無(wú)菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、無(wú)菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程無(wú)菌檢查法是檢查要求無(wú)菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及要求無(wú)菌的其他物品是否染有活菌的一種方法。事實(shí)上，若供試品符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌污染。無(wú)菌檢查法有薄膜過(guò)濾法、直接接種法兩種方式。細(xì)菌培養(yǎng)溫度32.52.5，真菌培養(yǎng)溫度25.52.5。1 無(wú)菌檢查的環(huán)境無(wú)菌檢查的所有操作均需在嚴(yán)格控制微生物污染的環(huán)境下進(jìn)行，操作環(huán)境的無(wú)菌保證程度將直接影響無(wú)菌檢查用潔凈室（區(qū)）環(huán)境的穩(wěn)定性，確保檢查結(jié)果的可考性，對(duì)潔凈室（區(qū)）的環(huán)境質(zhì)量采取合理的控制措施和評(píng)價(jià)方法是必要的。無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)和局部潔凈度100級(jí)的單向留空氣區(qū)域

2、內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過(guò)程筆削嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。無(wú)菌室應(yīng)采光良好、避免潮濕、遠(yuǎn)離廁所及污染區(qū)。面積一般不超過(guò)10m2，不小于5m2；高度不超過(guò)2.4m。由12個(gè)緩沖間、操作間組成（操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對(duì)），操作間與緩沖間之間應(yīng)具備滅菌功能的樣品傳遞箱。在緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆、毛巾、無(wú)菌衣褲放置架及掛鉤、拖鞋等，不應(yīng)放置培養(yǎng)箱和其他雜物；無(wú)菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墻壁與地面、

3、天花板連接處應(yīng)呈凹弧形，無(wú)縫隙，不留死角。操作間內(nèi)不應(yīng)安裝下水道。無(wú)菌操作室應(yīng)具有空氣除菌過(guò)濾的單向流空氣裝置，操作區(qū)潔凈度100級(jí)或放置同等級(jí)別的超凈工作臺(tái)，室內(nèi)溫度控制1826，相對(duì)濕度45%65%。緩沖間及操作室內(nèi)均應(yīng)設(shè)置能達(dá)到空氣消毒效果的紫外燈或其他適宜的消毒裝置，空氣潔凈級(jí)別不同的相鄰房間之間的靜壓差應(yīng)大于5Pa，潔凈室（區(qū)）與室外大氣的靜壓差大于10Pa。無(wú)菌室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于300lx。緩沖間和操作間所設(shè)置的紫外線殺菌燈（22.5W/m3），應(yīng)定期檢查輻射強(qiáng)度，要求在操作面上達(dá)40Wcm-2。不符合要求的紫外殺菌燈應(yīng)及時(shí)更換。無(wú)菌室應(yīng)

4、每周和每次操作前用0.1%新潔爾滅或2%甲酚液或其他適宜消毒液擦拭操作臺(tái)及可能污染的死角，開(kāi)啟無(wú)菌空氣過(guò)濾器及紫外燈殺菌1小時(shí)。在每次操作完畢，同樣用上述消毒溶液擦拭工作臺(tái)面，除去室內(nèi)濕氣，用紫外燈殺菌半小時(shí)。無(wú)菌室的潔凈度檢查 無(wú)菌室在消毒處理后，無(wú)菌試驗(yàn)前及操作過(guò)程中需檢查空氣中菌落數(shù)，以此來(lái)判斷無(wú)菌室是否達(dá)到規(guī)定的潔凈度，常有沉降菌和浮游菌測(cè)定方法。沉降菌檢測(cè)方法及標(biāo)準(zhǔn)：以無(wú)菌方式將3個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板帶入無(wú)菌操作室，在操作區(qū)臺(tái)面左、中、右各放1個(gè)；打開(kāi)碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將碟蓋蓋好，置32.52.5培養(yǎng)48小時(shí)，取出檢查，3個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)平均不超過(guò)1個(gè)。浮游菌檢測(cè)方法

