黃化突變體文獻(xiàn)綜述分析

1、植物葉色突變體的研究進(jìn)展植物葉色的表現(xiàn)受葉綠體中各種色素的綜合影響，正常情況下，由于葉綠素在植物色素總量中占優(yōu)勢(shì)而表現(xiàn)為綠色.葉色突變體是植物中突變彳主往直接率較高且易于鑒定的突變性狀 或間接影響葉綠素的合成與降解 ，導(dǎo)致植株的葉片顏色較正常的綠色發(fā)生變化 .目前幾乎所有 的高 等植物中都發(fā)現(xiàn)了葉色突變體 .（陳艷麗）在本世紀(jì)三十年代就有關(guān)于葉綠素突變體的報(bào) 道，但 葉色變異通常伴隨著植株矮小 ，并影響植株的光合作用造成減產(chǎn) ，甚至在生長(zhǎng)過程中生 現(xiàn)死亡現(xiàn)象彳主往直接因此葉色突變體常被認(rèn)為是無意義的突變.直到1949年,Granick對(duì)失綠的小球藻 突變體的研究并通過此突變解釋了葉綠素合成過程

2、1,人們才認(rèn)識(shí)到葉色突變體對(duì)理論研究具有重要的作用。并且最近幾年，葉色突變體的研究越來越深入，也受到廣泛的關(guān)注，已 經(jīng)被用于基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐，也取得了一定的成果。2葉色突變體的來源除自然突變可產(chǎn)生葉色突變體外，利用人工誘變，插入突變和基因沉默等均可得到葉色突變，其中人工誘變和插入突變的突變頻率較高。自然突變就是在自然條件不經(jīng)過人工處理情況下發(fā)生的突變，比如自然輻射，環(huán)境污染等。但是自然突變的頻率極低，一般不超過1% （郭龍彪，2006）,因此可供直接利用的突變很少。 我國(guó)著名水稻良種矮腳南特就是在高桿品種南特號(hào)稻田里發(fā)現(xiàn)的自然突變，水稻的 葉色突變體chll和chl9 （ zhang et

3、al .2006 ）,棉花中的芽黃突變體（蔣博 2012）,芹菜型油 菜 黃化突變體都是自發(fā)突變體。人工誘變 人工誘變導(dǎo)致植物基因產(chǎn)生突變， 是選育新品種、創(chuàng)造新種質(zhì)的有效途徑。 根據(jù)產(chǎn)生誘 變 的來源， 人工誘變分為物理、 化學(xué)誘變及基因工程引起的突變， 物理和化學(xué)誘變是主要的 誘變 方法。誘發(fā)植物發(fā)生突變的因素有誘變劑，物理誘變是通過各種射線（紫外線、X射線、Y射 線、p射線、中子等）來處理植物莫個(gè)器官（如種子、子房、愈傷組織等），誘發(fā)植物發(fā)生 基因突變。種子是最常用的處理材料，其對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)，可以在極度干燥、低溫、高溫、真空等條件下進(jìn)行處理，并且操作方便，便于運(yùn)輸和儲(chǔ)藏。1934年

4、日本首次利用 X射 線處理水稻種子，成功得到水稻早熟突變體（陽惠琴，1995）我國(guó)于1987年開始航天搭載育種利用空間環(huán)境（微重力、高真空、微磁場(chǎng)等）進(jìn)行誘變，通過地面選育得到有益變異創(chuàng)造由新種質(zhì)、培育由新品種，已經(jīng)成功在水稻種選由紫色、紅色、茶色等葉色突變體（薩如 拉，2009）?；瘜W(xué)誘變是通過烷化劑、疊氮化鈉、 堿基類似物等對(duì)植物進(jìn)行誘變，其甲烷化劑是誘變效率 最高和最常用的化學(xué)誘變劑。常用的烷化劑又包括甲基黃酸乙酯（EMS ）、磺酸二乙酯、乙 烯亞鏤和亞硝基乙基月尿。EMS誘變得到的突變體大多數(shù)為點(diǎn)突變，誘變機(jī)理： EMS帶有1個(gè)或多個(gè)活性烷基， 該基團(tuán)能夠轉(zhuǎn)移到其他電子密度高的分子上去

5、，使堿基許多位置上增加 了烷基，可以改變氫鍵的能力，從而DNA在復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引起突變。EMS將鳥 喋吟的O6位置烷基化，在 DNA復(fù)制過程中由于烷基化的鳥喋吟與正常的胸腺喀陡配對(duì)，使得堿基發(fā)生替換（趙用亮，1996） o EMS誘發(fā)的另外一個(gè)鳥喋吟位點(diǎn)是N7位點(diǎn)，該位點(diǎn) 是最易起反應(yīng)的位點(diǎn)幾乎可以與所有烷化劑起烷化作用，鳥喋吟N7位點(diǎn)烷基化后，使核昔鍵發(fā)生水解導(dǎo)致斷裂，鳥喋吟從DNA鏈上脫落，造成 DNA鏈堿基缺缺失，在復(fù)制的時(shí)候游離的堿基可能發(fā)生錯(cuò)配，以致發(fā)生堿基顛換即G: C A: T, G: C C: G, G: CT:A ;另外烷基化的鳥喋吟易離子化，使穩(wěn)定的酮式變?yōu)椴环€(wěn)定

