化妝品中11種二苯酮類紫外線吸收劑的檢測方法

1、附件 2：化妝品中 11種二苯酮類紫外線吸收劑的檢測方法（征求意見稿）適用范圍本方法規(guī)定了化妝品中11 種二苯酮類紫外線吸收劑測定的高效液相色譜法。本方法適用于膏霜類、乳液類、水劑類、唇膏等蠟基類、指甲油類、粉類等化妝 品中11 種二苯酮類紫外線吸收劑的含量測定。本方法對11種二苯酮類紫外線吸收劑的檢出限和定量限及稱取0.1 g樣品，定容 體積為10 mL時的檢出濃度及最低定量濃度見表1：表1 11種二苯酮類紫外線吸收劑的檢出限、檢出濃度、定量下限、最低定量濃度序號化合物名稱檢出限（昭/mL）檢出濃度（昭/g）定量下限（昭/mL）最低定量濃度（gg/g）1二苯酮-10.0454.50.1515

2、2二苯酮-20.0454.50.15153二苯酮-30.0606.00.20204二苯酮-4/50.020200.70705二苯酮-60.0606.00.20206二苯酮-70.30301.01007二苯酮-80.0454.50.15158二苯酮-90.0454.50.15159二苯酮-100.0606.00.202010二苯酮-120.0808.00.2727方法提要采用四氫呋喃-甲醇-水體系，以適當比例的 3 種溶劑為提取溶劑，提取化妝品 中二苯酮類紫外線吸收劑，用高效液相色譜法進行測定。以目標物的色譜保留時間 和紫外光譜圖與標準物質(zhì)一致進行定性，以色譜峰的峰面積用標準曲線外標法進行 定量

3、計算。必要時，采用高效液相色譜-質(zhì)譜方法（HPLC-MS/MS）進行確證。試劑和材料 除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，水為超純水。3.1標準物質(zhì)英文名稱、CAS號、分子式、分子結(jié)構(gòu)式、分子量、純度見附錄A甲醇，色譜純。甲酸，色譜純。醋酸銨，色譜純。3.5標準儲備溶液：分別準確稱取各標準物質(zhì)100 mg （以上質(zhì)量均精確至0.1 mg） 于棕色容量瓶中，用四氫咲喃溶解后定容至10 mL （二苯酮-9除外），配置成濃度為 10 mg/mL的標準儲備液于冷藏條件下保存。二苯酮-9用40%甲醇水定容至10 mL,配 置成濃度為10 mg/mL的標準儲備液于冷藏條件下保存。所有儲備液的保存期為3個 月

4、。儀器和設備高效液相色譜儀,具有二極管陣列檢測器。4.2高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀配置ESI離子源（確證時使用）。超聲波清洗器.蝸旋混合器。離心機。4.6分析天平：感量分別為0.1 mg和0.01 mg。分析步驟樣品預處理二苯酮-9測試的樣品前處理稱取樣品約0.1 g （精確至0.001g）于25 mL離心管中，對水易分散的化妝品， 首先向離心管中準確加入10 mL水，渦旋或超聲使其均勻分散后，再向離心管中加 入4 mL二氯甲烷，渦旋12 min混勻，然后于5000轉(zhuǎn)/分離心5 min，取上層溶液2 mL,經(jīng)微孔濾膜過濾后，待測。對水不易分散的化妝品，首先向離心管中加入4 mL二氯甲烷

5、，渦旋或超聲使其 均勻分散后，再向離心管中準確加入10 mL水，渦旋12 min，混勻提取，然后于 5000轉(zhuǎn)/分離心5 min，其他步驟與上面相同。除二苯酮-9 外其他二苯酮類防曬劑測試的樣品前處理稱取樣品約0.1 g （精確至0.OOlg）于25 mL具塞刻度試管中，向試管中加入2 mL 四氫咲喃，渦旋混勻提取，再向試管中加入75%甲醇水溶液定容至10 mL,渦旋12 min,然后于5000轉(zhuǎn)/分離心5 min， 取2 mL混合溶液，經(jīng)聚丙烯微孔濾膜過濾后，待 測。對唇膏等蠟基化妝品，首先向試管中加入2 mL四氫咲喃，渦旋或超聲使樣品完 全分散。若不能分散一般適當超聲可解決問題，對超聲15

6、 min仍無法分散的樣品，需 用60 C水浴，振蕩加熱約12分鐘即可溶解分散。繼續(xù)向試管中加入75%甲醇水溶 液定容至10 mL，渦旋混合，然后于5000轉(zhuǎn)/分離心5 min，其他步驟與上面相同。分析步驟5.2.1 色譜參考條件色譜柱：C8柱（4.6 mmx150 mm ， 5 pm）；流動相：A：水溶液（含0.1%甲酸及10 mM乙酸銨）,B：甲醇（含0.1%甲酸）； 流量：1.0 mL/min；檢測波長：311 nm；柱溫：25 C ；進樣量：10吐。梯度洗脫條件：表2 二苯酮類紫外線吸收劑的液相色譜分離條件時間，minA , %B , %0946360404406011010013010

