腸道微生物的分離與鑒定方法

1、一、有益菌：乳酸桿菌，雙歧桿菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽抱桿菌（枯草、地衣）。5 種有害菌：大腸桿菌，沙門氏菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，空腸彎曲桿菌。4 種二、厭氧菌：乳酸桿菌，雙歧桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。5 種需氧菌：芽抱桿菌。1 種兼性厭氧菌：大腸桿菌，沙門氏菌。2 種注：空腸彎曲桿菌：微需氧菌,在含 2.5-5%氧和 10%C02 的環(huán)境中生長最好。最適溫度為3742C。在正常大氣或無氧環(huán)境中均不能生長。95%例較少。性球菌、乳桿菌及梭菌。四、無氧環(huán)境的簡易操作：1、方法來自文獻健康羊駝糞球中主要正常菌群的分離與初步鑒定采用干燥器培養(yǎng)空間用焦性沒食子酸 Wg、10%氫氧化鈉溶100m

2、L,10%的氫氧化鈉液置于干燥器皿底部，然后放置2 3 個略高于液面的青霉素小瓶，再按比例稱取焦性沒食子酸用紙包好，放在圓柱上。既而放上隔板，將接種完畢的培養(yǎng)基放于隔板上，同時放37c 培養(yǎng)24 48h 觀察結(jié)果。2、方法來自文獻健康豬腸道菌群的分離培養(yǎng)與耐藥性分析后者先擰緊瓶蓋，放入密封性較好的玻璃罐（用凡士林封口），經(jīng)過蠟燭燃燒 法治作簡易厭氧裝置。五、CO 2 培養(yǎng)箱不可代替無氧培養(yǎng)箱90%氮氣+5%氫氣+5%5%二氧化碳+95%02 WOOPpm（千分之一），300Ppm （萬分之三），C02 培養(yǎng)箱C02280-2000ppm,CO2（1ppm 即百萬分之一）。目前培養(yǎng)厭氧微生物的簡

3、便而又有效的技術(shù)囊括有：厭氧箱培養(yǎng)術(shù)；厭氧罐培養(yǎng)技術(shù)；厭氧袋培養(yǎng)技術(shù)；1 . 一般性的細菌培養(yǎng)標本若需延遲送檢時，應(yīng)置于 4 度冰箱保存，且 不能超過 24小時。2.臨床標本最佳運送時間取決于標本的量，少量液體（1ml） 或組織（小于 1cni3）應(yīng)在 1530 分鐘內(nèi)送到實驗室，較多量的標本置于運送培養(yǎng)基中1224 24 小時。低溫關(guān)于一些厭氧菌有害。采樣和運輸：同時間、同地點、同位置訣別取兩管平行糞樣，可適量多取，一輸，厭氧菌放置于厭氧生物袋常溫運輸（24h4c冰箱保存，厭氧菌放置于常溫保存?；蛄蚧c做還原劑，消除培養(yǎng)皿內(nèi)部氧氣。1 . 一般性的細菌培養(yǎng)標本若需延遲送檢時，應(yīng)置于 4 度冰

4、箱保存，且不能超過 24小時。2 .臨床標本最佳運送時間取決于標本的量，少量液體（1ml） （小1cni3）153024 小時。低溫關(guān)于一些厭氧菌有害。研研培究養(yǎng)微生位樣培養(yǎng)皿物種文獻名稱置品培養(yǎng)基種類條件培養(yǎng)時間度類檢測菌株囊括: 雙歧桿菌, 擬桿菌 ， 優(yōu)桿化胃腸道菌胃性球群和胃腸腸需菌，黏膜屏障道糞選擇性培養(yǎng)基，具體氧，乳桿的檢測菌便不詳厭氧 24-72h菌及球母 O10 種雙歧桿菌, 乳酸貴州小型菌，豬胃腸道擬桿正常菌群腸10種菌的選擇性培養(yǎng)需需氧菌，的初步檢道糞基和需氧、厭氧的非氧，菌:24-48h 慶消化菌便選擇性培養(yǎng)基厭氧氧菌：48-72h 37cC球榮球菌梭菌腸桿菌腸球菌葡萄球

5、菌。酵 母； 菌10油肉湯浸液瓊脂，EC3411J-I糞24-48h3酉C7培u孝母養(yǎng)禎J驗用J菌，桿 5種桿 桿健康豬腸道菌群的菌,分離培養(yǎng)腸麥康凱瓊脂，MRS增需雙歧與耐藥性 道 糞 菌液，HYA 瓊脂，TYP 氧，需氧菌:24h,菌。3分析菌便瓊脂厭氧厭氧菌：48h 37C種健康與腹健康與腹SS瓊脂培養(yǎng)大腸瀉幼犬腸基，甘油肉湯浸液瓊桿道菌群數(shù)腸脂培養(yǎng)基，MRS乳酸需菌，量差異分道糞菌、ECEMB氧，沙門析研究菌便腸桿菌，TPY 雙歧桿厭氧24-48h37C 氏用培養(yǎng)基MRS 培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊健康鴿與脂平板，雙歧桿菌腹瀉鴿腸腸取養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基，需道菌群比道腸 EC 培養(yǎng)基，生化試驗 氧，