6、的烯醇式，不與胞喀陡配對(duì)而與胸腺喀陡配對(duì)，從而發(fā)生 G: C A: T轉(zhuǎn)換。除此之外，EMS還可能使兩個(gè)鳥喋吟 N7位點(diǎn)形成共價(jià)鍵，使得 DNA雙鏈交聯(lián)而造成變異甚至死亡。這些 DNA結(jié)構(gòu)上的變化都可 能促使不表達(dá)的基因或區(qū)段被激活，而表現(xiàn)由被掩蓋的性狀。另外胸腺喀陡O4位點(diǎn)也易發(fā)生烷基化，其次是鳥喋吟 N3,腺喋吟N2,腺喋吟N7和胞喀院N3位點(diǎn)，此四個(gè)位點(diǎn)發(fā)生 烷基化后引起堿基置換突變只占烷化作用突變的10% o葉色突變體的分類由于葉色突變體通常在苗期出現(xiàn)葉色變異，因此，其分類常常根據(jù)苗期的葉色表型 進(jìn)行。目前分類方法較多 , 如Gustaftsson把葉色突變體分為五種類型：白化、 黃化

7、、 淺綠、條紋、斑點(diǎn)。而Awan等將其分成八種類型：白化，黃化，淺綠，白翠，綠白，黃綠， 綠黃和條紋。二者的分類中，白化、黃化、淺綠類型相同，Awan將條紋 和斑點(diǎn)兩種類 型按表型的差異又分成了不同的類型16。walles將葉色突變體分 成3類:1、單色突變，指葉片僅表現(xiàn)出淺綠、黃、白三種顏色中的一種；2、雜色突 變，指葉片存在多種顏色，如白黃、白綠、斑等；3、階段性失綠，指在植株發(fā)育的某 個(gè)階段，葉色發(fā)生突變, 然后再恢復(fù)到正常顏色。然而，簡(jiǎn)單地以苗期表型為依據(jù)來進(jìn)行分類具有一定的局限性。 植物的表型性狀與基因型并非一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，一種表型性狀可能受多個(gè)基因同時(shí)突變的共同影響，即使是同一個(gè)基

8、因發(fā)生突變，損 傷的程度不同基因功能也會(huì)表現(xiàn)出不同的表型性狀。比如,au和yg 2是番笳的黃葉突變體，其表現(xiàn)型非常相似，而研究表明an突變體的黃葉性狀是由編碼血紅 素加 氧幅的基因發(fā)生突變引起的，yg 2突變體中編碼光敏色素生成團(tuán)合幅基因發(fā)生了突變17。另外，還有一些葉色突變性狀在苗期時(shí)無法識(shí)別，如常綠 （staygree n突變體是常見的苗期后才表達(dá)的葉色變異 18,此突變性狀也存在于擬南芥、菊花等很多物 種中，其最明顯的特征是生育末期葉片保持綠色甚至出現(xiàn)完全不黃化現(xiàn)象。植物表型的表達(dá)不僅受基因的控制，也受環(huán)境因素的影響。因此,在對(duì)葉色突變體進(jìn)行分類時(shí)，應(yīng) 根據(jù)不同的表型性狀選擇并結(jié)合多種分

9、類方法對(duì)其進(jìn)行科學(xué)的分類。葉色突變體的遺傳研究葉色突變體的來源廣泛，種類繁多，種類不同其遺傳規(guī)律差別也較大。葉色變異 性狀可能受細(xì)胞核遺傳，也可能受細(xì)胞質(zhì)遺傳；可能由單基因控制，也可能由多基 因控制； 可能是質(zhì)量性狀，也可能是數(shù)量性狀。為了確定葉色突變的遺傳方式，在構(gòu) 建F1群體時(shí)必須進(jìn)行正反雜交，并且需要進(jìn)行測(cè)交試驗(yàn)。如果是細(xì)胞質(zhì)遺傳，正反 雜交的子代葉色表型不同，總是和母本保持一致且不發(fā)生性狀分離；如果是細(xì)胞核遺傳，正反交 的子代葉色相同，在F2和BC1群體中發(fā)生葉色分離，并具有一定的性 狀分離比例, 根據(jù)分離比便可知葉色變異是受單基因控制還是多對(duì)基因控制。爐籃型油菜黃化突變體的基因定位3

10、.1細(xì)胞核遺傳對(duì)多種突變體的研究表明,葉色突變多是由單隱性核基因控制的 13、 19、20、 21。胡遠(yuǎn)輝等對(duì)方籃型油菜葉色突變體 Cr3529進(jìn)行了研究，認(rèn)為此突變性狀受細(xì) 胞 核內(nèi)1對(duì)隱性基因控制22。劉海衡等對(duì)芥菜型（召rassicajuneea五.）油菜黃化 突變 體五“s少進(jìn)行了研究，該黃化性狀受2對(duì)隱性核基因控制23。何瑞鋒等（2000）研 究“斑馬葉”葉色突變體，發(fā)現(xiàn)由于核基因改變其葉片間斷失綠 24。吳殿星等 對(duì)水 稻轉(zhuǎn)綠型白化突變系 W25進(jìn)行研究，表明W25不育系的的葉色表型由單隱 性核基因 控制。25 3.2細(xì)胞質(zhì)遺傳細(xì)胞質(zhì)遺傳的葉色突變體與細(xì)胞核遺傳的相比，數(shù)量比較少，