7、01994620946校準曲線的制備分別準確移取各標準儲備液（二苯酮-9除外）200 pL于 10 mL容量瓶中，用甲醇 稀釋至刻度，配置成200 pg/mL的混合標準溶液，取適量混合標準溶液，再用甲醇逐 級稀釋成 100 pg/mL， 50 pg/mL， 10 pg/mL， 5 pg/mL， 1 pg/mL的系列，構(gòu)成6個濃 度的混合標準系列，標準系列應于使用前配制。二苯酮-9采用上述方法以水為溶劑進 行系列濃度配制。移取10 pL系列標準溶液進行數(shù)據(jù)采集，以系列標準溶液質(zhì)量濃度 為橫坐標，峰面積為縱坐標，建立校準曲線。樣品測定在設定色譜條件下，移取10 yL待測溶液進行高效液相色譜分析。在

8、相同的液相 色譜條件下獲得的樣品溶液的液相色譜分離譜圖與標準物質(zhì)的液相色譜分離譜圖進 行比較，若樣品譜圖中存在保留時間與某標準物質(zhì)的保留時間一致的色譜峰，并且 其扣除背景后的紫外吸收圖譜與該標準物質(zhì)的紫外吸收圖譜一致，則可確認樣品中 存在該物質(zhì)。確證后，樣品溶液中目標物的含量，用標準曲線外標法確定。若待測 溶液中目標物的質(zhì)量濃度超過校準曲線線性范圍的上限，須對待測液進行適當稀釋 后重新測定?；瘖y品樣品中目標物的含量則按“7”項下計算公式計算。平行實驗按以上步驟，完成兩份樣品的平行測定。在重復性條件下獲得的兩次獨立測試 結(jié)果的絕對差值不大于這兩次測定值的算術(shù)平均值的 10%。結(jié)果計算W 目標物含

9、量，mg/g) = D乂卩xV %0-3m式中：p 從標準曲線中計算出的樣品溶液中目標物的質(zhì)量濃度，yg/mL；V樣品定容積，mL；m稱取樣品的質(zhì)量，goD 稀釋倍數(shù)(不稀釋則取1) 計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字?；厥章屎途芏冉?jīng)多家實驗室驗證，加標水平在0.520 yg/g范圍內(nèi)，11種二苯酮類紫外吸收劑的 方法回收率在85%110%之間，相對標準偏差在0.1%5% (n=6)之間。9色譜圖圖1 二苯酮類紫外吸收劑混合標準溶液液相色譜譜圖對應峰號：1、二苯酮-9；2、二苯酮-2；3、二苯酮-4/5；4、二苯酮-1；5、二苯酮-8；6、二苯酮-6；7、二苯酮-3；8、二苯酮-7；9、二苯酮-10；

10、 10、二苯酮-1210 質(zhì)譜確證 在相同的實驗條件下，如果檢出的色譜峰的保留時間和紫外光譜圖與對照品一 致，且保留時間與試樣添加對照品的色譜峰保留時間比較，相對誤差在2%內(nèi)，則 可認為試樣中含有二苯酮類紫外線吸收劑成分。必要時，可采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 法進行確證。質(zhì)譜參考條件：離子源：電噴霧離子源（ESI源）。離子化模式：正離子監(jiān)測模式（ESI+ ）和負離子檢測模式（ESI-）。 掃描方式：多反應監(jiān)測（ MRM）。其他參考質(zhì)譜條件見附錄B和C資料性附錄A二苯酮類紫外吸收劑成分信息表資料性附錄B參考質(zhì)譜條件去溶劑溫度(TEM)： 600C離子源電壓( IS)： 4500V。c) 碰撞氣( CA

11、D)： medium氣簾氣(CUR)： 20psi霧化氣( GS1)：50psi輔助氣( GS2)：50psi其他質(zhì)譜參數(shù)見表 B表 B 11 種二苯酮類紫外線吸收劑成分的主要參考質(zhì)譜參數(shù)化合物母離子(m/z)子離子(m/z)碰撞電壓(eV)駐留時間(ms)離子化 模式去簇電壓DP(V)二苯酮-1213.0134.828150ESI-100169.026150100二苯酮-2244.9134.922150ESI-80109.02815080二苯酮-3229.0151.032150ESI+100105.024150100二苯酮-4/5307.0211.047150ESI-100182.03915

12、0100二苯酮-6273.0123.022150ESI-100108.049150100二苯酮-7231.0121.030150ESI-10077.036150100二苯酮-8243.0123.023150ESI-10093.027150100二苯酮-9216.1203.118150ESI-60188.02615060二苯酮-10243.0151.025150ESI+100119.028150100二苯酮-12327.2215.028150ESI+100137.037150100對于不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。注：所列參考質(zhì)譜條件是在 AB Sciex QT

13、RAP 5500 型質(zhì)譜儀器上完成，此處列出實驗儀器型號僅為提供參考，并不涉及商業(yè)目的。資料性附錄C多反應監(jiān)測(MRM)色譜圖T irne, rrnnT irne, rrnnT irne, rrnn色譜條件同文本方法色譜柱：C18 ( 4.6x50mm , 1.8pm )化妝品中 11 種二苯酮類紫外線吸收劑的檢測方法起草說明為加強化妝品中限用物質(zhì)的監(jiān)督管理，國家食品藥品監(jiān)督管理局委托遼寧省食品 藥品監(jiān)督管理局所開展化妝品中二苯酮類紫外吸收劑的檢測方法建立和驗證工作，現(xiàn) 就起草工作有關(guān)情況說明如下：起草的必要性二苯酮類紫外線吸收劑是一類具有紫外吸收功能的高分子材料，由于其最大吸收波 長在330

