表達載體的構(gòu)建方法及步驟

1、令狐采學(xué)創(chuàng)作令狐采學(xué)創(chuàng)作表達載體的構(gòu)建方法及步驟令狐采學(xué)一、載體的選擇及如何閱讀質(zhì)粒圖譜NA 新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。一個合格質(zhì)粒的組成要素：復(fù)制起始位點(加即控制復(fù)制起始的位點。原核生物NA分子中只有一個復(fù)制起始點。而NA分子有多個復(fù)制起始位點。Amp+,Ian+MCS克隆攜帶外源基因片段P/E啟動子/增強子Terms終止信號poly(A)mRNA作用限制酶切位點。如果構(gòu)建的目3點：1NA重組體的目的，克隆擴增/基因表達，選擇合 適的克隆載體/表達載體。【2】.載體的類型：令狐采學(xué)創(chuàng)作克隆載體的克隆能力一據(jù)克隆片段大小(大選大，小選小)。如n)kb 選質(zhì)粒。表達載體據(jù)受體細胞類型一原核/真核/

2、細胞表達載體。關(guān)于原核表達載體應(yīng)該注意：選擇合適的啟動子及相應(yīng)的受體菌，用于表達真核蛋白質(zhì)時注意克服 4個困難和閱讀框錯位表達天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考?！?】載體 MCS中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不能產(chǎn)主閱讀框架錯位。綜上所述，選用質(zhì)粒(最常用)做載體的 5 點要求：選分子量小的質(zhì)粒，即小載體(l-1.5kb) 一不易損壞， 在細菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體)；1()上的拷貝，而嚴謹型質(zhì)粒1()個。必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；位 Ampr(試一試)。滿足自己的實驗需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒光標記，是否需要加入標簽蛋

3、白，是否需要真核抗性(如Pur。、 G418)等等。無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 NA 進行切割，獲得線性載體分子，以便于與令狐采學(xué)創(chuàng)作目的基因片段進行連接。如何閱讀質(zhì)粒圖譜第一步：首先看的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿 梭質(zhì)粒）第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什次篩選 標記。Ampr水解卩一內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨節(jié)的毒性。tetr可以阻止四環(huán)素進入細胞。camr生成氯霉素輕乙?；苌铮怪ザ拘?。neor（kanr）G418（生 物）失活hygr使潮霉素卩失活。O第三步：看多克隆位點（MCS） 它具有多個限制酶的單一切點。 便于外源基因的插入。

4、如果在這些酶切位點以外有外源基因的 插入，會導(dǎo)致某種標志基因的失活，而便于篩選。決定能不能 放目的基因以及如何放置目的基因。ONA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小 于l（）KbNANA第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子一核糖體接合位點體。選用那種載體，還是要以實驗?zāi)康臑闇世K。第六步：啟動子一核糖體接合位點一克隆位點一轉(zhuǎn)錄終止信號令狐采學(xué)創(chuàng)作NANANANA 分子上可以與RNApol轉(zhuǎn)錄。增強子/沉默子一為真核基因組(囊括真核病毒基因組) 中的一種具有增強鄰近基因轉(zhuǎn)錄進程的調(diào)控順序。其作用與增 強子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可 發(fā)揮作用。/沉默子一負增強子，負調(diào)控序列。

5、(3)核糖體接合 位點/起始密碼/S序列(Rbs/AGU/Ss):mRNAAUG S(4)轉(zhuǎn)錄終止序列(終止子)/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的 最后AATAAAown streamGTT2poly(A)AATAAA 的 保守序列own-streamGTT2部分共通構(gòu)poly (A)加尾信號。質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針，那其實是代表兩 NANA,它的啟動子等在其中一 條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.根據(jù)表達宿主不同， 構(gòu)建時所選擇的載體也會不同。二、目的基因的獲得 一般來說，目的基因的獲得有三種途徑： 調(diào)取基因：根據(jù)目的基因的序列， 設(shè)計引物從含有目的基因的令狐采學(xué)創(chuàng)作CNA PC

6、R 的方法調(diào)取目的基因，克隆進行測序，以獲得想要的基因片段，這種方法相關(guān)于成本 較低，但是調(diào)取到的基因往往含有突變，還有不同基因的表達 豐度不同，轉(zhuǎn)錄本比較復(fù)雜，或是基因片段很長，這些情況都 很難調(diào)取到目的基因。C全基因合成：根據(jù)目的基因的 NA 序列，直接設(shè)計合成目的 基因。此方法準確性高，相關(guān)于成本會高一些，個人操作比較困難，需要專業(yè)的合成公司完成。優(yōu)點是可以合成難調(diào)取及人工改造的任何基因序列，同時可以進行密碼子優(yōu)化，提高目的基因在宿主內(nèi)的表達量。三、克隆構(gòu)建目前，克隆構(gòu)建的方法多種多樣，除了應(yīng)用廣泛的酶切鏈接以外，現(xiàn)在還有很多不依賴酶切位點的克隆構(gòu)建方式。下面具體說一下雙酶切方法構(gòu)建載體

7、的步驟。實驗材料實驗試劑試劑名稱載體 pCNA3.1H5a限制性內(nèi)切酶T4 連接酶生產(chǎn)廠家Transheep Tiangen Fermentas Fermentas質(zhì)粒 NA 小，大疑抽提試劑盒 Axygen凝膠回收試劑盒Axygen瓊脂糖NA laerBiowestFermentas(2) X基因慢病毒載體的構(gòu)建XTranshecpPUC57中。PUC57-XEcoRl/BamHI酶切完成后進行膠回收2.pCNA3.1雙酶切，酶切體系如下。20ul373小時4ulpCNA3.1載體(5()()ng/ul) lulBamHI1 ulEcoRI2ul1()X12 ulH2()酶切完成后膠回收(見附錄)處理好的目的片段與載體連接反映體系：6ul PCR 50ng/ul) lul50ng/ul)2ul ligaselul T41igase l()ul H2()16C過夜。轉(zhuǎn)化(感受態(tài)細胞:H50,具體步驟見附錄轉(zhuǎn)化部分。令狐采學(xué)