11、且后代性狀遺傳 以母性遺傳方式進(jìn)行。細(xì)胞質(zhì)控制的葉色突變體最早在大豆中出現(xiàn),劉友杰利用激光誘變處理早稻品種，獲得了褪綠突變體,遺傳分析表明該褪綠性狀是由細(xì)胞質(zhì)基因突變引起的26。此外，受細(xì)胞質(zhì)遺傳的葉色突變體僅在擬南芥27、小麥28（王保莉等）1996）、煙草15、29 （Mondeetal.,2000;Baraketal.,2001等植物中有報(bào)道。1.1.3.3外部環(huán)境對(duì)葉色突變體的影響外部環(huán)境如溫度、光照，水分等對(duì)葉色突變體都有影響，其中溫度的影響最大。陳佳穎等（2010）利用60c。Y射線輻照處理粳稻品種嘉花1號(hào)的種子,得到了 1個(gè)低 溫敏感葉色突變體InrZI,在較低溫度（V25OC

12、）條件下，該突變體幼苗葉色呈黃 色； 隨著溫度逐漸升高，葉色由黃色轉(zhuǎn)化為綠色，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的臨界溫度約為27, 5C。色突變體的分子機(jī)制葉綠素合成機(jī)制的穩(wěn)定受突變基因直接或問接的影響，任何妨礙葉綠素素代 謝穩(wěn)定性的因素都會(huì)引起葉色變異，其分子機(jī)制非常復(fù)雜。綠素生物合成途徑中的基因突變?nèi)~綠素合成分為厭氧條件和有氧條件下的反應(yīng)。的生物合成以谷氨酸與a 一酮戊二酸為原料，然后合成厭氧條件下，高等植物葉綠素 ALA o 2分子ALA成1 分子膽色素原，其具有毗咯環(huán)。4分子膽色素原經(jīng)脫氨基縮合形成脫水縮合形成1分子尿琳原11,尿葉琳原111的4個(gè)乙酸側(cè)鏈脫梭形成具有 4個(gè)甲基的糞葉琳 原m。 在有氧條件

13、下，糞葉琳原m再脫梭、脫氫、氧化形成原葉琳雙，原葉琳IX是形成葉綠素 和亞鐵血紅素的分水嶺。如果與鐵結(jié)合）就生成亞鐵血紅素；與鎂結(jié)合,則形成Mg-原葉琳仄。Mg 原葉琳IX的一個(gè)梭基被甲基酷化，在原葉琳IX上形成 第五個(gè)環(huán)，接著B環(huán)上的一 CH=CHZ側(cè)鏈還原為一 CHZ - CH3,即形成原葉綠酸酷。 原葉綠酸酷經(jīng)光還原變?yōu)槿~綠酸酷a,然后與葉醇結(jié)合形成葉綠素a,葉綠素b是由葉綠素a轉(zhuǎn)化而成的。葉綠素合成的過程涉及多個(gè)幅的參與。DVR基因最先被鑒別后，參與高等植物葉綠素合成的所有基因逐一被鑒定，擬南芥中從谷氨醐一 tRNA到葉綠素b的合成過程中，共有編碼15種葉綠素合成幅的27個(gè)基 因參與困

14、31agatactal.,2005 葉綠素合成過程中的任何一種幅的合成發(fā)生突變均可影響葉綠素的合成進(jìn)程，進(jìn)而改變?nèi)~綠體中各種色素的含量,引起植株葉色變 異。紅素代謝途徑中的基因突變?nèi)~綠素合成速率受細(xì)胞內(nèi)血紅素含量影響。當(dāng)血紅素的消耗大于合成時(shí)，血紅素減少就會(huì)促進(jìn) ALA的合成,ALA含量增加促使葉綠素的合成。當(dāng)血紅素的合成大于消耗時(shí)，其濃度升高從而抑制 ALA的形成,ALA含量減少便抑制葉綠素 的合成。血 紅素經(jīng)一系列的反應(yīng)最終形成光敏色素生色團(tuán)，若此途徑任何反應(yīng)受 阻,細(xì)胞內(nèi)血紅素含量上升，血紅素的積累反饋抑制葉綠素合成，突變體由于缺乏 葉綠素使得葉色產(chǎn)生變 異17。葉綠素合成過程中血紅素反

15、饋抑制是關(guān)鍵的調(diào)控步驟。最直接的證據(jù)是，在番笳 aurea和yenow green - 2突變體中 , 編碼血紅素 氧化幅（hemeoxygenase 和光敏色素生色團(tuán)合幅的 （PFBs” thase基因突變，使細(xì)胞 內(nèi)積累過量的血紅素, 其反饋抑制葉綠素前體氨基酮戊酸的合成，致使突變體表現(xiàn) 為葉色黃化17。碼其他葉綠體蛋白的基因突變?nèi)~綠體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)，約占口卜綠體干重的30 40%。它亦是葉綠體 功 能的基礎(chǔ)，幾乎參與葉綠體全部的生命活動(dòng)，如幅代謝過程中的催化劑、負(fù)責(zé)翻 譯的核 糖體等，它們的主要成分均為蛋白質(zhì)。電子傳遞鏈?zhǔn)怯傻鞍踪|(zhì)與細(xì)胞色素、質(zhì)體藍(lán)素等相結(jié)合而構(gòu)成的，對(duì)葉色起關(guān)鍵作用