5、及標(biāo)準(zhǔn)：用專門的采樣器，宜采用撞擊法機(jī)理的采樣器，一般采用狹縫式或離心式采樣器，并配有流量計(jì)和定時(shí)器，嚴(yán)格按儀器說(shuō)明書(shū)的要求操作并定期校驗(yàn)，采用器和培養(yǎng)皿進(jìn)入被測(cè)定房間前先用消毒房間的消毒劑滅菌，使用的培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或藥典認(rèn)可的其他培養(yǎng)基。使用時(shí)，先開(kāi)動(dòng)真空泵抽氣，時(shí)間不少于5分鐘，調(diào)節(jié)流量、轉(zhuǎn)盤、轉(zhuǎn)速。關(guān)閉真空泵，放入培養(yǎng)皿，蓋上采樣器蓋子后調(diào)節(jié)縫隙高度。置采樣口于采樣點(diǎn)后，依次開(kāi)啟采樣器、真空泵，轉(zhuǎn)動(dòng)定時(shí)器，根據(jù)采樣量設(shè)定采樣時(shí)間。全部采樣結(jié)素后，將培養(yǎng)皿置32.52.5培養(yǎng)48小時(shí)，取出檢查，浮游菌落數(shù)平均不得過(guò)5個(gè)/m3。每批培養(yǎng)基應(yīng)選定3只培養(yǎng)皿做對(duì)照培養(yǎng)。無(wú)菌操作臺(tái)面或超凈

6、工作臺(tái)還應(yīng)定期請(qǐng)有關(guān)部門檢測(cè)其懸浮粒子，應(yīng)達(dá)到100級(jí)（一般用塵埃粒子計(jì)數(shù)儀）檢測(cè)塵埃粒徑0.5的粒數(shù)不得超過(guò)3.5個(gè)/升，5m的粒數(shù)為0，空氣流速應(yīng)0.35m/s，可根據(jù)無(wú)菌狀況必要時(shí)置換過(guò)濾器。2 儀器及用具2.1 無(wú)菌室內(nèi)應(yīng)準(zhǔn)備好盛有消毒用5%甲酚或其他適宜消毒溶液的玻璃缸、乙醇燈、火柴、鑷子、75%乙醇棉、碘狀棉等。2.2 恒溫培養(yǎng)箱及生化培養(yǎng)箱。2.3 離心機(jī)、生物顯微鏡、真空架、高壓蒸汽滅菌器、標(biāo)準(zhǔn)pH比色器（0.02%酚磺酞指示液和溴麝香草酚藍(lán)指示液）、恒溫烤箱、開(kāi)放或全封閉過(guò)濾系統(tǒng)。2.4 玻璃器皿 試管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1、5、10ml）、注射器（2、5、10

7、ml）、雙碟等，用玻璃洗滌劑或清潔液浸泡，水洗3次。如使用過(guò)程中與細(xì)菌接觸（已污染），應(yīng)先滅菌倒出內(nèi)容物后再清洗，晾干。凡無(wú)菌操作過(guò)程中所用的器皿，都應(yīng)用牛皮紙包扎嚴(yán)密，滅菌。移液管、刻度吸管在管內(nèi)上端，塞少許原棉，以手感不松不緊為宜，然后放于吸管筒內(nèi)或牛皮紙袋內(nèi)，封嚴(yán)，滅菌待用；試管、離心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉膠（或硅膠）專用塞或紗布棉塞，塞子應(yīng)塞進(jìn)管口內(nèi)2/3處，用牛皮紙將管口（包括塞子）包扎嚴(yán)，滅菌待用；將注射器、針頭（9號(hào)、11號(hào)、12號(hào)）配對(duì)，檢查針頭是否暢通后，將注射芯、管和針頭分別放在雙層紗布（或布）內(nèi)，包扎嚴(yán)密，置帶蓋容器（瓷盤或鋁制飯盒）內(nèi)，蓋嚴(yán)，用牛皮紙包扎后，滅

8、菌待用。長(zhǎng)柄取樣匙，放于不銹鋼長(zhǎng)筒內(nèi)，蓋嚴(yán)，干熱滅菌待用。手術(shù)鑷、手術(shù)剪洗凈、擦干。用雙層紗布將1把剪刀與1把別字間隔包扎在一起，放于帶蓋的容器（瓷盒或鋁制飯盒）內(nèi)，蓋嚴(yán)，用牛皮紙包扎，滅菌（參照附錄XV 滅菌法）待用。高壓蒸汽滅菌的物品取出時(shí)切勿立即置冷卻，使滅菌物品內(nèi)蒸汽冷凝造成負(fù)壓，易染菌，取出后應(yīng)置恒溫培養(yǎng)箱（或干燥箱）中烘干，待用。2.5 無(wú)菌衣、褲、帽、口罩等洗凈晾干，配套，用牛皮紙包嚴(yán)，滅菌待用或用一次性的無(wú)菌物品代替。2.6 除菌濾器及濾膜 有多種開(kāi)放式及封閉式濾器用于過(guò)濾除菌。微孔濾膜直徑50mm、孔徑約0.45m。新購(gòu)入封閉式濾器或?yàn)V膜，需進(jìn)行孔徑大小的測(cè)試，一般有三種方法