14、 nm,同時具有防長波（UVA ）、中波紫外線（UVB）的功能，在國內(nèi)外均為常用防 曬劑。然而二苯酮類紫外線吸收劑在使用中會存在諸多問題，首先就是二苯酮類是芳香 酮類，產(chǎn)生的副產(chǎn)物無法在體內(nèi)新陳代謝；其次，二苯酮類在化妝品的添加中比較難以 處理和增溶；第三，雖然二苯酮類具有UVA的吸收能力，但是較弱，特別是在不同的 溶劑中表現(xiàn)出不同的吸收能力，在產(chǎn)品配伍方面要求較高。在我國2007 年出版的化 妝品衛(wèi)生規(guī)范規(guī)定的26 種紫外吸收劑中二苯酮3和二苯酮4/5的限用量為10%和5%。目前，在化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007）中除二苯酮-3及二苯酮4和5是作為限用防 曬劑出現(xiàn)的，衛(wèi)生規(guī)范中并未涉及其他幾種二苯

15、酮類紫外線吸收劑，但在化妝品實際 生產(chǎn)中二苯酮-1，二苯酮-2，二苯酮-9等多種二苯酮類紫外線吸收劑均有較廣泛的應 用。而目前的標準檢測方法中尚未涉及這些防曬劑的檢測，為加強對這類防曬劑的監(jiān) 管，國家食藥局出臺了化妝品中二苯酮-2的檢測方法，方法僅涉及二苯酮-2的檢 測，并未涉及其他二苯酮類防曬劑。為保證化妝品的安全性，保障消費者的人身安全， 同時考慮到方法使用的便利性，二苯酮類紫外線吸收劑作為一大類有明確功效的化妝 品成分，開展多組分同時測定的定性定量檢測方法研究十分必要。起草原則該方法起草遵循了以下4項原則：（1）檢測方法應具備先進性與可操作性強的特 點（2）檢測方法應盡量覆蓋所有防曬類化

16、妝品（3）應盡量優(yōu)化樣品前處理及分析測 試條件，使方法對色譜柱及色譜儀的損害降到最低，方法具有可行性。（ 4）檢測方 法應兼顧日常檢測和方法確證的需要。起草過程國家食品藥品監(jiān)督管理局于2011年12月委托遼寧省食品藥品監(jiān)督管理局開展化 妝品中二苯酮類紫外吸收劑的檢測方法建立和驗證工作。我們通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文 獻資料，進行了大量的方法實驗研究和樣品前處理研究，建立起了化妝品中 11 種二 苯酮類紫外線吸收劑的檢測方法。通過大量的樣品檢測和多家檢驗機構(gòu)驗證，最終形 成了化妝品中11 種二苯酮類紫外線吸收劑的檢測方法研究報告。重點說明的問題（1）關(guān)于體例。本檢測方法的體例主要參照化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2

17、007 年版）的 衛(wèi)生化學檢驗方法的體例，便于化妝品檢驗領域相關(guān)人員的閱讀和實際操作。（2）關(guān)于檢測方法的建立和驗證。通過對色譜分離條件的優(yōu)化研究，以及樣品前處理方法的研究，建立了化妝品中 的 11 種二苯酮類紫外線吸收劑的檢測方法。方法簡單、實用性較強，有利于方法的 推廣應用。項目中 11種二苯酮類紫外線吸收劑成分方法回收率在 85%110% 之間， 相對標準偏差在0.1%5.0% （n=7）之間，在0.1 mg/g20 mg/g的濃度范圍內(nèi)線性關(guān) 系良好（r0.99）,基本滿足分析檢測要求。三家實驗室驗證結(jié)果表明，校準曲線、 檢出限、精密度、回收率等指標符合檢測要求。12化妝品中 11 種

18、二苯酮類紫外線吸收劑的檢測方法編制說明任務來源為加強化妝品中限用物質(zhì)的監(jiān)督管理，國家食品藥品監(jiān)督管理局委托遼寧省食品藥 品監(jiān)督管理局開展化妝品中二苯酮和甲氧基肉桂酸乙基己酯的檢測方法建立和驗證工 作。在中期匯報中，在與會專家和領導的指導下，建議開展二苯酮類紫外吸收劑的檢測 方法建立和驗證工作，以此為出發(fā)點，我們開展了化妝品中11種二苯酮類紫外吸收劑的 檢測方法研究，建立了化妝品中11種二苯酮類紫外吸收劑成分的快速、準確、靈敏的色 譜檢測方法。研究背景二苯酮類紫外線吸收劑是一類具有紫外吸收功能的高分子材料，由于其最大吸收波 長在330 nm,同時具有防長波(UVA )、中波紫外線(UVB)的功能

19、，在國內(nèi)外均為常用防 曬劑。然而二苯酮類紫外線吸收劑在使用中會存在諸多問題，首先就是二苯酮類是芳香 酮類，產(chǎn)生的副產(chǎn)物無法在體內(nèi)新陳代謝；其次，二苯酮類在化妝品的添加中比較難以 處理和增溶；第三，雖然二苯酮類具有UVA的吸收能力，但是較弱，特別是在不同的 溶劑中表現(xiàn)出不同的吸收能力，在產(chǎn)品配伍方面要求較高。在我國2007 年出版的化 妝品衛(wèi)生規(guī)范規(guī)定的26 種紫外吸收劑中二苯酮3和二苯酮4/5的限用量為10%和5%。目前，在化妝品衛(wèi)生規(guī)范(2007)中除二苯酮-3及二苯酮4和5是作為限用防曬 劑出現(xiàn)的，衛(wèi)生規(guī)范中并未涉及其他幾種二苯酮類紫外線吸收劑，但在化妝品實際生產(chǎn) 中二苯酮-1，二苯酮-2