16、的光合色素同樣需要與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合體而存在，同時(shí)葉綠體內(nèi)膜系統(tǒng)的主要成分也是蛋白質(zhì) 32,33（Kalmangara,1988;Yaronskaya,2003 。） 一些葉綠體蛋白的突變可導(dǎo)致葉綠體內(nèi)部膜結(jié)構(gòu)發(fā)育不完全，進(jìn)而葉綠素及其他光合色素的合成及穩(wěn)定性也受到影響,最終使葉綠體中各種色素的含量及比例發(fā)生改變34(June,1969)。葉綠體基因和細(xì)胞核基因共同編碼葉綠體中的蛋白質(zhì)，其中大約80個(gè)葉綠體蛋白質(zhì)由葉綠體基 因組編碼，而3000多個(gè)蛋白由核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)中合成后通過葉綠體外套上的異位子進(jìn)入葉綠體中35、36(sat。)1999;Gray,2003K此外谷氨醐一 tRNA還

17、原幅催化葉綠 素合成的第一步反應(yīng)，而葉綠體核糖體的突變直接影響谷氨醐一tRNA還原幅的合成，減少葉綠素的含量33(Yaronskaya,2003)b葉綠體膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變可能阻礙葉綠體 膜對(duì)蛋白及幅的識(shí)別、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn),從而使葉綠素合成速率降低37。色突變體表型與葉綠素含量的關(guān)系葉色突變體的葉綠素含量發(fā)生變化，影響植株的光合作用，從而影響植株的多種生理活動(dòng)。 葉色突變體在植物生理研究中的應(yīng)用已經(jīng)很廣泛，比如通過葉色 突變體研究葉綠素生物合成、葉綠體分化與發(fā)育、光合作用和光形態(tài)建成等基礎(chǔ) 研究，尤其是對(duì)植物光合作用和光形態(tài)建成的研究中，葉色突變體是理想的材料。葉片是植株進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，葉色突變

18、往往影響植物光合效率。郭春愛等利 用水稻低葉綠素b突變體研究了低葉綠素b對(duì)突變體光系統(tǒng)II熱穩(wěn)定性的影響15。結(jié)果表明，低 葉綠素b突變體對(duì)高溫更敏感，PS II捕光色素蛋白復(fù)合體(LHC II)中葉綠素b減少可能 降低了 PS II結(jié)構(gòu)與功能的熱穩(wěn)定性。光敏色素由生色團(tuán)和蛋白質(zhì)兩部分組成，是植物光形態(tài)建成的光受體。 光敏色素生色團(tuán)生物合成受 阻，其含量降低將反饋抑制葉綠 素合成，引起對(duì)光不敏感的葉色突變 16。生色團(tuán) 含量影響光敏色素活性，其含量降低，光敏色素的活性也隨之下降17,因此可利 用生色團(tuán)缺失的突變體研究光敏色素在 光形態(tài)建成中的作用。葉色突變體除可直 接或間接影響葉綠素合成外，亦

19、可影響激素的合成，改變突變體內(nèi)源激素含量。比如脫落酸(ABA),其生物合成途徑中的基因突變，可直接導(dǎo)致ABA含量的下 降，突變體的生長(zhǎng)發(fā)育便受到一定程度的影響，造成葉 色突變 阿；脫落酸生物合 成的起始反應(yīng)在葉綠體中進(jìn)行，因此葉綠體的發(fā)育狀況直接影響其合成是否能順 利進(jìn)行，葉綠體發(fā)育異?？捎绊懨撀渌岷铣芍嘘P(guān)鍵幅的活性，降低突變體的脫落酸含量19。色突變體的應(yīng)用價(jià)值目前很多農(nóng)作物如水稻、油菜、小白菜、辣椒等都有關(guān)于葉色變異作為標(biāo)記性狀鑒定雜交種字純度的報(bào)道。水稻中，余新橋等(2000)利用淡綠葉色標(biāo)記性狀的 突變體，培育出帶淡綠色葉色標(biāo)記的不育系：標(biāo)一 IA, 標(biāo)一 IA與中413、明恢63的

20、雜交后代均表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。曹立勇等(1999)將紫葉標(biāo)記轉(zhuǎn)育到釉型光溫 敏核不育系中，通過篩選培育出中紫So油菜中，趙云等 (2003)利用物理和化學(xué)誘變 復(fù)合處理，獲得了幼葉黃化突變性狀 Cr,將其突變性狀和 核不育性狀同時(shí)導(dǎo)入到 油菜PolCMS中，成功地選育出了帶Cr標(biāo)記的雙低雙重不育三 系。葉色變異可應(yīng)用于高光能育種的研究葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，光合作用的效率受葉綠素含量、 葉綠體形態(tài)、 結(jié)構(gòu)和數(shù)目變化的共同影響。葉色突變不僅會(huì)影響葉綠素的含量,而且對(duì)葉綠體的分化和發(fā)育也有影響，因此，葉色突變體是研究光合作用的理想材料。Gan等(1995)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在煙草中獲得了一個(gè)

21、常綠突變體，此突變體在生長(zhǎng)末期葉片持綠時(shí)間較長(zhǎng)，衰老過程明顯延遲，且能有效的吸收光能，延長(zhǎng)光合作用 的時(shí) 間，其生物量增加40%、種子產(chǎn)量增加52%,從而使實(shí)現(xiàn)高光效育種變得可能。光抑制是植物在強(qiáng)光下光合作用受到抑制的現(xiàn)象。當(dāng)同時(shí)出現(xiàn)其他環(huán)境脅迫因素 如低溫,高溫和干旱等時(shí)，光抑制會(huì)加劇。一些黃化突變體，雖葉綠素含量減少 /旦葉 黃素含量明顯較多，葉黃素在植物體內(nèi)以紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)三種狀態(tài)相互轉(zhuǎn)化,使光系統(tǒng)避免傷害。如在水稻“249黃”突變體中，雖葉綠素含量 減少，但光合結(jié)構(gòu)對(duì)強(qiáng)光的耐受性升高，突變體的最大光合速率反而顯著上升（龔紅兵等，2001）。葉色突變體可作為改良作物品質(zhì)性