9、，選其中一種方法即可。氣泡法 先將濾膜浸入說(shuō)中，使完全濕潤(rùn)，然后用鑷子夾住一片濾膜放于氣泡點(diǎn)測(cè)定裝置過(guò)濾膜孔徑測(cè)定儀上，膜上放一塊與濾膜大小相同的尼龍篩網(wǎng)，再加上多孔板，將螺旋補(bǔ)丁圈旋緊，在多孔板上加35mm深的水（注意排除氣泡）關(guān)閉放氣閥，啟動(dòng)空壓機(jī)或氮?dú)馄块y，使壓力緩緩上升，注意觀察水面上產(chǎn)生第一個(gè)氣泡時(shí)，記錄壓力表的壓力，氣泡點(diǎn)壓力不應(yīng)小于2.2kg/cm2（0.2MPa）。水流量法 將濾膜裝于除菌濾器上，開(kāi)動(dòng)真空泵，壓力在700mmHg（93kPa）下，抽濾已濾清的水約500ml，計(jì)算出每1min的濾速。2005年版中國(guó)藥典對(duì)濾膜的濾速未明確規(guī)定，而USP（XX）規(guī)定在700mmHg（

10、93kPa）壓力下，濾膜直徑47mm；流速5575ml/min。細(xì)菌過(guò)濾法 常用的細(xì)菌為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens CMCC（B）41002），將該菌的新鮮營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，32.52.5，培養(yǎng)1820小時(shí)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至10-3（約相當(dāng)于7105cfu/ml），取此菌液1ml加至50ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，取該濾液5ml接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基40ml中，32.52.5培養(yǎng)24小時(shí)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。不符合規(guī)定的濾膜不得使用。3 菌種及菌液制備菌種的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第

11、0代；冷凍干燥的原始菌種開(kāi)啟后轉(zhuǎn)種，為第一代）。原始菌種購(gòu)到后，應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，接收菌種時(shí)應(yīng)檢查安瓿的數(shù)量和菌種的名稱及每一支安瓿的完整性。并在相應(yīng)的菌種接收登記表上記錄所有關(guān)于菌種的信息。將安瓿存于20，使用時(shí)首先需要復(fù)活凍干菌種（按菌種保藏中心提供相關(guān)資料操作），一般包括以下步驟：冷凍菌種的復(fù)活 清潔安瓿（可用75%的酒精或碘狀）后，用砂輪在安瓿上部三分之一處劃痕，用干燥的無(wú)菌紗布包裹安瓿，將安瓿掰開(kāi)，用一無(wú)菌吸管吸取適量0.50.8ml的液體培養(yǎng)基（生孢梭菌用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基；金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯；白色念珠菌、黑曲霉菌用液體真菌培養(yǎng)基）滴加到

12、安瓿中，輕輕旋轉(zhuǎn)安瓿并吹打，使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混和并完全溶解，再將安瓿內(nèi)的菌懸液全部吸出，轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的培養(yǎng)基試管中，根據(jù)菌種類型采用適宜的培養(yǎng)條件（細(xì)菌培養(yǎng)溫度32.52.5，1824小時(shí)；真菌培養(yǎng)溫度25.52.5，35天）下培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基是否渾濁，（如不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天以上，真菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至14天以上，仍未渾濁，按相關(guān)規(guī)定滅菌處理。）渾濁說(shuō)明菌種復(fù)活生長(zhǎng)，在應(yīng)用前，還應(yīng)確認(rèn)菌種的純度和特性。菌種確認(rèn) 用無(wú)菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上劃線分離單個(gè)菌落，適宜條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)后觀察是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取單一的純菌落，進(jìn)行革蘭染色、鏡檢，觀察其染

13、色特性及菌形。并作生化實(shí)驗(yàn)或使用菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定該菌種，對(duì)已通過(guò)確認(rèn)鑒定后的菌種可以使用或傳代保藏。菌種傳代保藏方法很多，各單位了根據(jù)情況采用，但無(wú)論應(yīng)用何種方法，都應(yīng)對(duì)采用的方法進(jìn)行驗(yàn)證，確保在相應(yīng)保存條件下的菌種不會(huì)變異且性能穩(wěn)定，同時(shí)也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便。常用的有甘油冷凍管保藏法、斜面低溫保藏法等，此類方法簡(jiǎn)單易行。甘油冷凍管保藏法 將待保藏菌接種平板或瓊脂斜面，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間后（細(xì)菌2448小時(shí)的培養(yǎng)物，白色念珠菌72小時(shí)的培養(yǎng)物），用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔 ，并通過(guò)接踵環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無(wú)菌蒸餾水中，調(diào)整菌液濃度，向已制備好的

