶；波形蛋白Abstrat:bjetiveTexplretheebrynisurefhlinergineurnsandtverifyhethertheradialglialellsanexpressaetylhlinetransferase.ethdsrnaryparaffinsetinsfrattelenephalnnebryni14days(E14)ereprepared.Dublefluresentandiunhistheialstainingfvie

3、ntin(aprtEinarkerfradialglialell)andhlineaetyltransferase(hAT,aprtEInarkerfhlinergineurn)ttesthetherhATasexpressedintheppulatinfradialglialellinviv.verlappedpituresinthesaefieldfvisinrefletedthepreisepsitinheretheradialglialellsexpressedhAT.ResultsVientin-psitiveellsexpressedhATinventralganglinieine

4、neinE14rats,hihasnsistentiththenlusininpreviusreprtsthathlinergineurnseergedinthedrsalrventralsidefthethirdventrilentheE14day.nlusinIntheE14rattelenephalbrainhATasexpressedintheradialglialellppulatin.Thisresultsuggestedthatradialglialellshadtheprpertyfneuralsteellsandntinuallyunderentasyetrialelldiv

5、isintgenerateneurnblastsithhlinergiphentype,rhlinergipreursrs.Keyrds：hlinergineurn;radialneurgliaells;hlineaetyltransferase;vientin膽堿能神經(jīng)元是重要的功能神經(jīng)元，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓、腦干、大腦皮質(zhì)及基底神經(jīng)核內(nèi)。生物體的多種生理活動均有膽堿能神經(jīng)元的參與，如學(xué)習(xí)和記憶、覺悟和睡眠、體溫調(diào)節(jié)、攝食和飲水、感覺和運動、心血管活動的調(diào)節(jié)等1。因此，人體內(nèi)的多種行為功能紊亂均涉及到膽堿能系統(tǒng)的功能失衡或病變。要徹底攻克這些相關(guān)疾病，首先要認識和理解膽堿能神經(jīng)元的

6、胚胎來源、發(fā)活力制等問題，只有理解了體內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育規(guī)律，才能有時機找到治療此類疾病的有效途徑。盡管目前對分布在大腦內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元的時空定位已經(jīng)明確，但是，對它們的來源仍然不清楚。有資料證實，在神經(jīng)元發(fā)生期大鼠為E1218，腦室區(qū)內(nèi)9698%的細胞均為放射狀膠質(zhì)細胞，可是放射狀膠質(zhì)細胞怎么會表達乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(hAT)呢？以前的觀點認為，放射狀膠質(zhì)細胞產(chǎn)生成神經(jīng)細胞后，成神經(jīng)細胞沿著其突起遷移，到達目的地方能表達其功能神經(jīng)元表型2-4。我們推測端腦腦室區(qū)表達hAT的有絲分裂細胞可能就是放射狀膠質(zhì)細胞，端腦中的膽堿能神經(jīng)元可能來源于腦室區(qū)放射狀膠質(zhì)細胞。因此，我們擬通過E14大鼠端

7、腦冠狀切片觀察放射狀膠質(zhì)細胞是否表達膽堿能神經(jīng)元的標志性蛋白hAT，為端腦膽堿能神經(jīng)元可能來源于腦室區(qū)放射狀膠質(zhì)細胞這一判斷尋找實驗證據(jù)。1材料和方法1.1材料1.1.1試劑和主要儀器兔抗大鼠hAT抗體多克隆，武漢博士德公司；小鼠抗大鼠波形蛋白vientin抗體單克隆，BiGenex；免疫組化SP染色試劑盒，福州邁新公司；TRIT-anti-rabbitIgG，北京中山試劑公司；FIT-anti-useIgG，北京中山試劑公司；YL3A型回轉(zhuǎn)式石蠟切片機，德國Leika；病理組織漂烘處理儀，江蘇常州中德電子儀器廠；熒光顯微鏡，日本lypus。1.1.2實驗動物雌性安康istar大鼠，體重(24