22、狀的資源葉色突變體葉綠素含量的改變，對(duì)植物的生長(zhǎng)一般具有負(fù)面的影響。但少數(shù) 的葉 色突變體使得植物具有特殊優(yōu)良品質(zhì)。安吉白茶的返白現(xiàn)象與溫度有較大的關(guān)系。返白和復(fù)綠的過程中，葉綠素和類胡蘿卜素含量均是由低到高變化，但氨基 酸總量的變化卻是隨白化程度的加深而升高，氨基酸總量高峰值可達(dá) 5%,有很高 的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在煙 草中，葉片缺少葉綠素也有特殊的利用價(jià)值。煙草葉綠素缺乏變異型分為白肋型、灰黃型、黃綠型等，其中白肋突變體來源于馬里蘭深色曬煙,葉綠素含量還有一些葉色突變體的顏色比較特殊，可培育成觀賞植物。Oud等（1995）利用轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行多年相互雜交實(shí)驗(yàn)，培育出了橙色的矮牽牛新品種 7.4葉色突

23、變體在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用 功能基因組學(xué)是指利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究得到的大量數(shù)據(jù)與信息評(píng)價(jià)基因的生化、細(xì)胞、發(fā)育和適應(yīng)等功能，其主要方法結(jié)合了高通量、大規(guī)模統(tǒng)計(jì)和計(jì)算機(jī)分析技術(shù)。目前已有多種分析驗(yàn)證基因 功能的方法，其中突變體是最為有效的分析方法。吳自明等（2007）對(duì)水稻葉綠素合 成缺陷突變體進(jìn)行研究，并利用圖位克隆方法克隆了該基因（YGLI） o對(duì)其基因功 能研究表明，該基因編碼葉綠素合成幅，其催化葉綠素a生物合成過程中的最后一 步反應(yīng)。Jung 等（2003）利用T-DNA插入的方法獲得水稻黃綠色突變體，經(jīng)研究發(fā) 現(xiàn),T-DNA的插入改變了基因OsCHLH的結(jié)構(gòu)）該基因最大的一個(gè)亞基一

24、 CHLH亞基C末端缺失，從 而導(dǎo)致鎂鰲合幅的活性降低，使該突變體葉綠素合成受阻，表 現(xiàn)出黃綠色的表型。劉文 真（2006）等利用T-DNA插入法獲得了對(duì)低溫敏感的水 稻葉色突變體，對(duì)該突變體的 研究將更好的了解溫敏葉色突變的分子機(jī)制。 7.5葉色突變體在植物生理研究中的應(yīng)用葉色突變體的葉綠素含量發(fā)生變化，影響植株的光合作用，從而影響植株的多 種生 理活動(dòng)。葉色突變體在植物生理研究中的應(yīng)用已經(jīng)很廣泛,比如通過葉色突變體研究葉綠素生物合成、葉綠體分化與發(fā)育、光合作用和光形態(tài)建成等基礎(chǔ)研究,尤其是對(duì)植物光合作用和光形態(tài)建成的研究中,葉色突變體是理想的材料。葉 片是植株進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，葉色突變往

25、往影響植物光合效率。郭春愛等（2007）利用水稻低葉綠素b突變體研究了低葉綠素 b對(duì)突變體光系統(tǒng)11熱穩(wěn)定性的影 響。結(jié)果表明， 低葉綠素b突變體對(duì)高溫更敏感，PSII捕光色素蛋白復(fù)合體（LHCn）中葉綠素b減少可 能降低了 PsH結(jié)構(gòu)與功能的熱穩(wěn)定性。光敏色素由生色團(tuán)和蛋白質(zhì)兩部分組成，是植物光形態(tài)建成的光受體。光敏色素生色團(tuán)生物合成受阻,其含量降低將反饋抑制葉綠素合成，引起對(duì)光不敏感的葉色突變（Terryetal.,華中農(nóng)業(yè)大 學(xué)2011屆碩士研究生學(xué)位論文1999）。生色團(tuán)含量影響光敏色素活性，其 含量降低， 光敏色素的活性也隨之下降，（welleretal.,1997）,因此可利用生色

26、團(tuán)缺失 的突變體研 究光敏色素在光形態(tài)建成中的作用。葉色突變體除可直接或間接影響葉綠素合成外,亦可影響激素的合成，改變突 變體內(nèi)源激素含量。比如脫落酸（ABA）,其生物合成途徑中的基因突變，可直接導(dǎo) 致ABA含 量的下降，突變體的生長(zhǎng)發(fā)育便受到一定程度的影響，造成葉色突變（Agrawaletal.,2001）;脫落酸生物合成的起始反應(yīng)在葉綠體中進(jìn)行）因此葉綠體的發(fā)育 狀況直接影響其合成是否能順利進(jìn)行，葉綠體發(fā)育異常可影響脫落酸合成中關(guān)鍵酶的活性，降低突變體的脫落酸含量(Fambrinietal.,2004)葉色性狀基因定位方法質(zhì)量性狀基因定位方法質(zhì)量性狀指能觀察而不能測(cè)量的性狀,即屬性性狀，它