14、菌懸液中加入等體積、濃度為20%的無(wú)菌甘油，輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混和，分裝于無(wú)菌小管，制好的甘油冷凍管最好在30貯存。斜面低溫保藏法 將工作用菌種的典型菌落接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待菌生長(zhǎng)充分以后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種管用牛皮紙包好，轉(zhuǎn)移至4左右冰箱保存，如菌種保藏管的塞子是橡膠塞，并采用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，則可以保存時(shí)間較長(zhǎng)。銅綠假單胞菌不宜用本法保存。3.1 菌種（1）金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003（2）枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501（3）大腸埃希菌(Es

15、cherichia coli)CMCC(B)44102（4）銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104（5）生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64941（6）白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001（7）黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)980033.2 菌液制備制備的菌液，一般當(dāng)日使用。取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，32.52.5培養(yǎng)1824小

16、時(shí)；白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中見(jiàn)附錄1.3，25.52.5培養(yǎng)2448小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液見(jiàn)附錄3.1制成每毫升含菌小于100菌落形成單位（cfu）的菌懸液。將黑曲霉菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25.52.5培養(yǎng)57天，使大量的孢子成熟，加入35ml0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，用玻棒或白金餌輕輕振搖將孢子洗脫。然后，用管口帶有能過(guò)濾菌絲的裝置（如薄層無(wú)菌棉花或紗布的無(wú)菌毛細(xì)吸管）的吸管吸出胞子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將其稀釋至每毫升含小于100cfu的孢子懸液（可采用比濁法）。以上菌液在供試驗(yàn)的同時(shí)，

17、金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂，白色念珠菌和黑曲霉用改良馬丁培養(yǎng)基注皿（1ml）或平板涂布（0.1ml），按規(guī)定條件培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)。4 培養(yǎng)基4.1 一般采用商品脫水培養(yǎng)基，臨用時(shí)按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，配制培養(yǎng)基時(shí)稱量要迅速以免潮濕而影響稱量的準(zhǔn)確性，同時(shí)為避免增加培養(yǎng)基中的金屬離子及其他微量化學(xué)元素而影響微生物的生長(zhǎng)、鑒別、所用器具應(yīng)為潔凈玻璃器皿，所用溶解用水為純水。4.2 培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必需校正。調(diào)節(jié)pH值：測(cè)定pH值的標(biāo)準(zhǔn)溫度為252，調(diào)節(jié)pH值可用無(wú)菌的1mol/L（1N）氫氧化鈉或10%碳酸鈉溶液、1mol/L鹽酸溶液或15%冰醋酸

18、溶液。分裝好的培養(yǎng)基及時(shí)密封后必須在配制當(dāng)天（2小時(shí)內(nèi)最佳）進(jìn)行滅菌處理。4.3 新鮮配制的培養(yǎng)基，應(yīng)按中國(guó)藥典規(guī)定的處方，對(duì)培養(yǎng)基的原材料要進(jìn)行挑選，化學(xué)藥品均需用CP試劑規(guī)格。4.3.1 除葡萄糖和指示液外，將處方中各成分加水后置有石棉網(wǎng)的電爐、可調(diào)電磁爐或其它適宜的加熱設(shè)備中，微溫溶解。用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，使其比規(guī)定的pH值略高0.40.6，煮沸，用棉（紙）漿減壓抽濾或以脫脂棉，濾紙等濾材過(guò)濾，使培養(yǎng)基澄清。4.3.2 加入葡萄糖和指示液，搖勻，補(bǔ)足水量，調(diào)節(jié)pH值（比規(guī)定的pH值略高0.20.4），使滅菌后為7.10.2，分裝，裝量不宜超過(guò)容器的2/3，以免滅菌時(shí)溢出。

19、4.3.3 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基的氧化層（粉紅色）不超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/2，滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的顏色不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/5，否則，須經(jīng)100水浴或流通蒸汽加熱至粉紅色消失（不超過(guò)20分鐘），迅速冷卻。培養(yǎng)基只限加熱一次，并防止被污染。4.3.4 滅菌應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序進(jìn)行。培養(yǎng)基應(yīng)只能進(jìn)行一次蒸汽滅菌處理。固體培養(yǎng)基使用前的融化，不宜使用蒸汽滅菌柜融化瓊脂培養(yǎng)基，宜選用沸水浴融化培養(yǎng)基。4.4 未開(kāi)封脫水培養(yǎng)基應(yīng)避光儲(chǔ)存于25以下陰涼干燥處，已開(kāi)封的脫水培養(yǎng)基應(yīng)蓋緊，避光儲(chǔ)存于25以下陰涼干燥處。制備好