8、010)g，雄性安康istar大鼠，體重(30010)g；由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。雌性與雄性istar大鼠在下午5點以后以21比例合籠交配，以次日清晨鏡檢查到陰栓或精子之日算為妊娠第0天E0。1.2方法1.2.1動物取材及石蠟切片標本制備妊娠1218天大鼠分別乙醚麻醉，灌流固定，取出胚胎后，迅速將胎腦置于Buins固定液中2h,組織根本硬化后進展修塊。然后繼續(xù)固定6h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋。1.2.3端腦冠狀切片免疫熒光組化雙重染色取E14大鼠端腦石蠟包埋塊進展冠狀切片，預(yù)實驗對hAT免疫反響陽性細胞已進展定位切片，切片厚度為5，置于60烤箱5h。將切片脫蠟和水化

9、，0.01胰蛋白酶修復(fù)抗原，37，30in；0.3%TritnX-100孵育RT20in；非免疫山羊血清封閉，RT，30in；vientin抗體與hAT抗體混合稀釋兩抗體效價均為1200，滴加2種混合一抗，4過夜孵育；參加FIT-anti-useIgG1100，RT，45in；滴加TRIT-anti-rabbitIgG1100，RT，45in；除山羊血清封閉后無需漂洗外，以上每一步驟后均需0.01l/LPBS充分漂洗；最后防熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察，并拍照。2結(jié)果2.1端腦冠狀切片免疫熒光組化雙重染色熒光顯微鏡下，激發(fā)光在藍光波長范圍時，vientin免疫反響陽性部位呈綠色熒光，顯

10、示放射狀膠質(zhì)細胞的雙極長突起；激發(fā)光在綠色波長范圍時，hAT免疫反響陽性部位呈紅色熒光，顯示膽堿能前體細胞表型。在Phtshp軟件支持下，把以上2張同一視野照片重疊，可見E14大鼠端腦側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起存在vientin和hAT免疫反響雙陽性細胞群圖1，兩者共存的部位呈黃色熒光。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.A.E14大鼠端腦腦室區(qū)冠狀切面，框內(nèi)所指區(qū)域為端腦腹側(cè)100；B.腹側(cè)端腦腦室區(qū)細胞呈hAT免疫化學(xué)染色陽性400；.腹側(cè)端腦腦室區(qū)細胞呈vientin免疫細胞化學(xué)染色陽性400；D.腹側(cè)端腦腦室區(qū)細胞呈vientin/hAT免疫化學(xué)雙染陽性4003討論在本課題組的前期實驗中，我們采用免疫組織化學(xué)SA

11、B法來證實在端腦切片中vientin和hAT在同一細胞中共存，但是，由于E14大鼠端腦細胞極小，其中核又占據(jù)整個細胞大約9/10的體積，表達在胞質(zhì)中的2種蛋白很難用此方法識別。因此，我們選擇免疫熒光組織化學(xué)方法，即一種蛋白免疫反響后發(fā)出綠色熒光，另一種蛋白免疫反響后發(fā)出紅色熒光，2種熒光疊加產(chǎn)生黃色熒光，此種方法可使2種共存的蛋白顯而易見；從而增加了實驗結(jié)果的可信度。實驗在E14大鼠端腦冠狀切片中發(fā)現(xiàn)端腦腹側(cè)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起腦室區(qū)存在vientin和hAT免疫反響雙陽性細胞群。端腦腹側(cè)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起是基底神經(jīng)節(jié)中紋狀體發(fā)生的原基，紋狀體部分環(huán)路中間神經(jīng)元和基底前腦系統(tǒng)的投射神經(jīng)元均為膽堿能神經(jīng)元，前