27、表現(xiàn)出質(zhì)的中斷性變 化。因此在相對(duì)性狀間呈現(xiàn)非連續(xù)變異,其遺傳上由一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)效應(yīng)大的基因(或稱 TOC o 1-5 h z 主基因)決定,受環(huán)境影響較小,因而能對(duì)群體內(nèi)的個(gè)體進(jìn)行明確的分類。對(duì)多種突變體的研究表明，葉色突變多是由單基因控制的。胡遠(yuǎn)輝 (2004)等 對(duì)方藍(lán)型油菜葉色突變體 Cr3529進(jìn)行了研究，認(rèn)為此突變性狀受細(xì)胞核內(nèi)1對(duì)隱性基因控制20，劉海衡等對(duì)芥菜型油菜黃化突變體L638-y進(jìn)行了研究，該黃化性狀受2對(duì)隱性核基因控制：21何瑞鋒等研究“斑馬葉葉色突變體，發(fā)現(xiàn)由 于 核基因改變其葉片間斷失綠0。吳殿星等對(duì)水稻轉(zhuǎn)綠型白化突變系 W25進(jìn)行 研究， 表明W25不育系的的葉

28、色表型由單隱性核基因控制：23數(shù)量性狀基因定位方法常用的數(shù)量性狀基因定位方法有單標(biāo)記分析法、區(qū)間作圖法、復(fù)合區(qū)間作圖法、多重區(qū)間作圖法等。單標(biāo)己法(single marker analysis )包括標(biāo)t己分析方法 (marker-based analysis) 和性狀分析方法(trait-based analysis兩種，前者利用每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)不同基因型和性狀存在的差異，通過傳統(tǒng)的單因素方差分析法，檢測(cè)數(shù)量性狀在標(biāo)記基因型間的差異是否顯著，并進(jìn)行F測(cè)驗(yàn)，若結(jié)果顯著，則說明該標(biāo)記位點(diǎn)可能與一個(gè)或多個(gè)QTL(quantitative trait locus)連鎖。這種方法簡(jiǎn)單且符合 QTL定位的基

29、本統(tǒng)計(jì)原理，同時(shí)不需要完整的分子標(biāo)記連鎖圖。性狀分析方法的原理是假設(shè)由于選擇的結(jié)果使數(shù)量 性狀的高、低表型間等位基因增減頻率改變，當(dāng) QTL等位基因與某一標(biāo)記基因連鎖時(shí)，由于其相互關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致高、低表型個(gè)體間標(biāo)記基因頻率的差異。(2)區(qū)間作圖法(Interval mapping, IM)是由 Lander 和 Botstein、ensen 和 Knapp 等提出的，其原理是利用飽和連鎖圖譜，通過極大似然函數(shù)和線性回歸模型對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行全基因組掃描，判斷是否存在任意相鄰標(biāo)記位點(diǎn)和位點(diǎn)間任一位置上具有對(duì)該性狀有效應(yīng)的位點(diǎn)164-66各個(gè)位點(diǎn)對(duì)性狀的效應(yīng)大小通過似然值 (LOD值)來衡量， 根據(jù)似然值

30、繪制的曲線圖可以確定QTL在染色體上可能的位置。(3)復(fù)合區(qū)間作圖法(Composite interval mapping, CIM) 由Zeng提出等，是在 區(qū) 間作圖的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，該方法的原理是：檢測(cè)某一特定標(biāo)記區(qū)間時(shí)，將 與其它 QTL連鎖的標(biāo)記也包括在模型中以控制背景遺傳效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)利用多個(gè)遺傳標(biāo)記信息對(duì)基因組的多個(gè)區(qū)間進(jìn)行多個(gè) QTL的同步檢測(cè)，是目前應(yīng)用 最為廣泛的方法之一 67二復(fù)合區(qū)間作圖法的主要優(yōu)點(diǎn)是：保留了區(qū)間作圖法的優(yōu)點(diǎn)，利用QTL似然圖來顯示QTL的可能位置及顯著程度；一次只檢驗(yàn)一個(gè)區(qū)間；若不存在上位性和環(huán)境互 作的影響，其位置和效應(yīng)的估計(jì)是接近無偏的；利 用

31、了整個(gè)基因組的標(biāo)記信息；以所選擇的多個(gè)標(biāo)記為條件，控制了背景遺傳效應(yīng)，提高了作圖的精度和效率。復(fù)合區(qū)間作圖法存在的主要問題有：若存在上位性及QTL與環(huán)境互作等復(fù)雜的遺傳學(xué)問題 則結(jié)果會(huì)出現(xiàn)偏離；需要從大量的標(biāo)記中篩選出部分有用的標(biāo)記，而篩選時(shí)采用的顯著性水平以及篩選的方法均會(huì)影響定位結(jié)果；由于擬合在模型中的標(biāo)記會(huì)吸收其附近 的QTL效應(yīng)，復(fù)合區(qū)間作圖法 需要為檢驗(yàn)的區(qū)間開辟一個(gè)窗口，窗口內(nèi)的標(biāo)記不能包括在模型中，但適合的窗口大小不易確定68二(4)混合線性模型方法由朱軍提出，該方法把群體均值、QTL的各項(xiàng)遺傳主 效應(yīng)作為固定效應(yīng)，而把環(huán)境效應(yīng)、QTL與環(huán)境互作效應(yīng)、分子標(biāo)記效應(yīng)及其 與環(huán)境的互

