肉制品中磷酸鹽的測(cè)定 核磁共振波譜法-編制說(shuō)明

1、附件3CCAA團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)草案編制說(shuō)明基本信息標(biāo)準(zhǔn)草案名稱(chēng)中文肉制品中磷酸鹽的測(cè)定核磁共振波譜法英文Determination of phosphates in meat products by nuclear magnetic resonance spectroscopy項(xiàng)目類(lèi)型制定修訂（被修訂標(biāo)準(zhǔn)名稱(chēng)及編號(hào)：）計(jì)劃編號(hào)2021TB019起止時(shí)間2021年12月-2022年12月標(biāo)準(zhǔn)起草單位湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、北京工商大學(xué)、北京市食品檢驗(yàn)研究院（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心）起草組成員江豐、韓智、王會(huì)霞、范志勇、張莉、朱松松、張亞珍、龔蕾、張啟恒、夏金濤、陳剛、李瑋、張菊、黃宗

2、騫項(xiàng)目調(diào)整情況無(wú)背景、目的和意義背景磷酸鹽是目前世界各國(guó)應(yīng)用最廣泛的食品添加劑，廣泛應(yīng)用于肉制品中，有助于提高肉制品的保水性及嫩度。肉制品中廣泛使用的有三聚磷酸鹽、三偏磷酸鹽、焦磷酸鹽，三者通常按不同比例混合使用。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760-2014)規(guī)定，在預(yù)制肉制品、熟肉制品中磷酸鹽(單獨(dú)或混合使用，以PO43-計(jì))最大使用量為5.0g/kg。目前有關(guān)磷酸鹽的國(guó)家及行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有薄層層析法、分光光度法及離子色譜法。然而，使用分光光度法需通過(guò)消解將磷酸鹽全部轉(zhuǎn)換成正磷酸鹽再進(jìn)行測(cè)定，無(wú)法測(cè)定單個(gè)離子；離子色譜法易受基質(zhì)干擾影響，且需要經(jīng)過(guò)多步驟提取及凈化，耗費(fèi)較多時(shí)間

3、和試劑；文獻(xiàn)方法中，毛細(xì)管電泳方法易受到緩沖液濃度、pH、分離電壓、溫度等各方面因素影響，遷移時(shí)間重現(xiàn)性較差；快檢試劑盒法雖不需要大型儀器，但準(zhǔn)確度低?；诖?，建立一種前處理步驟簡(jiǎn)單、專(zhuān)屬性強(qiáng)，測(cè)定快速準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法具有現(xiàn)實(shí)意義。目的使用定量核磁共振波譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)肉制品中磷酸鹽的快速定量測(cè)定。意義該標(biāo)準(zhǔn)可為肉制品中磷酸鹽的檢測(cè)提供一種新穎的快速的檢測(cè)方法，具有廣泛的適用性。該標(biāo)準(zhǔn)所列方法不需復(fù)雜的提取及凈化等前處理過(guò)程，可在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品情況下，快速定量測(cè)定肉制品中焦磷酸鹽、磷酸鹽、三偏磷酸鹽、三聚磷酸鹽的含量。標(biāo)準(zhǔn)主要起草人任務(wù)分工湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院負(fù)責(zé)牽頭組織，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)

4、業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心（北京市食品檢驗(yàn)所）、中國(guó)認(rèn)證認(rèn)可協(xié)會(huì)等機(jī)構(gòu)分工負(fù)責(zé)并共同參與起草。主要工作過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)起草組織工作由湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院牽頭負(fù)責(zé)，主要工作為收集整理國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)資料；制定研究方案、負(fù)責(zé)分析方法優(yōu)化建立與驗(yàn)證、樣品檢驗(yàn)分析；組織標(biāo)準(zhǔn)起草及實(shí)驗(yàn)室方法可行性驗(yàn)證，撰寫(xiě)標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明。簡(jiǎn)要工作進(jìn)程如下：項(xiàng)目調(diào)研2021年11月1日，查閱大量國(guó)內(nèi)外核磁共振定量檢測(cè)技術(shù)方法和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各方法的原理及特點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比分析，確定研究方案，同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)研究工作。項(xiàng)目立項(xiàng)2021年11月15日，項(xiàng)目立項(xiàng)。起草階段2021年11月，各實(shí)