20、的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225避光的環(huán)境，有條件置冰箱48冷藏儲(chǔ)存較好。培養(yǎng)基若保存于非密閉容器中，應(yīng)在三周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，可在一年內(nèi)使用。4.5 培養(yǎng)基的裝量4.5.1 對(duì)于采用直接接種法檢查的液體樣品，培養(yǎng)基的裝量與供試品的裝量相關(guān)，供試品的裝量小于20ml的樣品，培養(yǎng)基裝量15ml；供試品的裝量大于或等于20ml小于50ml的樣品，培養(yǎng)基裝量40ml；供試品的裝量大于或等于50ml小于100ml的樣品，培養(yǎng)基裝量80ml。4.5.2 對(duì)于采用直接接種法檢查的固體樣品（含藥品及外科用輔料棉花及紗布），培養(yǎng)基的裝量均為100ml；對(duì)于縫合線、一次性醫(yī)用材料及醫(yī)療器具，如果醫(yī)療器具體積過(guò)大

21、，培養(yǎng)基的裝量可在2000ml以上，以將其完全浸沒(méi)為準(zhǔn)。4.5.3 對(duì)于采用薄膜過(guò)濾法檢查的樣品，若用封閉式薄膜濾器操作的，培養(yǎng)基裝量100ml；若用開(kāi)放式薄膜濾器操作的，培養(yǎng)基裝量50ml。4.6 培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的檢查包括無(wú)菌檢查和靈敏度檢查；符合規(guī)定者方可用于供試品的無(wú)菌檢查。培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查可在供試品的無(wú)菌檢查前或與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行，但是，一旦所用培養(yǎng)基不符合無(wú)菌要求，供試品的無(wú)菌檢查結(jié)果應(yīng)視為無(wú)效。培養(yǎng)基的靈敏度檢查應(yīng)對(duì)購(gòu)進(jìn)的每個(gè)批號(hào)的脫水培養(yǎng)基進(jìn)行靈敏度檢查，檢查合格后方可使用，但當(dāng)培養(yǎng)基的配制方法和滅菌程序發(fā)生變更時(shí)，應(yīng)再次對(duì)培養(yǎng)基的靈敏度進(jìn)行檢查。4.6.1 培

22、養(yǎng)基無(wú)菌檢查的操作及結(jié)果判定每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支（瓶），按規(guī)定溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。4.6.2 培養(yǎng)基靈敏度檢查的操作及結(jié)果判定取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9支，分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，每支接種菌量為1ml（含菌小于100cfu），另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種白色念珠菌、黑曲霉各2支，每支接種菌量為1ml（含菌小于100cfu），另1支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5天；逐日觀察結(jié)果?？瞻讓?duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。對(duì)于配制后

23、的選擇性培養(yǎng)基的靈敏度檢查試驗(yàn)同上。5 方法驗(yàn)證試驗(yàn)為保證檢驗(yàn)質(zhì)量，對(duì)所用的檢驗(yàn)方法必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，才能確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。當(dāng)建立藥品的無(wú)菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)供試品在高實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計(jì)。若供試品的生產(chǎn)工藝，遠(yuǎn)、輔料組分或檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，檢查方法應(yīng)進(jìn)行重新驗(yàn)證。針對(duì)藥品的無(wú)菌檢查試驗(yàn)，在確定產(chǎn)品的無(wú)菌檢查試驗(yàn)方法時(shí)或建立新的檢查方法時(shí)，或當(dāng)試驗(yàn)條件（包括培養(yǎng)條件）發(fā)生變更時(shí)，都必須要對(duì)新的或變更后的檢驗(yàn)方法加以驗(yàn)證，以確認(rèn)供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計(jì)。確保在實(shí)際檢驗(yàn)條件下，該供試品的無(wú)菌檢查法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。驗(yàn)

24、證時(shí)，按“供試品的無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作試驗(yàn)。供試品對(duì)每一試驗(yàn)菌的抑菌活性應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證用菌種、菌液制備、各試驗(yàn)菌對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度、參見(jiàn)3.1及3.1部分。5.1 薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證試驗(yàn)將規(guī)定量的供試品按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌少于100CFU。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基直接加至濾筒內(nèi)。另取一濾筒，不過(guò)濾供試品，其它操作同上，作為陽(yáng)性對(duì)照，將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。各試驗(yàn)菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基逐一進(jìn)行驗(yàn)證。5.2 直接接種法驗(yàn)證試驗(yàn)取適量裝置的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8管，分別加入金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭

25、菌的菌液各兩管；取適量裝量的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別加入白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各兩管。每管加菌量小于100cfu。其中1管接入規(guī)定量的供試品，另1管作為陽(yáng)性對(duì)照，各試驗(yàn)管按相應(yīng)規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天。5.3 判斷與陽(yáng)性對(duì)照比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，并且與陽(yáng)性對(duì)照容器內(nèi)的培養(yǎng)結(jié)果相似，則供試品的該檢驗(yàn)量在檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用消除，供試品可按該法進(jìn)行無(wú)菌檢查。若含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，若采用的是直接接種法，可根據(jù)實(shí)際情況增加培養(yǎng)基的用量、在沖洗液或培養(yǎng)基中使用中和劑（如內(nèi)酰胺酶、對(duì)氨基苯甲酸、聚山梨脂80）、或

26、改為薄膜過(guò)濾法。若采用的是薄膜過(guò)濾法，可采用增加沖洗液的用量、改變沖洗液的種類、更換濾膜品種等方法消除供試品的抑菌作用。并重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。已進(jìn)行過(guò)無(wú)菌檢查法方法驗(yàn)證試驗(yàn)的供試品，按此法進(jìn)行無(wú)菌檢查。6 供試品的無(wú)菌檢查6.1 檢驗(yàn)數(shù)量及檢驗(yàn)量檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表1規(guī)定，應(yīng)盡量抽取批生產(chǎn)開(kāi)始和結(jié)束或生產(chǎn)過(guò)程出現(xiàn)異常情況下的產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2、表3規(guī)定。表1、表2、表3中（見(jiàn)2005年版中國(guó)藥典附錄無(wú)菌檢查法）最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)用量。一般情況下，供試品無(wú)菌檢查若采用薄膜過(guò)濾，應(yīng)增加1/2的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽(yáng)

27、性對(duì)照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品1支（或瓶）作陽(yáng)性對(duì)照用。檢驗(yàn)量是指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g或ml）。除另有規(guī)定外，每份培養(yǎng)基接種的供試品量按藥典附錄無(wú)菌檢查法項(xiàng)下表1、表2、表3規(guī)定。采用直接接種法時(shí)，若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種法的總結(jié)婚總量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過(guò)濾。6.2培養(yǎng)基用量 除另有規(guī)定外，供試品無(wú)菌檢查時(shí)，每支培養(yǎng)基的實(shí)際裝量及所占容器高度的比例應(yīng)與“驗(yàn)證試驗(yàn)”所用的培養(yǎng)基相同。6.3陽(yáng)性對(duì)照供試品無(wú)菌檢查應(yīng)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。陽(yáng)性

28、對(duì)照菌的選擇原則：應(yīng)根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果選擇相應(yīng)對(duì)照菌（見(jiàn)中國(guó)藥典2005年版附錄無(wú)菌檢查法），陽(yáng)性對(duì)照管的加菌量的加菌量為小于100個(gè)cfu。陽(yáng)性對(duì)照的供試品用量同供試品無(wú)菌檢查中每份培養(yǎng)基接種的樣品量按中國(guó)藥典2005個(gè)年版附錄無(wú)菌檢查法項(xiàng)下表2、表3，陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)872小時(shí)，應(yīng)生長(zhǎng)良好。6.4陰性對(duì)照凡無(wú)菌檢查，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。6.5無(wú)菌檢查操作無(wú)菌檢查法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。6.5.1供試品在移入緩沖間前應(yīng)除去外包裝、消毒外表面并編號(hào)，培養(yǎng)基管（瓶）用0.1新潔爾滅或酒精棉控試瓶（管）外壁，然后

29、連同其他用具（包括無(wú)菌衣、帽、口罩等）移入緩沖間，開(kāi)啟操作間紫外燈和空氣過(guò)濾裝置并使其工作1小時(shí)以上。6.5.2操作人員用肥皂、水清洗雙手，關(guān)閉紫外光燈，進(jìn)入沖間，換拖鞋，再用75乙醇棉球擦手，穿戴衣、帽、口罩、手套。將所需手品剝?nèi)ヅＦぜ?，移入無(wú)菌間，每次試驗(yàn)中所用物品必須計(jì)劃好，并有備用物。6.5.3供試品外部消毒6.5.3.1將消毒過(guò)的粉針劑、油劑等鋁蓋壓封的橡皮塞小瓶，先用75乙醇或碘伏棉球擦試外壁及瓶塞，待干，用滅菌鑷子剔去鋁蓋上的鋁質(zhì)小圓片，過(guò)火焰數(shù)次。6.5.3.2將消毒過(guò)的安瓿針劑先用碘酒棉球或伏棉球?qū)碴惩獠坎猎嚋缇?，待干，用砂輪或滅菌銼輕割安瓿頸部（便于拆開(kāi)安瓶），再用75乙