32、作效應(yīng)以及殘差作為隨機(jī)效應(yīng)，將效應(yīng)估計(jì)和定位分析結(jié)合起來，進(jìn)行多環(huán)境下的聯(lián)合QTL定位分析，提高了作圖的精度和效率69。 Ya ng和Zhu開 發(fā)了可以分析 包括加性和加x加上位性的各項(xiàng)遺傳主效應(yīng)及其與環(huán)境互作效應(yīng)的計(jì)算機(jī)軟件，這種模型可以無偏地分析 QTL與環(huán)境的互作效應(yīng)，并可以擴(kuò)展到 分析具有加X力口、加X顯、 顯X顯上位性的各項(xiàng)遺傳主效應(yīng)及其與環(huán)境互作效應(yīng)的 QTL ：70： o分子標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記技術(shù)基因定位主要是通過分子標(biāo)記來定位性狀位點(diǎn)，通過尋找與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記，再計(jì)算分子標(biāo)記與位點(diǎn)間的重組率，最終將基因定位在染色體的具 體位置，分子標(biāo)記技術(shù)有很多種，包括傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)

33、和新興的分子標(biāo)記技術(shù)。傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)遺傳標(biāo)記，從形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記，逐步發(fā)展到分子標(biāo)記，其中 傳統(tǒng) 的分子標(biāo)記技術(shù)包括：RFLP標(biāo)記技術(shù)、RAPD標(biāo)記技術(shù)、AFLP標(biāo)記技術(shù) 和SSR標(biāo) 記技術(shù)，其中又以SSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。簡(jiǎn)單重 復(fù)序列(Simple Sequenee Repeat , SSR)標(biāo)記又稱微衛(wèi)星(Mi crosate l l ite )標(biāo)記，是第二代分子標(biāo)記，一般以 16個(gè)核昔酸為單位，經(jīng)過 多次串聯(lián)重復(fù)而形 成的DNA序列。當(dāng)重復(fù)單位發(fā)生不同次數(shù)的重復(fù)或不完全重復(fù)時(shí)，會(huì)影響擴(kuò)增片段大小，導(dǎo)致該位點(diǎn)具有多態(tài)性。以基因組中某一特定微衛(wèi)星兩側(cè)的保守序列為依據(jù)，

34、設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分離，擴(kuò)增產(chǎn)物 長(zhǎng)度上的變化即可揭示SSR位點(diǎn) 的多態(tài)性7、相關(guān)研究表明SSR廣泛分布于植 物整個(gè)基因組，包括其編碼區(qū)和非編 碼區(qū)，平均23.3Kb就有一個(gè)SSR 方，SSR序列在不同植物基因組中的分布具有很 大差別 力，SSR序列在以水稻為代表的 單子葉植物基因組中多出現(xiàn)高 G+C含量 的重復(fù)類型，原因是其基因組中富含堿 基G和C,而在雙子葉植物油菜中則多于出現(xiàn)高A+T的SSR序列74。SSR序列在遺傳過程中極不穩(wěn)定，因此多態(tài)性豐富，其高度多態(tài)性主要表現(xiàn)在基本串聯(lián)單位數(shù)目變化極大。SSR核心序列的堿基組成和重復(fù)次數(shù)在不同的物種或同一物種的不同基因型間是隨機(jī)的，

35、導(dǎo)致了 SSR長(zhǎng)度的高度差異性1751。正是由于這些差異性導(dǎo)致了 SSR標(biāo)記的產(chǎn)生。相對(duì)于基因組非重復(fù)區(qū)域，SSR序列的 突變速率極高，在不同物種、不同位點(diǎn)間其突變速率差別很大176-78;造成SSR序列不 穩(wěn)定的因素很多，主要包括 SSR位點(diǎn)總長(zhǎng)度以及組成SSR序列的各重復(fù)單 元長(zhǎng)度兩 個(gè)因素79-80。研究表明影響SSR序列突變率的最主要因素是 SSR位點(diǎn)長(zhǎng)度，隨重復(fù) 單元數(shù)目的增加SSF序列突變速率加快81二SSR標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)在于：SSR標(biāo)記長(zhǎng)度差異 大，多態(tài)性豐富82： ; SSR標(biāo)記呈共顯性，可用于鑒別純合子與雜合子831；引物是根據(jù)特定的保守序列設(shè)計(jì)的，重復(fù)性好且很穩(wěn)定。SSR標(biāo)記也有

36、其缺點(diǎn)：SSR引物需根據(jù)SSR位點(diǎn)兩端的序列設(shè)計(jì)，當(dāng)某一物種的 DNA序列未知時(shí) 則 不能獲得。SNP分子標(biāo)記技術(shù)單核昔酸多態(tài)性 (Single Nueleotide Polymorphism, SNP) 是美國(guó)學(xué)者 Lander 在 1996年提出的第三代遺傳標(biāo)記，指的是由于單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或 缺失造成 的DNA序列的多態(tài)性84SNP標(biāo)記廣泛分布于動(dòng)植物基因組中，且數(shù)量巨大185,但在不同物種以及基因組的不同區(qū)域出現(xiàn)的頻率不同。在人類基因組中大約在人類基因組中大約1000bp出現(xiàn)1個(gè)SNP ：86：,在擬南芥中的頻率是1/500bp ：87：,在水稻中，Nasu等和Subbaiya