5、驗(yàn)小組開(kāi)展各部分實(shí)驗(yàn)工作，定期開(kāi)展工作總結(jié)；2021年12月，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)建立方法學(xué)實(shí)驗(yàn)部分匯總，形成標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容初稿；2022年1月-7月，各小組對(duì)初稿進(jìn)行評(píng)審，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)補(bǔ)充，對(duì)文本就行修改完善，形成標(biāo)準(zhǔn)草案。征求意見(jiàn)階段2022年9月，標(biāo)準(zhǔn)公開(kāi)征求意見(jiàn)。標(biāo)準(zhǔn)完善階段2022年10月-2022年12月。標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)為首次制定，以科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為依據(jù)，經(jīng)過(guò)科學(xué)研究而制定。本標(biāo)準(zhǔn)旨在利用定量核磁共振波譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)肉制品中磷酸鹽的快速定量檢測(cè)。本標(biāo)準(zhǔn)不僅是GB 5009.256-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多種磷酸鹽的測(cè)定的有效補(bǔ)充，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，不

6、需要復(fù)雜的提取及凈化等前處理過(guò)程，能快速測(cè)定肉制品中焦磷酸鹽、磷酸鹽、三偏磷酸鹽、三聚磷酸鹽的含量，提供一種新穎的快速的檢測(cè)方法，具有廣泛的適用性。同時(shí)，本方法在編制過(guò)程中引入第三方實(shí)驗(yàn)室對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)所列方法進(jìn)行驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，具有先進(jìn)性、科學(xué)性、合理性和可操作性。確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的論據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)擬采用使用31P-NMR定量檢測(cè)肉制品中磷酸鹽含量，分別對(duì)提取試劑、凈化方式等前處理?xiàng)l件和內(nèi)標(biāo)物的選擇、延遲時(shí)間（D1）等儀器條件進(jìn)行優(yōu)化，再通過(guò)對(duì)所建方法進(jìn)行方法學(xué)考察，計(jì)算方法的檢出限、回收率和精密度，建立定量核磁共振波譜法測(cè)定肉制品中磷酸鹽的方法，以擴(kuò)充當(dāng)前肉制品中磷酸鹽的檢測(cè)需求。一、前處理方法及儀器條件

7、的確立1、提取溶劑的確定本實(shí)驗(yàn)以1.0 mg/mL的焦磷酸鈉為例，比較了其在pH=4.5醋酸緩沖鹽、pH=7.0的超純水、pH=9.0的硼酸緩沖鹽下的化學(xué)位移(, ppm)，分別為=-9.40 ppm、=-7.4 ppm、=-6.50 ppm，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pH值越大，其化學(xué)位移越大。在實(shí)際樣品中，相同磷酸鹽的化學(xué)位移會(huì)因?yàn)閜H值不同而導(dǎo)致化學(xué)位移變化，從而造成峰歸屬分類(lèi)錯(cuò)誤，因此不適合使用水去提取磷酸鹽，而需采用緩沖鹽提取。由于磷酸鹽在酸性條件下容易發(fā)生水解，因此本實(shí)驗(yàn)最后選擇pH=9.0的硼酸緩沖鹽保持樣品提取溶液pH值穩(wěn)定，進(jìn)行磷酸鹽提取。本實(shí)驗(yàn)還以焦磷酸鈉和焦磷酸鉀為例，比較了鈉鹽和鉀鹽