20、，二苯酮-9等多種二苯酮類紫外線吸收劑均有較廣泛的應用。而 目前的標準檢測方法中尚未涉及這些防曬劑的檢測，為加強對這類防曬劑的監(jiān)管，國家 食藥局出臺了化妝品中二苯酮-2的檢測方法，方法僅涉及二苯酮-2的檢測，并未涉 及其他二苯酮類防曬劑。為保證化妝品的安全性，保障消費者的人身安全，同時考慮到 方法使用的便利性，二苯酮類紫外線吸收劑作為一大類有明確功效的化妝品成分，開展 多組分同時測定的定性定量檢測方法研究十分必要。研究現(xiàn)狀目前在化妝品衛(wèi)生規(guī)范（ 2007 ）給出化學防曬劑的檢測方法中，只推薦了3種二 苯酮類紫外線吸收劑的定量檢測方法，尚存在諸多其它二苯酮類紫外線吸收劑的檢測空 白，急需建立相應

21、的方法。根據(jù)二苯酮類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，液相色譜是比較合適的 檢測手段，而針對化妝品衛(wèi)生規(guī)范（ 2007 ） 中所涉及的二苯酮3和二苯酮4/5三種紫 外線吸收劑的液相色譜檢測方法尚存在的一些不足，該方法中高氯酸和四氫呋喃通常作 為流動相組成成分。高氯酸為強酸，對色譜柱的傷害很大。四氫呋喃具有明顯的化學不 穩(wěn)定性，容易造成色譜系統(tǒng)的不穩(wěn)定，導致峰拖尾、裂分和新峰的產(chǎn)生，這些影響了該 方法的適用性。因此根據(jù)二苯酮類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特征，發(fā)展一種適合多種二苯酮 類化合物的檢測方法非常有必要。本項目擬采用高效液相色譜法，開展化妝品中11種二 苯酮類紫外線吸收劑成分的檢測方法研究，建立多種二苯酮類紫外

22、吸收劑的快速、準確、 靈敏的色譜檢測方法，為化妝品監(jiān)管提供良好的技術(shù)支持。項目完成情況（1）發(fā)展了膏霜類、乳液類、水劑類、唇膏等蠟基類、指甲油類、粉類等化妝 品中11種二苯酮類紫外線吸收劑的高效液相色譜檢測方法。本項目中 11種二苯酮類 紫外線吸收劑成分方法回收率在 85%110% 之間，相對標準偏差在 0.1%5.0%（n=7） 之間，在0.1 mg/g20 mg/g的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r0.99）,基本滿足分析檢 測要求。（ 2）本方法負責起草單位為大連市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，參與驗證單位分別是 中國檢驗檢疫科學研究院，北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，大連市疾病預防控制中心。 本方法主要起草

23、人為毛希琴、曲寶成、邊海濤。驗證結(jié)果滿足化妝品及其原料中禁 限用物質(zhì)檢測方法驗證技術(shù)規(guī)范方法概述儀器Agilent 公司 Agilent1260 高效液相色譜儀。超聲波清洗器。蝸旋混合器。離心機。試劑二苯酮類標準品：二苯酮-2、二苯酮-7 （International Laboratory USA ）二苯酮-1、二苯酮-8、二苯酮-12（Aladin Chemistry Co. Ltd）二苯酮-4 及其鹽、二苯酮-6 （Acros Organics Europe）二苯酮-3 （TCI 上海）二苯酮-9 （恒橋產(chǎn)業(yè)股份有限公司 南京）二苯酮-10 （Alfa Aesar UK） 上述試劑純度都大

24、于 95%。方法色譜條件色譜柱：Diamonsil - 柱，5pm, 4.6mmx150mm。流動相A：水（含0.1%甲酸和10mM醋酸銨）；流動相B：甲醇（含0.1%甲酸）。 流量： 1.0 mL/min。檢測器：二極管陣列檢測器,檢測波長為 311 nm。柱溫：25 c。標準溶液的配制標準儲備溶液：分別準確稱取各標準物質(zhì)100 mg （以上質(zhì)量均精確至0.1 mg） 于棕色容量瓶中，用四氫咲喃溶解后定容至10 mL （二苯酮-9除外），配置成濃度為 10 mg/mL的標準儲備液于冷藏條件下保存。實驗中選取40%甲醇水作為溶劑將100 mg二苯酮-9定容至10 mL,配置成濃度為10 mg/

25、mL的標準儲備液于冷藏條件下保存。準確移取標準儲備液（二苯酮-9除外）于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度, 配置成200 pg/mL的混合標準溶液，取適量混合標準溶液，再用甲醇逐級稀釋成100 pg/mL，50 pg/mL，10 pg/mL，5 pg/mL，1 pg/mL 的系列，構(gòu)成 6 個濃度的混合標準 系列，標準系列應于使用前配制。各標準系列按10 pL進樣量進行數(shù)據(jù)采集，用于高 效液相色譜法的標準曲線的繪制。二苯酮-9采用上述方法以水為溶劑進行系列濃度配 制。樣品預處理5.3.3.1 二苯酮-9 測試的樣品前處理稱取樣品約0.1g （精確至1mg）于25mL離心管中，對水易分散化妝

