平白術(shù)多糖與氨基酸提取及含量測定研究

1、平白術(shù)多糖與氨基酸提取及含量測定研究【摘要】目的為開發(fā)利用平白術(shù)的藥用價(jià)值提供理論根據(jù)，分別提取別離平白術(shù)中有效成分多糖和氨基酸，并分別測定平白術(shù)多糖和氨基酸的含量。方法采用L934實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，苯酚-硫酸法測定白術(shù)多糖的含量。以茚三酮為衍生試劑，采用柱后衍生法測定平白術(shù)中氨基酸含量。結(jié)果平白術(shù)多糖的含量為15.3%。平白術(shù)中至少含有17種氨基酸，總氨基酸含量為73.73gg-1。結(jié)論方法簡單、有效、快速、準(zhǔn)確、靈敏，合適于分析測定白術(shù)中多糖和氨基酸的含量?！娟P(guān)鍵詞】平白術(shù)；多糖；氨基酸Keyrds:AtratyldesarephalaKidz；Plysaharide;Ainaid白術(shù)是傳

2、統(tǒng)中藥，?中國藥典?收載的白術(shù)為菊科植物AtratyldesarephalaKidz的枯燥根莖，白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之效1。?中國藥典?2022年版第一部記載含白術(shù)的處方有91個(gè)。近幾年以來，中國對白術(shù)的需求量大增，居全國大宗常用中藥材之首。由于其含有白術(shù)多糖、揮發(fā)油、氨基酸等多種有效成分而倍受藥物研究工作者的關(guān)注，使白術(shù)的臨床應(yīng)用日趨廣泛2，其研究也更為深化、更為多元化。然而，迄今為止，對白術(shù)中營養(yǎng)成分氨基酸研究甚少。為了開發(fā)利用白術(shù)的藥用價(jià)值，本文對湖南平江產(chǎn)白術(shù)平白術(shù)進(jìn)展研究，提取平白術(shù)多糖、氨基酸，采用正交實(shí)驗(yàn)選擇多糖顯色條件，用苯酚-硫酸法測定多糖含量。以茚三酮作衍生

3、試劑，采用柱后衍生法測定氨基酸含量。1材料1.1儀器1.2試劑無水乙醇、硫酸鋅、氫氧化鋇、硫酸、苯酚、茚三酮、檸檬酸。三鈉、醋酸鈉均為分析純,平江白術(shù)由湖南藥材公司提供、果糖標(biāo)準(zhǔn)品市售、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供。2方法與結(jié)果2.1顯色條件的考察2.1.1苯酚濃度對顯色單因素的影響汲取標(biāo)準(zhǔn)溶液1l于10l具塞試管中，精細(xì)參加1l不同濃度的苯酚和5l濃硫酸，混勻，放置5in。移入25的水浴中保溫20in。冷卻。以蒸餾水1l加相應(yīng)的試劑作空白，測定吸收度。見圖1，表1。表1苯酚濃度的考察略實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,苯酚濃度在4%7%范圍內(nèi)所得吸收值相近,苯酚濃度為5%時(shí)所得吸收值較大,應(yīng)選

4、擇苯酚濃度為5%。2.1.2苯酚-硫酸法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3實(shí)驗(yàn)因素程度表設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)選擇苯酚用量5%苯酚、濃硫酸用量、水浴溫度和水浴中的放置時(shí)間4個(gè)因素作為考察對象，根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素確定3個(gè)程度，采用L934正交表進(jìn)展實(shí)驗(yàn)見表2。以吸收度為評價(jià)指標(biāo)表3。對結(jié)果進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得方差分析見表4。表2實(shí)驗(yàn)因素程度略表3L934正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果略表4方差分析略經(jīng)方差分析可知，苯酚用量、濃硫酸用量、水浴溫度及水浴放置時(shí)間對吸收度影響不顯著，但綜合比擬，本實(shí)驗(yàn)選擇苯酚-硫酸法最正確顯色條件為A3B13D2即苯酚1.2l，濃硫酸4l，水浴溫度25，水浴放置時(shí)間30in。2.2測定波長的選擇精細(xì)稱取一定量多糖樣

5、品置小燒杯中，加水溶解，定量轉(zhuǎn)移至100l量瓶中，加水至刻度，混勻。汲取該樣品2l于試管中，加5%苯酚水溶液1.2l混勻，迅速參加4l濃硫酸，振搖10in，在25水浴保溫放置30in，取出冷卻，以苯酚-硫酸溶液為空白，于400800n范圍掃描，選擇最大吸收波長488.4n為測定波長。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線精細(xì)稱取105枯燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)果糖18.70g，加水溶解至250l，配成74.8g/l的標(biāo)準(zhǔn)儲藏液。取10l具塞試管，分別加上述標(biāo)準(zhǔn)液0.0，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70l，加水稀釋至1l，搖勻，每個(gè)試管各加5%苯酚水溶液1.2l混勻，再迅速參加4l濃硫酸，振搖

6、10in，在25水浴保溫放置30in。以水作空白在488.4n處測定各標(biāo)準(zhǔn)液的吸收度，得回歸方程A=0.0983+0.0.0926r=0.9994。其在120.6g/l濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.4換算因素測定精細(xì)稱取枯燥的平白術(shù)多糖20g，用蒸餾水溶解后定容至100l，作為多糖儲藏液。準(zhǔn)確量取多糖儲藏液0.2l，加水至1.0l，按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法測其吸光度值。按下式計(jì)算換算因素：f=/D，試中：為多糖質(zhì)量g，為多糖液中果糖的濃度g/l，D為多糖的稀釋因素，測得f=1.24。2.5平白術(shù)多糖、氨基酸的提取2.5.1平白術(shù)多糖的提取4精細(xì)稱取白術(shù)粗粉50g置于10