8、的化學(xué)位移，在相同pH值下，其化學(xué)位移相同。2、凈化方式的選擇肉制品中含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)等，使用離子色譜法測(cè)定磷酸鹽中需要采取凈化的策略沉淀去除干擾物質(zhì)，一般方法采用固相萃取凈化小柱或有機(jī)試劑CHCl3凈化提取液。本實(shí)驗(yàn)以火腿腸為基質(zhì)，比較了C18固相萃取、Ag/H固相萃取小柱、CHCl3有機(jī)試劑沉淀3種凈化方式及直接離心過(guò)膜上機(jī)共4種方法對(duì)磷酸鹽測(cè)定含量的影響，結(jié)果表明使用核磁共振波譜儀，4種方法測(cè)得的結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明31P-NMR在測(cè)定磷酸鹽時(shí)，抗干擾能力強(qiáng)，無(wú)需復(fù)雜前處理即可進(jìn)行測(cè)定。3、內(nèi)標(biāo)物的選擇用于定量核磁的理想內(nèi)標(biāo)應(yīng)滿(mǎn)足以下條件：內(nèi)標(biāo)的定量峰與待測(cè)樣品的定量峰分離良好，

9、易溶于測(cè)試溶劑，不與待測(cè)樣品相互作用。在定量磷譜中，常見(jiàn)的內(nèi)標(biāo)物有磷酸氫二鉀、六甲基磷酰三胺（HMPA）、亞甲基二磷酸、磷酸三苯酯、三苯基膦等。實(shí)驗(yàn)表明不同磷酸鹽的化學(xué)位移分布在5.0 ppm-25.0 ppm。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，選取HMPA為內(nèi)標(biāo)，其化學(xué)位移為29.91 ppm（使用H3PO3為基點(diǎn)進(jìn)行校準(zhǔn)），與各目標(biāo)化合物分離度好。4、延遲時(shí)間（D1）及定量方式的確定一般定量核磁推薦D15T1，本實(shí)驗(yàn)采用Bruker標(biāo)準(zhǔn)序列t1irpg，使用標(biāo)準(zhǔn)程序測(cè)試了各磷酸鹽的T1（各磷酸鹽的T1見(jiàn)表1），T1為1.59-10.63 s。依據(jù)D15T1，D1應(yīng)最少應(yīng)該設(shè)為54 s，但是過(guò)大的D1會(huì)導(dǎo)

10、致單次掃描時(shí)間增加，分析目標(biāo)物的所耗費(fèi)時(shí)間顯著加長(zhǎng)。有學(xué)者在測(cè)定蔬菜中羥乙磷酸時(shí)，認(rèn)為D1不必大于5T1，最終經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，將D1設(shè)為0.05 s進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)方法將D1設(shè)為0.1s，NS設(shè)為512，掃描時(shí)間為17 min 34s，配制4種磷酸鹽（以陰離子根計(jì)）的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為40、100、300、500、800、1000、1500、2000 g/mL。分別以3種方法驗(yàn)證方法的可行性。表1 各化合物的弛豫時(shí)間（T1）化合物名稱(chēng)化學(xué)位移（ppm）T1（s）PO43-2.5910.63P3O93-21.512.43P2O74-6.513.72P3O105-5.66-5.582.35-2

11、0.43-20.271.59HMPA29.918.59方法：以4種磷酸鹽定量峰信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)y，以濃度為橫坐標(biāo)x，進(jìn)行線(xiàn)性回歸繪制曲線(xiàn)。方法：以4種磷酸鹽與內(nèi)標(biāo)物定量峰的信號(hào)強(qiáng)度比為縱坐標(biāo)y，以4種磷酸鹽與內(nèi)標(biāo)物濃度比為橫坐標(biāo)x軸，進(jìn)行線(xiàn)性回歸繪制曲線(xiàn)。方法使用內(nèi)標(biāo)絕對(duì)測(cè)定法，利用HMPA的峰面積和質(zhì)量計(jì)算出其它4種磷酸鹽的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用和時(shí)，y與x均成線(xiàn)性，且相關(guān)系數(shù)R20.999，但使用方法的HMPA峰面積計(jì)算PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-的含量時(shí)，計(jì)算含量分別為實(shí)際含量的104.1%、155.2%、215.36%、182.1%，與實(shí)際含量偏差大。分析原因