12、者通過調(diào)節(jié)紋狀體內(nèi)的-氨基丁酸能投射神經(jīng)元控制運動行為；后者的軸突投射到新皮質(zhì)和海馬參與認知功能。這兩類膽堿能神經(jīng)元來源于端腦腹側(cè)，它們的遷移遵循著投射神經(jīng)元放射狀遷移到基底神經(jīng)核，中間神經(jīng)元切線式遷移到紋狀體5-7。我們的實驗結(jié)果提示，端腦腹側(cè)側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起腦室區(qū)的部分放射狀膠質(zhì)細胞可以產(chǎn)生膽堿能前體細胞。至于產(chǎn)生膽堿能前體細胞后如何進展遷移，尤其是膽堿能中間神經(jīng)元的切線式遷移，還不清楚。然而，在實驗中觀察到，放射狀膠質(zhì)細胞的長突起不僅垂直于側(cè)腦室分布，而且還有些遠離腦室區(qū)的長突起平行于側(cè)腦室形成弧形資料沒有顯示，推測可能是膽堿能中間神經(jīng)元仍然是沿著弧形的放射狀膠質(zhì)細胞長突起切線式遷移到目的地

13、。但是，這與先前文獻報道的切線式遷移是成神經(jīng)細胞沿著軸突或其他神經(jīng)元平行挪動，即嗜神經(jīng)細胞遷移不相吻合。其結(jié)論有待于進一步證實。我們的實驗資料還提示，端腦腦室區(qū)的放射狀膠質(zhì)細胞根據(jù)本身所處位置可能分為多種亞群，每一種亞群將產(chǎn)生不同類型的功能神經(jīng)元。那么，是否所有區(qū)域分布的神經(jīng)元均由放射狀膠質(zhì)細胞產(chǎn)生呢？在本課題組先前的實驗中觀察到，E14大鼠第三腦室的部分單層柱狀室管膜細胞也表達hAT，但不表達vientin，這些表達hAT的細胞逐漸增殖使部分上皮變?yōu)閺?fù)層，深層的細胞遷移進入周圍組織資料沒有顯示。所以，并不是所有區(qū)域的膽堿能神經(jīng)元均來源于放射狀膠質(zhì)細胞。放射狀膠質(zhì)細胞的這種性質(zhì)給神經(jīng)干細胞的應(yīng)

14、用帶來了極大的困難，它的異質(zhì)性使別離的神經(jīng)干細胞分化受到限制，而別離放射狀膠質(zhì)細胞亞群可能會有價值。但是，由于每一亞群細胞數(shù)量有限，不能滿足其需求?？傊?，本實驗的結(jié)果使我們理解了端腦發(fā)生區(qū)域性特化的深入內(nèi)涵，具有異質(zhì)性的神經(jīng)干細胞嚴格按照一定時空規(guī)律產(chǎn)生腦發(fā)育所需的不同細胞類型。這種機制可能取決于兩方面：一是遺傳所決定的端腦不同區(qū)域細胞群表達不同的同源域轉(zhuǎn)錄因子；二是不同區(qū)域細胞群所處微環(huán)境中細胞因子的誘導(dǎo)作用，兩者互相作用調(diào)控神經(jīng)元干細胞的增殖和分化?！緟⒖嘉墨I】1daY,NakanishiI.Thedistributinfhlinergineurnsinthehuanentralnervu

15、ssysteJ.HistlHistpathl，2000,15(3):825-834.2Shuurans,GuilletF.leularehanissunderlyingellfatespeifiatininthedevelpingtelenephalnJ.urrpinNeurbil,2002,12(1):26-34.3RsenasserA.FuntinalneuranatyfsleepandiradianrhythsJ.BrainResRev,2022,61(2):281-306.4lfNJ.ApssiblerlefrhlinergineurnsfthebasalfrebrainandpntesenephalninnsiusnessJ.nsiusgn,1997,6(4):574-596.5ParnavelasJG,NadarajahB.Radialglialells:aretheyreallygliaJ.Neurn,2001,27(31):881-884.6