26、品，首先向 離心管管中加入 10 mL 水，渦旋或超聲使其均勻分散后，再向離心管管中加入 4 mL 二氯甲烷，渦旋12 min混勻，然后于5000轉(zhuǎn)/分離心5 min,取上層溶液2 mL,經(jīng) 0.2 pm聚丙烯微孔濾膜過濾后，待測?；蛉? mL混合溶液于12000轉(zhuǎn)/分離心5 min， 移取 1 mL 上層清液于 2 mL 進樣瓶中待測。對水不易分散化妝品,首先向試管中加入 4mL 二氯甲烷,渦旋或超聲使其均勻 分散后，再向試管中準確加入10mL水，渦旋12 min,混勻提取，然后于5000轉(zhuǎn)/ 分離心5 min,其他步驟與上面相同。除二苯酮-9 外其他二苯酮類防曬劑測試的樣品前處理稱取樣品約

27、0.1 g （精確至1 mg）于25 mL具塞試管中，向試管中加入2 mL四氫咲 喃，渦旋混勻提取，再向試管中加入75%甲醇水溶液定容至10mL,渦旋12 min,然 后于5000轉(zhuǎn)/分離心5 min,取2 mL混合溶液，經(jīng)0.2 pm聚丙烯微孔濾膜過濾后，待 測?；蛉? mL混合溶液于12000轉(zhuǎn)/分離心5 min,移取1 mL于2 mL進樣瓶中待測。對唇膏等蠟基化妝品，首先向試管中準確加入2 mL四氫咲喃，渦旋或超聲使樣品 完全分散。若不能分散一般適當超聲可解決問題，對超聲15 min仍無法分散的樣品， 需用60 C水浴，振蕩加熱約12分鐘即可溶解分散。繼續(xù)向試管中加入75%甲醇水 溶液定

28、容至10mL,渦旋混合，然后于5000轉(zhuǎn)/分離心5 min,其他步驟與上面相同。方法研究6.1 樣品前處理條件的優(yōu)化乳液、唇膏、指甲油、粉類化妝品的結(jié)構(gòu)組成差異很大,考慮到這些化妝品樣品 的分散性以及目標物的溶解性,參考文獻,我們嘗試不同比例甲醇/水、四氫呋喃/甲 醇/水作為初級提取溶液提取空白加標樣品中的目標物,結(jié)果顯示除唇膏外,在2 mL 四氫咲喃及8 mL75%甲醇水溶液的提取條件下目標物在20 mg/g較高濃度下時仍有較 高的回收率。而對于唇膏基質(zhì),考慮到其較難分散,我們采取首先用四氫呋喃溶解分 散樣品,若仍無法分散需熱水浴輔助超聲分散,然后加入75%甲醇水的方法。試驗證 明,加入75

29、%甲醇水后唇膏中的蠟基及指甲油中大分子的賦形劑等基質(zhì)（這些物質(zhì)由 于極強的非極性很難從反相色譜柱上洗脫下來,嚴重影響色譜柱的使用壽命）均可以 析出,從而避免了這些物質(zhì)對反相色譜柱的傷害。對于二苯酮-9而言（因其水溶性故一般僅在乳液或水劑類化妝品中使用）,由于 帶有兩個磺酸取代基,水溶性極強,為此我們采用水 /二氯甲烷雙液相萃取體系,一 方面脫除化妝品樣品中的脂溶性雜質(zhì)（富集在二氯甲烷層）及表面活性劑類雜質(zhì)（富 集在水與二氯甲烷兩相界面處），同時保證目標物（富集在水相）的收率。但考慮到 化妝品樣品的分散性的差異，對水易分散的體系先用水分散并提取目標化合物，然后 再加入二氯甲烷脫除雜質(zhì)，而對水不易

30、分散的體系需先用二氯甲烷分散，然后加入水 提取目標化合物。結(jié)果表明在0.5 mg/g20 mg/g范圍內(nèi)，目標物都有較好的回收率。色譜柱的選擇選擇合適的色譜柱是分析方法的關(guān)鍵。 C18 色譜柱是實驗室最常使用的色譜柱，因此分析方法也優(yōu)先選擇c18色譜柱。但是即使同樣是c18色譜填料，因為鍵合技術(shù),硅羥基封尾基團的不同，色譜柱的選擇性也會有較大的差別。為此我們首先比較 11種二苯酮類紫外吸收劑在 XDB-C18、Agilent Porosell 120 EC-C18、Agilent eclipse plus1818140120100604020Agilent XDB-C18 1.8um, 4.6

31、*50mm024681012min-205040302010ODS-C18 5um, 4.6*150mm-10140120100604020Agilent XDB-C18 1.8um, 4.6*50mm024681012min-205040302010ODS-C18 5um, 4.6*150mm-100246810121416min8060m)4020Diamonsil C18 5um, 4.6*150mm05108060m)4020Diamonsil C18 5um, 4.6*150mm051015min 20圖 1 二苯酮類紫外吸收劑在不同類型 C18 柱上的色譜保留行為結(jié)果表明，二苯酮類