12、可能是因?yàn)楦骰衔锏腡1不同，過(guò)短的D1導(dǎo)致T1值大的化合物中的P原子未回到初始狀態(tài)，能量釋放不充分，導(dǎo)致不同化學(xué)位移的原子信號(hào)響應(yīng)不同。實(shí)驗(yàn)測(cè)試了相同掃描次數(shù)下，D1分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、12、14、16、18、20、25、30、50、60 s時(shí)各化合物的響應(yīng)強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)D1在0.112s時(shí)，信號(hào)逐漸增強(qiáng)，但在12 s后信號(hào)無(wú)顯著性差異（P0.05），因此最終選擇D1為12 s，最后采集參數(shù)為，采樣點(diǎn)數(shù)TD：65 536，掃描次數(shù)NS=64，延遲時(shí)間D1=12 s，采集時(shí)間AQ=1.9268 s，譜寬SW=70 ppm，O1P=5 ppm，O2P=4.7

13、 ppm，P1=12 s，增益RG=203，測(cè)定溫度298 K，單個(gè)樣品測(cè)試耗時(shí)14 min 53 s。5、優(yōu)化后的方法概述a.主要儀器與設(shè)備核磁共振波譜儀（可控溫，溫度精度不低于0.1 K；配備5 mm二合一寬帶液體探頭）；食物粉碎機(jī)；電子天平（感量分別為0.0001 g和0.01 g）；旋振蕩器（轉(zhuǎn)速2 000 rpm）；離心機(jī)（轉(zhuǎn)速12 000 r/min，溫度可調(diào)到4 及以下）；pH計(jì)（精度為0.01）;移液器（量程為10 L100 L和100 L1000 L。）b.堿性緩沖液配制600 mL硼酸-氯化鉀緩沖液（pH=9.0），加入300 mL0.1mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH

14、=9.0），混勻。c.測(cè)定步驟稱(chēng)取5.0 g試樣至50mL聚丙烯離心管中，加入堿性緩沖液10 mL，用渦旋振蕩器振蕩混勻2 min，在4下12 000 r/min離心10 min，收集上清液，用10 mL堿性緩沖液重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，轉(zhuǎn)移到25 mL具塞比色管中，加入500 L濃度為50 mg/mLHMPA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用堿性緩沖液定容到25 mL，取23 mL澄清液體過(guò)0.45 m微孔濾膜，為待測(cè)液。d.核磁共振波譜參考條件測(cè)定溫度：（2980.1）K；采樣點(diǎn)數(shù)（TD）：65 536；掃描次數(shù)（NS）：64；延遲時(shí)間（D1）：12 s；采集時(shí)間（AQ）：1.9268 s；增益（RG）：

15、203；脈沖序列：氫去耦的一維磷譜脈沖序列。e.試樣測(cè)定用移液槍精密移取450 L待測(cè)液至5 mm標(biāo)準(zhǔn)核磁管中，精密移取50 L重水于核磁管中，將二者混勻，進(jìn)行上機(jī)測(cè)試。f.數(shù)據(jù)預(yù)處理采用線(xiàn)寬因子為0.3 Hz的窗函數(shù)對(duì)原始的自由感應(yīng)衰減信號(hào)進(jìn)行傅里葉變換得到頻域譜，然后進(jìn)行自動(dòng)相位校正及基線(xiàn)平滑。g.定性分析如果試樣圖譜中存在化學(xué)位移與表2某種組分一致（變化范圍在5.0%之內(nèi)），則可判定試樣中存在該組分。表2不同磷酸根及內(nèi)標(biāo)參考化學(xué)位移表化合物名稱(chēng)化學(xué)位移（ppm）磷酸根2.59焦磷酸根-6.51三偏磷酸根-21.51三聚磷酸根-5.66-5.58-20.43-20.27六甲基磷酰三胺29.