6、水貂糞便糞營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，莫厭氧48-72h菌 ， 腸球菌 ， 乳酸桿菌， 雙歧桿菌。5種 芽抱 桿菌 ， 乳 酸 桿菌， 雙 歧 桿菌，大腸腸球菌。537 c 乳酸較研究菌道培養(yǎng)基厭氧24-72h37c種乳酸桿菌乳酸桿菌MRS的分離與培養(yǎng)基，營養(yǎng)肉湯培菌，鑒定養(yǎng)基，生化試驗培養(yǎng)嗜酸基性乳酸桿菌， 干酪乳酸桿菌。3種桿 水貂糞便糞營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，莫厭氧 48-72h37 c 乳酸豬源益生豬源益生地衣芽抱桿菌芽孑包的分離鑒LB 培養(yǎng)基，淀粉培養(yǎng)桿定與生物基，酪素培養(yǎng)基，竣需菌，學(xué)特性分糞甲基纖維素鈉培養(yǎng)氧,枯草便基。厭氧18-24 h37C芽抱桿菌。3種厭氧菌的培養(yǎng)方法厭氧菌在有氧的情況下不能生

7、長。要培養(yǎng)厭氧菌，必需創(chuàng)造一個無氧的環(huán) 境。通常用培養(yǎng)基中加入還原劑，或用物理、化學(xué)方法去除環(huán)境中的游離氧，以 降低氧化還原電勢。如皰肉培養(yǎng)基、硫基乙酸鈉培養(yǎng)基，牛心腦浸液培養(yǎng)基等。 常用的厭氧培養(yǎng)方法有許多，可根據(jù)實際情況選用。厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學(xué)的方法使缸內(nèi)造成厭氧壞境，從而將 厭氧菌培養(yǎng)出來。氣，內(nèi)裝氣體發(fā)生管、美蘭指示劑管、鉗催化劑管、干燥劑。放入已接種好 的平板后，盡快擠出袋內(nèi)空氣，然后密封袋口。先折斷氣體發(fā)生管，后折斷美 蘭指示劑管，命名袋內(nèi)在半小時內(nèi)造成無氣環(huán)境。如不突變表示袋內(nèi)已達厭氧 狀態(tài)，可以孵育。便基。厭氧18-24 h37C芽抱.厭氧手套箱：是迄今為止國際上

8、公認的培養(yǎng)厭氧菌最佳儀器之一。它是一個密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個有機玻璃做的透明面板，板上裝有 兩個手套，可經(jīng)過手套在箱內(nèi)進行操作，故名。箱側(cè)有一交換室，具有內(nèi)外二 門，內(nèi)門通箱內(nèi)先關(guān)著。欲放物入箱，先打開外門，放入交換室，關(guān)上外門進 行抽氣和換氣達到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門打開，將物品移入 箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門。箱內(nèi)保 持厭氧狀態(tài)，也是利用充氣中的氫在鉗的催化下和箱 中錢殘余氧化合成水的原理。該箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或孵箱即附在其 內(nèi)，還可放入解剖顯微鏡便于觀察厭氧菌菌落，這種厭氧箱適于作厭氧細菌的 大量培養(yǎng)研究，大量培養(yǎng)基可放入作預(yù)還原和厭氧性無菌試驗。金屬硬壁型厭 氧箱的抽

9、氣、充氣、厭氧環(huán)境和溫度等均系自動調(diào)節(jié)。.厭氧盒：原理同厭氧袋，有成品銷售。碳，供細菌生長用。我沒見過。NaHC03NaOH面，用融化的白蠟封邊，造成一個封閉空間。焦性末食子酸與堿反映后 耗氧。該法用于厭氧不嚴格的厭氧菌的培養(yǎng)，簡單。如有梭狀芽抱桿菌。7試管，液面封凡士林，造成無氧環(huán)境。厭氧菌標本的采集與送檢厭氧菌標本采集與送檢必需注意兩點：標本絕關(guān)于不能被正常菌群 所污染； 應(yīng)盡快避免接觸空氣。.采集：采集標本須注意：不被正常菌群污染，并且盡快避免接觸空氣。采集深部組織 標本時，需用碘酒消毒皮膚用注射器抽取，穿刺針頭應(yīng)準 確插入病變部位深部, 抽取數(shù)毫升即可，抽出后可排出一滴標本于酒精棉球上