32、紫外吸收劑在五種c18柱都有較好的分離度和峰響應值。鑒 于5 pm 色譜柱的普適性及二苯酮-9的峰響應變化，選取Diamonsil-C8柱作為試 驗使用色譜柱。但需要注意的是在Diamonsil-C18色譜柱上二苯酮-2和二苯酮-4/5的出18峰順序與其他類型的C18柱不同，二苯酮-2先出峰。檢測波長的選擇根據(jù)不同二苯酮類化合物的紫外-可見光譜譜圖，分析了11 種二苯酮類化合物在 不同檢測波長下的特征吸收峰分布情況。試驗結(jié)果表明，11種化合物在240 nm-330 nm紫外波長范圍內(nèi)均有特征吸收，根據(jù) 11 種化合物的紫外線吸收波長譜圖確定 311 nm 作為通用檢測波長，譜圖見圖 2。圖 2

33、 ：11 種二苯酮類紫外線吸收劑在 311nm 下下的色譜峰譜圖流動相的選擇A:甲醇與乙腈為強洗脫溶劑的色譜分離比較我們比較了甲醇和乙腈作為強洗脫溶劑時對色譜分離行為的影響，發(fā)現(xiàn)兩種溶劑 在優(yōu)化條件下均可獲得較好的分離譜圖?？紤]到乙腈的價格和毒性，我們最終選用甲 醇為色譜有機相。B:流動相中酸性改性劑的比較我們比較了無酸以及甲酸和乙酸分別作為酸性改性劑，不同酸的添加量對色譜分 離的影響。結(jié)果顯示0.1%甲酸條件下，除二苯酮-9外，其他二苯酮類紫外吸收劑在色 譜柱上可獲得很好的分離，增加酸的濃度對分離沒有改善，但流動相酸性越強對色譜 柱的傷害也越大，因此確定0.1%甲酸做為流動相條件。對于二苯酮

34、-9，流動相中添加甲酸能夠增加其響應值，但存在峰拖尾，因此在酸 性改性劑的基礎上，比較了不同濃度醋酸銨對色譜峰峰型的影響，最終確定0.1%甲酸 和10 mM醋酸銨作為流動相條件。C:梯度洗脫條件的優(yōu)化通過不斷優(yōu)化梯度洗脫條件，以達到在最短時間內(nèi)獲得所有化合物基線分離的目 的。我們最終確定的色譜梯度條件為：色譜柱：C8柱（5 pm, 4.6 mmxl50 mm）；流動相：A：水（含0.1%甲酸及10 mM乙酸銨）,B：甲醇（含0.1%甲酸）；流量： l.0 mL/min；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長： 311 nm；柱溫：25 C;進樣量： 10pL。梯度洗脫條件：表 1 11 種二苯酮類

35、紫外線吸收劑的液相色譜分離條件時間，minA， %B， %094636040440601101001301001994620946線性范圍及檢出限結(jié)合樣品中二苯酮類紫外線吸收劑的實際添加量、樣品稱樣量及線性范圍,本研 究確定最高配制濃度為200 pg/mL，最低配制濃度為1 pg/mL，濃度范圍完全滿足實 驗要求。分別配制共6個系列濃度的混合標準系列,進行檢測分析,記錄相應的面積響應 值，以被測物質(zhì)標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標（x）,面積響應值為縱坐標（y） 建立標準曲線，進行相關(guān)分析得到線性方程和相關(guān)系數(shù)（r）。同時，對含混和標準系 列的基質(zhì)標準溶液進行檢測分析，記錄相應的峰面積響應值，以被測

36、物質(zhì)基質(zhì)標準溶 液的質(zhì)量濃度為橫坐標（x），面積響應值為縱坐標（y）建立基質(zhì)，標準曲線，進行 相關(guān)分析得到線性方程和相關(guān)系數(shù)（r）結(jié)果見表2序號物質(zhì)名稱標準曲線相關(guān)系數(shù)基質(zhì)標準曲線相關(guān)系數(shù)1二苯酮-1y=44.36313x-1.626520.99995y=44.14395x-4.676751.000002二苯酮-2y=36.58289x+0.41970.99997y=35.92602x-1.042261.000003二苯酮-3y=40.63627x-2.25650.99997y=40.31907x-3.219901.000004二苯酮-4/5y=21.07432x-2.285920.99997

37、y=21.04827x-2.430930.999995二苯酮-6y=29.97015x+12.0900.99927y=29.58270 x-2.264901.000006二苯酮-7y=6.55577x+1.383760.99985y=6.76154x-1.216350.999997二苯酮-8y=35.53993x-0.908140.99997y=35.24768x-1.959401.000008二苯酮-9y=4.14278x-0.2211410.99983y=5.21867x+1.678180.999999二苯酮-10y=40.50182x-1.757050.99998y=39.91817x-

38、2.387531.0000010二苯酮-12y=29.00651x-3.983970.99998y=28.70398x-2.887441.00000檢出限是指檢測器恰能產(chǎn)生3倍噪聲時的色譜進樣量。對工作曲線逐級往下稀釋，計算信噪比(S/N)。以S/N=3為檢出限，以S/N=10為定量下限。當樣品 稱樣量為 0.1 g,定容體積為10 mL時，計算檢出濃度和最低定量濃度。二苯酮類紫外線吸收劑 的檢出限、定量下限極檢出濃度和最低定量濃度見表 3表3 11種二苯酮類紫外線吸收劑的檢出限、檢出濃度、定量下限、最低定量濃度序號化合物名稱檢出限/yg檢出濃度/(yg/g)定量下限/yg最低定量濃度/(yg

39、/g)1二苯酮-10.4x10-34.01.5x10-3152二苯酮-20.5x10-34.51.5x10-3153二苯酮-30.6x10-36.02.0 x10-3204二苯酮-4/52.0 x10-3206.7x10-3705二苯酮-60.6x10-36.02.0 x10-3206二苯酮-73.3x10-3301.0 x10-21007二苯酮-80.5x10-34.51.7x10-3158二苯酮-90.5x10-34.51.7x10-3159二苯酮-100.6x10-36.02.0 x10-32010二苯酮-120.6x10-38.02.7x10-327精密度將5.0 yg/mL、100.