16、91h.定量峰積分根據(jù)定性分析結(jié)果，進(jìn)行定量峰的積分，分別得到各磷酸根和內(nèi)標(biāo)六甲基磷酰三胺定量峰積分面積。i.結(jié)果計(jì)算試樣中磷酸根含量按式（1）計(jì)算：（1）式中：試樣中PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-含量，單位為克每千克（g/kg）；樣品稱(chēng)樣量，單位為克（g）；25.0 mL試樣提取液中含有六甲基磷酰三胺的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾（g/mol）；六甲基磷酰三胺摩爾質(zhì)量，為179.2 g/mol；上機(jī)樣品中PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-定量峰積分面積；上機(jī)樣品中六甲基磷酰

17、三胺定量峰積分面積；上機(jī)樣品中PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-積分區(qū)域?qū)?yīng)的磷原子數(shù)量，PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-分別計(jì)為1、3、2、3；上機(jī)樣品中六甲基磷酰三胺積分區(qū)域?qū)?yīng)的磷原子數(shù)量，計(jì)為1。計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位。二、方法學(xué)考察1、精密度分析采用HMPA內(nèi)標(biāo)法測(cè)定肉制品中磷酸鹽的日內(nèi)精密度為0.68% 3.55%，日間精密度為1.12%4.51%，且日內(nèi)與日間磷酸鹽測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異，方法精密度高。2、回收率實(shí)驗(yàn)往基質(zhì)中添加高中低三水平的磷酸鹽，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收

18、率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表3所示，采用HMPA內(nèi)標(biāo)法測(cè)定肉制品中磷酸鹽的回收率為97.0%112.0%，RSD為0.87%3.15%。表3加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差化合物名稱(chēng)基質(zhì)含量(g/kg)添加水平（g/kg）實(shí)測(cè)含量（g/kg）回收率（%）RSD（%）PO43-2.680.503.21106.02.132.004.6297.01.155.007.5898.01.56P3O93-00.500.55110.03.112.001.9899.02.185.005.28105.60.96P3O105-00.500.56112.03.152.002.08104.02.655.004.9298.42.1

19、4P2O74-0.480.500.52104.01.682.002.21110.50.985.005.11102.20.873、檢出限以信噪比S/N2確定檢出限。PO43-、P3O93-、P2O74-、P3O105-的檢出限分別為0.15、0.15、0.15、0.30 g/kg。4、方法比對(duì)使用核磁共振方法和離子色譜法分別對(duì)10個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行含量測(cè)試，結(jié)果如表4所示，兩種檢測(cè)方法的含量無(wú)顯著性差異，進(jìn)一步驗(yàn)證31P-NMR方法準(zhǔn)確、可靠。結(jié)果也表明在肉制品中磷酸鹽含量普遍較高。表4不同檢測(cè)方法的含量對(duì)比樣品編號(hào)樣品中各離子的含量（g/kg）PO43-P2O74-P3O93-P3O105-14.

20、55a/4.83b0.80a/0.87b0a/0b0a/0b24.91a/4.53b0.16a/0.15b0a/0b0a/0b30.62a/0.59b0a/0b0a/0b0a/0b43.90a/3.54b0.84a/0.78b0a/0b0a/0b54.95a/4.67b1.66a/1.56b0a/0b0a/0b62.68a/2.93b0.49a/0.52b0a/0b0a/0b73.34a/3.02 b0.88a/0.80b0a/0b0a/0b83.54a/3.96b0.62a/0.69b0a/0b0a/0b94.72a/4.65b1.38a/1.42b0a/0b0a/0b103.50a/3.34b0.61a/0.59b0a/0b0a/0b注：a為核磁共振法結(jié)果，b為離子色譜法結(jié)果三、實(shí)驗(yàn)室間協(xié)同試驗(yàn)結(jié)果本方法