30、醇棉球?qū)⒌饩撇羶?，待干?.5.3.3其他供試品容器表面或外包裝，可參照上述用適當(dāng)消毒液擦試或浸沒(méi)后以無(wú)菌的方式取內(nèi)容物。6.5.4供試品制備用滅菌鑷取出器，在火焰旁將針芯插入釧管并安上針頭，供試品瓶蓋和注射器針頭均應(yīng)迅速通過(guò)火焰數(shù)次，當(dāng)供試品為粉針劑，瓶蓋為橡膠塞時(shí)，用注射器吸取規(guī)定的溶劑，在已消毒好的橡膠塞中心位置刺入小瓶加入溶劑，溶解，混勻后吸出溶液，或選用其它適宜的方法。如為注射液、供角膜創(chuàng)傷及手術(shù)用的滴眼劑或滅菌溶液等可趨勢(shì)用注射器吸取藥液，或選用其它適宜的方法。按規(guī)定或需滅活的供試品可用滅活劑溶解，將瓶?jī)?nèi)供試液抽出稀釋至規(guī)定的濃度。需加入空氣加壓后便于抽出的供試品，應(yīng)用器對(duì)著火焰抽

31、取空氣加入，抽取瓶中液體時(shí)，應(yīng)將供試品倒置并使針頭在液面下。供試品如為直接健壯成注射用無(wú)菌粉末的原料藥（大包裝粉針劑），取樣時(shí)為縮短暴露時(shí)間，應(yīng)由兩人操作。將旋轉(zhuǎn)于緩沖間的包裝瓶用0.1新潔爾滅抹凈外壁，且經(jīng)紫外線照射1小時(shí)后移入操作間（臺(tái)），除去鋁蓋，用75乙醇棉或碘伏棉球擦拭瓶口橡膠塞外壁和瓶口縫隙，待干，戴好醫(yī)用消毒手套，在火焰旁小心揭開(kāi)瓶塞，用專用取樣器取出規(guī)定量的樣品，置滅菌試管中，密塞待用，立即蓋好大包裝瓶塞，用橡皮膠布及時(shí)封口，再用封箱紙包扎瓶口。如果容器內(nèi)有一定的真空，可用適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌器材（如一端帶有除菌過(guò)濾器的針頭），向供試品容器內(nèi)導(dǎo)入無(wú)菌空氣，再按無(wú)菌操作開(kāi)啟容器取出內(nèi)容物。

32、供試品處理時(shí)所用的溶劑、乳化劑，分散劑，中和劑及其用量應(yīng)驗(yàn)證是有效的，并對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)影響。除另有規(guī)定外，供試品處理及接種，按下更方法進(jìn)行。6.5.5薄膜過(guò)濾法無(wú)菌檢查用的濾膜孔徑為不大于0.45m，直徑約為50mm。應(yīng)根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)，如抑菌性供試品采用低吸附性的濾膜、油性供試品選用疏水性濾膜。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。同時(shí)每片濾膜的總過(guò)濾量不宜太大，以避免濾膜上的微生物受損傷。 薄膜過(guò)濾法采用封閉式薄膜過(guò)濾器或開(kāi)放式薄膜過(guò)濾器，可優(yōu)先選用封閉式薄膜過(guò)濾器。如采用封

33、閉式過(guò)濾器時(shí)，將一次性集菌培養(yǎng)器（依供試品種類不用選擇適宜的集菌培養(yǎng)器如抗生素類采用抗生素專用集菌培養(yǎng)器）放于電控集菌儀的排液槽上，培養(yǎng)器的塑膠軟導(dǎo)管放于電控集菌儀的蠕動(dòng)泵槽內(nèi)，其進(jìn)液導(dǎo)管的雙芯針頭，插入供試液或沖洗液等容器的塞上。6.5.5.1 操作打開(kāi)待檢樣品的鋁蓋，復(fù)溶。吸取適量藥液加入0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶液至具塞的瓶中，混勻。如采用封閉式過(guò)濾器，取出培養(yǎng)器先檢查包裝是否完好無(wú)損，將培養(yǎng)器逐個(gè)插放在不銹鋼座上，將培養(yǎng)器的彈性軟管裝入集菌儀泵頭，注意定位準(zhǔn)確，軟管走勢(shì)順暢。將培養(yǎng)器導(dǎo)管上的針頭插至供試液容器塞上，開(kāi)動(dòng)電控集菌儀電源，將樣品瓶倒置固定于支架上，使藥液均勻通過(guò)集