7、00l的容量瓶中，加6倍量70%的乙醇回流2h。過濾，取濾渣加8倍蒸餾水回流2h，趁熱過濾。在濾渣中加6倍水回流1h，趁熱過濾。再在濾渣中加3倍量水回流1h，趁熱過濾，合并3次濾液，濃縮至100l，加無水乙醇至乙醇濃度達(dá)85%，再用75%乙醇沖洗，離心，反復(fù)6次，去溶液取沉淀。加水溶解，用5%ZnS44l和飽和BaH2溶液16l振搖，離心去蛋白，反復(fù)10次5。將所得溶液置于冰箱中過夜，次日取出溶解，在8000r/in離心15in，反復(fù)4次。用氯仿-正丁醇41與溶液按51的比例混合攪拌15in，離心，反復(fù)3次，得澄清液即白術(shù)多糖溶液。加水至100l冷藏備用。2.5.2平白術(shù)氨基酸的提取稱取平白術(shù)

8、粉末40g過80目投入裝有攪拌器、溫度計(jì)、回流冷凝器的三頸燒瓶中，參加6l/L的鹽酸100l，加熱水解24h，反響溫度保持在(1101)左右。濾渣用少量稀鹽酸浸泡，過濾，重復(fù)兩次，搜集3次濾液得水解液，加熱7h趕鹽酸。在濾液中參加0.5g活性碳且維持濾液在(8090)，磁力攪拌脫色30in，重復(fù)2次，減壓濃縮得到50l橙紅色的溶液，作為儲藏液。于4的冰箱中保存。2.6平白術(shù)多糖和氨基酸含量的測定2.6.1樣品多糖含量的測定平白術(shù)多糖提取液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后，精細(xì)汲取1.0l，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定吸光度，計(jì)算平白術(shù)多糖的含量。按下式計(jì)算多糖含量：多糖含量=Df100%，式中：為多糖質(zhì)量g，為多糖

9、液中果糖的濃度g/l，D為多糖的稀釋因素，f為換算因素。測得多糖的含量為15.3%。2.6.2回收率實(shí)驗(yàn)在樣品液中精細(xì)參加不同濃度的果糖標(biāo)準(zhǔn)液n=5，按2.3項(xiàng)下操作，并適當(dāng)稀釋，以樣品液為空白，測定吸收度，計(jì)算回收率。平均回收率為98.5%，RSD=2.1%n=5。結(jié)果如表5。表5回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果略2.6.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取樣品在8h內(nèi)測定吸收度，1次/h。樣品在4h內(nèi)穩(wěn)定，RSD=1.2%。2.6.4平白術(shù)氨基酸的測定條件6實(shí)驗(yàn)條件：L-8800型全自動氨基酸分析儀，鈉型陽離子交換柱4.660，分析時(shí)間35in，流動相檸檬酸三鈉緩沖液pH3.24.9，四元梯度洗脫，緩沖液流速0.4l/in，茚三

10、酮流速0.35l/in，緩沖液泵壓力811.5Pa，茚三酮泵壓力0.91.2kPa，柱溫50，氮?dú)鈮毫?0kPa。柱的衍生條件：反響液A：390g茚三酮/L丙二醇甲醚，反響液B：醋酸鈉/醋酸：丙二醇甲醚6040；供試品和對照品溶液進(jìn)樣量均為20l。2.6.5平白術(shù)氨基酸含量的測定按上述色譜條件，使用日立L-8800AAA分析儀進(jìn)展樣品測定。別離得到的氨基酸譜圖如圖23。樣品中氨基酸的含量結(jié)果見表6。表6平白術(shù)中氨基酸含量測定結(jié)果略3討論3.1本實(shí)驗(yàn)采用75%乙醇提取除去平白術(shù)所含單糖、低聚糖等干擾性成分后，再用水提醇沉法制得白術(shù)多糖。在采用Sevag法去蛋白至少重復(fù)67次，才能根本上除去蛋白，

11、且多糖損失率也較大。本實(shí)驗(yàn)采用硫酸鋅與飽和氫氧化鋇溶液脫蛋白后，再加冷凍-Sevag法除蛋白，去蛋白比擬徹底。在進(jìn)展乙醇沉淀時(shí)，85%的乙醇濃度已能將多糖根本沉淀出來，增加乙醇濃度對多糖的得率影響并不顯著。多糖采用真空枯燥法，可防止加熱枯燥而出現(xiàn)多糖變黏稠或碳化而結(jié)塊現(xiàn)象。3.2氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)分子的根本單位，與生物的生命活動親密相關(guān)，尤其與人類安康有著嚴(yán)密的關(guān)系。本分析結(jié)果說明，平白術(shù)氨基酸至少含有17種氨基酸，總含量為73.73gg-1。必需氨基酸和半必需氨基酸在人體中具有重要的作用，缺一不可，否那么可引起生理功能異常，導(dǎo)致疾?？偘被嶂泻刑K氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等7種人體必需氨基酸，并含胱氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸等4種半必需氨基酸。必需氨基酸和半必需氨基酸在總氨基酸中分別占12.7%，17.8%。在水解氨基酸時(shí)，溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在1101，水解24h，才能使蛋白質(zhì)完全水解。3.3本研究為白術(shù)中有效成分多糖及氨基酸的提取分析、質(zhì)量評價(jià)提供了一個(gè)新的定量標(biāo)準(zhǔn)，為開發(fā)利用平江白術(shù)提供了理論根據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1國家藥典委員會.中國藥典，部S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：77.2劉思貞，邵玉芹，祝希嫻.白術(shù)藥理研究進(jìn)展J.時(shí)珍國醫(yī)國藥，1999，108：634.3張維杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù).上海：