10、。若病灶處標本量較少, 則可先用注射器吸取 1ml 還原性溶液或還原性肉湯，然后再抽取標本。在緊急情 況下，可用棉拭取材，并且用適合的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)送。厭氧培養(yǎng)最理想的檢查材料是 組織標本，因厭氧菌在組織中比在滲出物中更易生長醫(yī)。筒抽取等，應(yīng)嚴格無菌操作，嚴禁接觸空氣。不同部位標本采集方法也各有不同特點.送檢方法與處理標本送到實驗室后，應(yīng)在 20-30m i n 內(nèi)處理完畢，最遲不超過 2h,以防止標本中兼性厭氧菌過度繁殖而克制厭氧菌的生長。如不能即時接種， 可將標本置室溫保存（一般認為，冷藏關(guān)于某些厭氧菌有害，而且在低溫時氧的溶 解度較高）。針筒運送：一般用無菌針筒抽取標本后，排盡空氣，針頭插入無

11、菌橡皮塞，以隔絕空氣，立即送檢。這種方法多用于液體標本的運 送，如血液、膿液、 胸腹水、關(guān)節(jié)液等醫(yī).C02時先觀察瓶內(nèi)氧化還原指示劑的顏色，以判斷瓶內(nèi)是否為無氧環(huán)境，如合格將 用無菌注射器將液體標本注入瓶中即可。培養(yǎng)基，確保無氧環(huán)境，確保不被污染，確?？焖偎蜋z。無氧環(huán)境。該方法一般用于運送較大的組織塊或床邊接種的培養(yǎng)皿等。厭氧菌的分離鑒定及注意事項60 菌混合感染，故開展厭氧菌的試驗關(guān)于感染的診斷、治療都有重要意義。- 、厭氧菌樣本的采集 Co I I ect i on of anaerob i c bacter i a s spec imens標本避免正常菌群污染和氧接觸，采用下列方法：（1

12、）膿胸及未破潰的膿腫：皮膚消毒后,以無菌注射器抽取（排盡空針及針頭內(nèi)的氣體)，將針頭插入無菌橡皮塞內(nèi)送檢。肺分泌物和痰標本:用支氣刷采取或環(huán)甲膜穿刺術(shù)。尿液標本：用無菌注射器從恥骨上緣行膀脫穿刺術(shù)抽取。脈，待血液流出后將另一端針頭立即插入培養(yǎng)瓶內(nèi)(瓶內(nèi)負壓)，使血液直接 流入培養(yǎng)瓶內(nèi)。竇道、深部膿腫等的標本：可用特別采樣器采取。、涂片與染色 Smear preparation an stain+”表示。鏡檢不僅能反映各種厭氧菌的特殊形態(tài)，同時也能為鑒定藥物。三、標本接種 I nocu I at i ng3 5 % 10 % C02 的環(huán)境中培養(yǎng)。如果只要求檢出厭氧菌，只需接種個厭氧血瓊脂平板，

13、也可增加 1 個相應(yīng)的選擇厭氧血瓊脂平板。為便于在混合培 養(yǎng)3 1 2 1 硝嘩(5 mg/片)紙片，若出現(xiàn)隱約抑菌圈，則提示有厭氧菌生長。不同厭氧菌的生長速度和菌落形態(tài)各異，色素也有不同，熒光生與否也有助于鑒定，根據(jù)上述特征，可初步推測厭氧菌的種類：.革蘭陰性桿菌BBE瓊脂平板上有灰黑色、直徑1mm暈，可初步鑒定為脆弱擬桿菌。色熒光者，為產(chǎn)黑素普雷沃菌。擬桿菌。菌。是小韋榮球菌。.革蘭陽性球菌排列成長短不等的鏈，可能是消化鏈球菌。4.蘋蘭陽性無芽胞桿菌菌落呈臼齒形、粗糙，結(jié)核膿樣分泌物中有硫黃樣顆粒，可能是放線菌。X、YV排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸桿菌。5 Nagi er有莢膜，

14、可鑒定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。四、耐氧試驗 Oxygen to I era nee test45 2 塊需氧血 瓊脂平板1 46 區(qū)，每區(qū)種一個可疑菌 落)，然后將平板訣別放置在需氧、二氧化碳和厭氧壞境中培養(yǎng)。凡在厭氧環(huán)境生長而在需氧和二氧化碳環(huán)境中不生長的細菌為專性厭氧菌需氧和厭氧環(huán)境中均能生長者為兼性厭氧菌；在需氧和二氧化碳環(huán)境中生長，而在氧環(huán)境中不生長者為專性需氧菌；在需氧、厭氧環(huán)境中均不生長或生長不佳，而在二氧化碳環(huán)境中生長良好的細菌為 需二氧化碳菌。五、 鑒定試驗 I ent i f i cat i on test可依據(jù)厭氧菌的菌體染色形態(tài)、菌落特性以及關(guān)于某些抗生素的敏感性作出初步鑒定。最后鑒定則要進行生化反映及終末代謝產(chǎn)物等檢查。生化試驗主要囊括多種糖類發(fā)酵試驗、呻噪試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、卵磷脂酶試驗、脂酶試驗、明膠液化試驗及膽汁肉湯 生長試驗 和硫化氫試驗等。目前用于厭氧菌快速鑒定有胞外酶試驗，h VITEK-ANI、MicroS can- AN I 等