34、菌培養(yǎng)器，待藥液排盡，關(guān)閉電源，將針頭取下，插至裝有適宜沖洗液的瓶塞內(nèi)，沖洗集菌培養(yǎng)器的濾膜，照上述操作要求，沖洗次數(shù)及沖洗量與驗(yàn)證試驗(yàn)保持一致。濾干，關(guān)閉電源。將集菌培養(yǎng)器的排氣孔上膠帽取下，集菌培養(yǎng)器底部的排液管口擰上，將沖洗液瓶取下?lián)Q上相應(yīng)的培養(yǎng)瓶，啟動(dòng)電源，將培養(yǎng)基泵入指定的培養(yǎng)器內(nèi)，關(guān)閉電源。用小夾夾閉與培養(yǎng)器連接部的軟管，在軟管剪切線的位置剪斷軟管，將軟管開(kāi)口端套在空氣過(guò)濾器開(kāi)口上。每次操作時(shí)，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑、及沖洗液同法操作，作為陰性對(duì)照。將已操作完畢的含培養(yǎng)基的集菌培養(yǎng)器移出無(wú)菌室，取其中一管作為陽(yáng)性對(duì)照，依陽(yáng)性對(duì)照菌選擇原則加入相應(yīng)的對(duì)照菌液。按固定溫度與時(shí)間培養(yǎng)。大

35、容量非抗菌作用的供試品，薄膜過(guò)濾后，無(wú)須沖洗。6.5.5.2 注意事項(xiàng)對(duì)具有抗菌活性的固體制劑或液體制劑，在過(guò)濾膜前，要根據(jù)供試品的抗菌活性的強(qiáng)弱選用適宜、適量的溶劑溶解及稀釋；淋（沖）洗樣品時(shí)流速不易過(guò)快。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，其總的沖洗量不宜過(guò)大，沖洗量及沖洗方法參照方法驗(yàn)證試驗(yàn)。為揮發(fā)濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程中，若需要使用表面活性劑、滅活劑、中和集等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物生長(zhǎng)及存活無(wú)影響。6.5.6 直接接種

36、法6.5.6.1 操作 用適當(dāng)滅菌用具，取上述制備妥的供試品在近火焰區(qū)以右手握拳，以小指為主拔開(kāi)培養(yǎng)基管的塞子，管口通過(guò)火焰，移至火焰下側(cè)，沿著培養(yǎng)基管壁分別接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基11管，（其中1管于操作結(jié)束后移至接種室接種金黃色葡萄球菌對(duì)照菌液1ml），改良馬丁培養(yǎng)基10管，輕輕搖動(dòng)使勻，培養(yǎng)14日。每次操作時(shí)，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑，同法操作，作為陰性對(duì)照。6.5.7 培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)、填寫檢查記錄表。如加入供試品后，或在培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14日后，不能從外觀上判斷無(wú)微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量接種于同種新鮮培養(yǎng)基中或斜面上，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)

37、48小時(shí)，真菌培養(yǎng)72小時(shí)，觀察是否再現(xiàn)渾濁或斜面上有無(wú)菌生長(zhǎng)；或用接種環(huán)取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，進(jìn)行判斷。6.5.8 結(jié)果判定若供試品管勻澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判斷供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含。當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。（1）無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求：（2）回顧無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。（3）陰性對(duì)照管有菌生長(zhǎng)。（4）供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技

38、術(shù)不當(dāng)引起的。試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無(wú)效，應(yīng)重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試，若無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。無(wú)菌檢查法附錄1 培養(yǎng)基及其制備方法培養(yǎng)基可按以下處方制備，亦可使用按該處方的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。置備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225、避光的環(huán)境。培養(yǎng)基若保存于非密閉容器中，應(yīng)在三周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，可在一年內(nèi)使用。1.1 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)需氣菌、厭氣菌）酪胨（胰酶水解） 1.50g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化鈉 2.5gL胱氨酸 0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml硫乙醇酸鈉 0

39、.5g 瓊脂 0.50.7g（或硫乙醇酸0.3ml） 水 1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入說(shuō)中混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.10.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的顏色不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/3，否則，須經(jīng)100水浴加熱至粉紅色消失（不超過(guò)20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被污染。1.2硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（用于黏稠供試品的直接接種法）按硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基處方，去除瓊脂和刃天青，取其余成分，如法配制，即得。此培養(yǎng)基應(yīng)在厭氧