37、n等發(fā)現(xiàn)SNP出現(xiàn)的頻率分別是1/232bp 和1/147bp :88-89,在大豆基因組中為1/438bp :90在甘藍(lán)型油菜中，每600個(gè)堿基對(duì) 有1個(gè)SNP, 1Gb左右的油菜基因組中大約有170萬個(gè)SNP,大多數(shù)SNP在非編碼區(qū) ：SNP標(biāo)記分析方法有多種類型，其中具有代表性的包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性、 酶切 擴(kuò)增多態(tài)性、高分辨熔解曲線分析等低通量的傳統(tǒng)檢測(cè)方法以及中高通量的SNP芯片檢測(cè)方法92： o單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single-strand conformation polymorphism, SSCP)是最早應(yīng) 用于等位基因分型，其原理是單個(gè)堿基出現(xiàn)差異造成單鏈DNA構(gòu)象發(fā)生改變，從

38、而導(dǎo)致單鏈DNA在凝膠中的電泳遷移率不同。利用SSCP4行SNP分型主要限制在于DNA 片段的長(zhǎng)度，片段越長(zhǎng)，單堿基差異引起的電泳遷移率差別越小。SSCP基因分型方法耗時(shí)較長(zhǎng)，操作繁瑣，對(duì)聚丙烯酰胺凝膠要求較高。在甘藍(lán) 型油菜中，李媛媛利用 該技術(shù)，以SI-1300和Eagle為材料，對(duì)10對(duì)功能基因的序 列之間的差異進(jìn)行多態(tài)性 分析，發(fā)現(xiàn)在不同材料之間甘藍(lán)型油菜功能基因序列高度保守，其遺傳變異類型主要來源于S N P ：93： o幅切擴(kuò)增多態(tài)性序列法 (cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS) 的主要 原理是，基因組中存在一些可能導(dǎo)致幅切位點(diǎn)

39、發(fā)生改變的SNP,通過設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)目標(biāo)SNP在基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行幅切， 再 通過電泳以檢測(cè)。CAPS操作簡(jiǎn)單、適用成本低，但其不適合大量SNP檢測(cè)。高分辨熔解曲線法(high resolution melting, HRM) 的基本原理是通過雙鏈 DNA 熔解曲線的變化來反映核甘酸性質(zhì)的差異：94。HRM具有分辨率高、快速、 安全、操 作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但是，由于 HRM分辨能力極高，其對(duì)溫度及 PCR體系的要求也極為 嚴(yán)苛，而且對(duì)于單堿基 SNP而言，只能較好地檢測(cè)出 G/C與A/T之 間的變化；如果 PCR擴(kuò)增區(qū)域里SNP位點(diǎn)過多，也會(huì)干擾HRM分型結(jié)果。SNP

40、芯片以其集高通量、高集成、微型化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)成為檢測(cè)SNP的新 的優(yōu)良手段，其原理是將固定在載體上的密集的寡核甘酸探針陣列與所要檢測(cè)的目標(biāo)DNA進(jìn)行等位基因特異性反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)后信號(hào)的有無和強(qiáng)度大小確定SNP位點(diǎn)。大規(guī)模、高通量SNP芯片檢測(cè)最先應(yīng)用于人類群體遺傳學(xué)研究中，并在人類 關(guān)聯(lián) 性分析上取得很大進(jìn)展95 o SNP芯片也被應(yīng)用于一些家畜全基因組關(guān)聯(lián)分 析、QTL 定位及候選基因篩選96，SNP芯片技術(shù)在油菜中的應(yīng)用目前廣泛采用的SNP芯片主要有兩類，分別由美國(guó) Affymetrix和Illumina公 司 開發(fā)，而在油菜中所采用的SNP芯片主要是Illumina公司的微珠芯片。Il

41、lumina芯片有 Golde nGate和Infinium兩大系列產(chǎn)品。Golde nGate K片近年來已應(yīng)用于蕓 U屬作物 遺傳作圖和多樣性等研究，例如在白菜中，用含 384個(gè)SNP的GoldenGate芯片對(duì)來 自栽培種“ chiifu ”和“kenshin”的DH群體以及野生種、栽培種進(jìn)行鑒 定，其中338 個(gè)SNP能夠被可靠區(qū)分，這些SNP標(biāo)記已被錨定到最新發(fā)表的白菜基因組序列99在爐籃型油菜中，Durstewitz等用GoldenGatei術(shù)篩選360個(gè)品系， 大約84%勺SNP 能夠清楚地區(qū)分出基因型，46%勺標(biāo)記在90個(gè)冬油菜品系間有多 態(tài)性97，Hua ng等 利用Gold

42、e nGate平臺(tái)驗(yàn)證其開發(fā)的油菜 SNP標(biāo)記，在開發(fā)的SNP標(biāo)記中隨機(jī)挑選 96個(gè)，用2個(gè)作圖群體的130個(gè)家系進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)只有2個(gè)SNP標(biāo)記沒有多態(tài)性98。Infinium芯片與GoldenGate芯片的主要區(qū)別是相對(duì)于 GoldenGate芯片的PCR和 延伸、連接步驟，Infinium芯片在化學(xué)反應(yīng)上采用全基因組擴(kuò)增、等位特異性雜交和延伸的方法，同時(shí)增加了 SNP位點(diǎn)的數(shù)量199:2012年由Illumina公司聯(lián)合澳 大 利亞、歐洲I、中國(guó)、南美洲和北美洲共16家單位開發(fā)的油菜公用SNP芯片已經(jīng) 投入使用，該芯片(60K SNP芯片)包含52157個(gè)SNP位點(diǎn)，每張芯片可分析24個(gè)樣品10。 該芯片對(duì)于油菜全基因組關(guān)聯(lián)分析及種質(zhì)篩選有著深遠(yuǎn)影響，同時(shí) 也有助于基因組中 單基因和主基因的鑒定1101目前該芯片已被廣泛