40、0 yg/mL和200.0 yg/mL三種濃度的混合標準溶液同一日內(nèi)平 行測定7次，計算精密度，并用相對標準偏差（RSD）表示，結(jié)果見表4。將5.0 yg/mL、 100.0 yg/mL 和 200.0 yg/mL 三種濃度的混合標準溶液于室溫密封避光條件下存放，在 設定的色譜條件下每隔24 h進樣測定一次，連續(xù)測定4天，以色譜峰峰面積的重復性 作為指標，進行液相色譜法日間精密度實驗。計算精密度，并用相對標準偏差（RSD） 表示，結(jié)果見表 5。由表 4 可見， 11 種二苯酮類紫外吸收劑的日內(nèi)精密度 RSD 值在0.10.3%之間。 由表 5 可見， 11 種二苯酮類紫外吸收劑的日間精密度 R

41、SD 值在1.63.6%之間。日內(nèi) 精密度和日間精密度結(jié)果均滿足方法要求。表4 11 種二苯酮類紫外線吸收劑的日內(nèi)精密度序號物質(zhì)名稱相對標準偏差（RSD）%5.0 yg/mL100.0 yg/mL200.0 yg/mL1二苯酮-10.10.10.12二苯酮-20.10.10.13二苯酮-30.20.10.14二苯酮-4/50.10.10.15二苯酮-60.20.10.16二苯酮-70.20.20.17二苯酮-80.20.10.18二苯酮-90.10.10.19二苯酮-100.20.10.310二苯酮-120.20.10.1序號物質(zhì)名稱 -相對標準偏差（RSD） %5.0yg/mL100.0 y

42、g/mL200.0 yg/mL1二苯酮-11.11.52.02二苯酮-22.42.81.83二苯酮-33.52.92.84二苯酮-4/52.51.82.65二苯酮-61.63.33.16二苯酮-72.93.63.07二苯酮-82.32.51.68二苯酮-91.91.72.29二苯酮-103.03.32.710二苯酮-122.11.31.9準確度按防曬劑的類別，每種類別選擇2種樣品作為空白，分別加入5 yg/mL和200 yg/mL共2種混合標準溶液，進行加標回收試驗，平行測定6次，計算方法回收率， 結(jié)果見表 6。表 6 11 種二苯酮類紫外線吸收劑的方法回收率和 RSD化合物基質(zhì)5.0 yg/

43、mL20.0yg/mL方法回收率（）RSD(%)方法回收率（）RSD(%)乳液952.91000.2二苯酮-1唇膏980.9960.5指甲油971.3980.1粉982.1970.9二苯酮-2乳液962.71000.4唇膏991.5961.4化合物基質(zhì)5.0 yg/mL20.0yg/mL方法回收率（）RSD(%)方法回收率（）RSD(%)指甲油980.5960.8粉992.11010.7乳液952.41000.1唇膏971.3950.9二苯酮-3指甲油1004.1991.6粉961.5980.4乳液952.21000.3二苯酮-4/5唇膏991.5991.1指甲油990.9971.1粉1022

44、.3990.1乳液964.11000.3唇膏950.9991.4二苯酮-6指甲油963.6930.5粉962.0960.8乳液952.5990.4唇膏962.01001.6二苯酮-7指甲油994.2980.2粉980.3991.2乳液961.81000.1唇膏971.1981.1二苯酮-8指甲油981.9950.1粉950.6970.4二苯酮-9乳液1041.21021.2乳液952.6990.4唇膏970.5990.2二苯酮-10指甲油983.81010.1粉981.21010.2乳液1003.81000.2唇膏950.5981.8二苯酮-12指甲油970.6970.6粉982.4991.6

45、結(jié)果顯示，11種二苯酮類紫外吸收劑在高、低濃度的方法回收率在 93-102%之間，相對標準偏差RSD值在0.142% （n=6）之間，結(jié)果滿足方法要求。樣品測定采用上述確定的色譜條件測定了 42種樣品，每個樣品平行測定兩次。（其中膏霜 15份，乳液 13 份，爽膚水 2 份，唇膏 4 份，甲油 5 份，粉 2 份，香水 1份）進行了 防曬劑的含量分析。檢出二苯酮-1 陽性樣品 3 份，二苯酮-2 陽性樣品一份，二苯酮-3 陽性樣品 1 份，二苯酮-4 陽性樣品 1 份，二苯酮-9 陽性樣品一份，其他未檢出。檢測 結(jié)果見表 7。表7實際樣品的液相色譜測定結(jié)果（單位：mg/kg）（-為未檢出，bp

46、為二苯酮）樣品bp-1bp-2bp-3bp-4/5bp-6bp-7bp-8bp-9bp-10bp-12指甲油1指甲油269.5指甲油3219.9指甲油4指甲油5197.5抗皺緊膚霜凈白潤膚霜潤白舒養(yǎng)霜美白日霜煥白膏膚露美白防曬乳多重防曬露凈白潤膚霜防曬乳防曬乳（外）防曬隔離液-2785透白防曬露防曬潤膚露美白防曬乳防曬乳（wai）隔離防曬液美白靚膚爽膚水柔膚水-185-舒敏修復霜樣品bp-1bp-2bp-3bp-4/5bp-6bp-7bp-8bp-9bp-10bp-12水嫩特潤霜新活再生霜祛斑精華霜美白滋潤晚霜美白煥米日霜修護底霜美白乳保濕乳液美白隔離霜潤膚乳液潤膚霜-21.6-水凝潤唇膏水凝

47、潤唇膏唇膏（外）唇膏（外）爽身粉痱子粉香水-2106實際檢測樣品中二苯酮-1、二苯酮-2、二苯酮-4 和二苯酮-9 的典型譜圖見圖 3、圖4、圖 6 柔膚水樣品中二苯酮-9 的典型色譜圖311nmbp-9A-_- -_與衛(wèi)生規(guī)范方法的比對試驗根據(jù)專家論證會的意見，補充了本方法與衛(wèi)生規(guī)范的比對試驗。我們向空白 乳液，唇膏，甲油，粉基中添加二苯酮-3 及二苯酮 4/5，比較了兩種方法在兩個添加 水平下的回收率及RSD（n=2）情況，結(jié)果如表8所示。結(jié)果顯示，兩種方法給出的測 試結(jié)果一致。表8 不同前處理方法下二苯酮-3，二苯酮-4/5的檢測結(jié)果比較方法方法一（本方法）方法二（2007衛(wèi)生規(guī)范）化合

48、物基質(zhì)5.0 yg/mL200.0yg/mL5.0 yg/mL200.0yg/mL方法回收 率（）RSD(%)方法回收 率（）RSD(%)方法回收 率（）RSD(%)方法回 收率（）RSD(%)苯 酮3乳液93.22.898.30.195.33.796.61.8唇膏98.62.197.21.497.71.298.11.4指甲油1033.399.52.196.12.098.90.9粉97.91.6100.20.998.51.697.61.3苯 酮 4/5乳液93.82.698.31.596.31.898.61.5唇膏97.81.5101.12.293.62.499.50.8指甲油96.20.79

49、8.01.6100.41.997.41.5粉99.61.3101.70.798.41.1101.30.7質(zhì)譜確證 在相同的實驗條件下，如果檢出的色譜峰的保留時間和紫外光譜圖與對照品一致，且保留時間與試樣添加對照品的色譜峰保留時間比較，相對誤差在2%內(nèi)，則 可認為試樣中含有二苯酮類紫外線吸收劑成分。在此基礎上可進一步采用液相色譜- 質(zhì)譜法進一步確證。液相條件：同前。色譜柱：Agilent XDB -C18 （4.6x50mm，1.8pm）質(zhì)譜參考條件：質(zhì)譜儀器： AB Sciex QTRAP 5500離子源：電噴霧離子源（ESI源）。離子化模式：正離子監(jiān)測模式（ESI+）和負離子檢測模式（ESI

50、-）。 掃描方式：多反應監(jiān)測（ MRM）。質(zhì)譜條件：a）去溶劑溫度（TEM）： 600Cb）離子源電壓（IS）： 4500V。c）碰撞氣（ CAD）： mediumd）氣簾氣（CUR）： 20psie）霧化氣（ GS1）：50psif）輔助氣（ GS2）：50psi其他質(zhì)譜參數(shù)見表9表 9 11 種二苯酮類紫外線吸收劑成分的主要參考質(zhì)譜參數(shù)化合物母離子（m/z）子離子（m/z）碰撞電 壓（eV）駐留時 間（ms）離子 化模式去簇電壓DP（V）射入電壓EP （V）射出電壓CXP （V）二苯酮-1213.0134.828150ESI-1001015169.0261501001015二苯酮-2244

51、.9134.922150ESI-801015109.028150801015二苯酮-3229.0151.032150ESI+1001013105.0241501001013二苯酮-4/5307.0211.047150ESI-1001015182.0391501001015二苯酮-6273.0123.022150ESI-1001015108.0491501001015二苯酮-7231.0121.030150ESI-100101577.0361501001015二苯酮-8243.0123.023150ESI-100101593.0271501001015二苯酮-9216.1203.118150ES

52、I-601015188.026150601015二苯酮-10243.0151.025150ESI+1001013119.0281501001013二苯酮-12327.2215.028150ESI+1001013137.0371501001013注：所列參考質(zhì)譜條件是在AB Sciex QTRAP 5500型質(zhì)譜儀器上完成，此處列出實驗儀器型號僅為提供參考，并不涉及商業(yè)目的。11種二苯酮類紫外線吸收劑的子離子掃描質(zhì)譜圖見圖 7 至圖 16，11種二苯酮類紫外線吸收劑在質(zhì)譜儀器上的多反應監(jiān)測（MRM ）色譜圖見圖17。1.5961.596圖 7 二苯酮 1 的子離子掃描質(zhì)譜圖M ax. 1 .6e6 cps.-M S2 (244 90): 0.0