連翹的抗氧化成分研究

1、連翹的抗氧化成分研究【摘要】目的研究連翹的抗氧化作用，并別離、鑒定連翹抗氧化有效成分。方法用二苯代苦味肼基自由基1,1-diphenyl-2-pirylhydrazyl(DPPH)去除實驗方法，對連翹的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇、水的萃取物進展抗氧化作用評價，并從有效部位別離得到化合物。結(jié)果與結(jié)論連翹的二氯甲烷萃取物具有很強的去除DPPH自由基的抗氧化活性，并從中別離、鑒定4個化合物，分別為連翹脂素(phillygenin)、連翹苷(phillyrin)、frsythialanA、連翹酯苷(frsythsideA)。其中，frsythialanA和連翹酯苷(frsythsideA)具有較強

2、的DPPH去除作用，其半數(shù)有效值I50分別為154.05和69.80g/l?！娟P(guān)鍵詞】連翹；抗氧化；DPPH；frsythialanA；連翹酯苷Abstrat：bjetiveTinvestigatetheantixidativeativityfFrsythiasuspensaandtislateandidentifytheativepnents.ethdsDPPHradialsavengingativityastestedfrtheeHextratanditsH2l2,BuH,H2fratins.ResultsandnlusinH2l2fratinsfrF.suspensaappearedpt

3、entantixidanteffetsagainsttheDPPHradial.Furpnentsereislatedandidentifiedasphillyrin,frsythialanAandfrsythsideA,respetively.FrsythialanAandfrsythsidehavestrngantixidantativityandtheI50valuesere154.05and69.80g/l,respetively.Keyrds：Frsythiasuspensa;Antixidant;DPPH;FrsythialanA;FrsythsideA現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證實氧化性應(yīng)

4、激大約與兩百多種疾病的發(fā)生有關(guān),其中包括自身免疫性疾并糖尿并白內(nèi)障、癌癥等的產(chǎn)生與開展都可由自由基及其代謝產(chǎn)物誘發(fā)1。生物體具有有效的防御系統(tǒng)來保護它們，免遭活性氧或其它自由基導(dǎo)致的紊亂與疾病24。然而，自由基形成與抗氧化防御系統(tǒng)之間出現(xiàn)不平衡，過多的氧化壓抑，遠超過防御機制才能，出現(xiàn)酶抗氧化防御的活性減小或在血清中的抗氧化劑濃度降低57。生物體內(nèi)過量的氧自由基會造成生物膜損傷、蛋白質(zhì)變性、酶失活及DNA復(fù)制出現(xiàn)錯誤等，這些勢必導(dǎo)致一系列疾病，如血管粥樣硬化、高血壓并糖尿并癌、帕金森并老年癡呆癥、衰老等。這時抗氧化劑就起到非常重要的角色?？寡趸烙到y(tǒng)是靠消除活性氧或使活性氧非活性化來完成81

5、0。所以人們更多地關(guān)心這種酶抗氧化體系活性的進步或可以直接消除活性氧的抗氧化劑。如今研究主要集中在類似-lipiaid、enzyeQ10、GSH等人體內(nèi)細胞程度形成的抗氧化劑，或如維生素、維生素E等人體內(nèi)不形成但通過食物、天然物攝入多種多樣的抗氧化劑11。但是合成的抗氧化劑，不僅是因為它本身的毒性，還有在高濃度攝取等都可以引起有害身體的問題，而且已有很多研究說明吃藥不如通過天然物攝取抗氧化劑，因此越來越多的研究者關(guān)心天然抗氧化劑。中藥連翹為木犀科連翹屬植物連翹Frsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的枯燥果實，始載于?神農(nóng)本草經(jīng)?，性平，氣微香，味微苦，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、

6、消癰散結(jié)、強心利尿和降血壓之成效，主產(chǎn)于我國東北、華北、長江流域至云南等地，其中以山西晉南，河南豫西所產(chǎn)不但色澤鮮亮且質(zhì)量佳，為道地藥材。連翹是我國常用的大宗藥材，主要含有連翹酚(frsythl)、連翹苷(Phillyrin)、連翹苷元(phillygenin)、齊墩果酸(leanliaid,LA)、白樺脂酸(betuliniaid)、烏索酸(ursliaid,UA)、松脂素(pinresinl)、甾醇化合物、馬苔樹脂醇苷(atairesinside)和多種烴類、醛酮類、醇酯醚類揮發(fā)性成分12?，F(xiàn)代藥理研究說明，連翹具有廣譜抗菌、抗病毒等作用，對丹毒、頸淋巴結(jié)結(jié)核、尿路感染、扁桃體炎、腎炎雙球

7、菌等均有抑制作用，常用于急性胃炎，呼吸道感染等病癥。國內(nèi)有連翹敗毒片、復(fù)方鱉甲軟肝片、復(fù)方金連片、雙黃連口服液、復(fù)方金銀花沖劑等連翹復(fù)方制劑。雖然對連翹的抗氧化活性報道了一些，但對連翹的活性氧消除作用及對氧化應(yīng)激保護作用的活性物質(zhì)的研究還不多。因此，對糖尿并癌、動脈硬化、老年癡呆以及老化等諸多疾病起主要因素的氧化應(yīng)激，進展說明連翹抗氧化性能，是很有研究意義的。所以，本研究利用體外二苯代苦味肼基自由基1,1-diphenyl-2-pirylhydrazyl(DPPH)去除方法，來討論連翹的抗氧化效果，并別離、鑒定有效成分。1材料1,1-diphenyl-2-pirylhydrazyl(DPPH)

8、購自日本akPureheialIndustries,Ltd.，別離用硅膠200400目購自青島化工廠，連翹果實購于北京同仁堂藥店，并經(jīng)本教研室鑒定為Frsythiasuspensa果實。所有試劑均為分析純。2方法2.1連翹的提取與別離連翹根500g，用8，6，6倍量的80%eH加熱回流提取3次，每次3h，合并3次提取液，減壓濃縮，真空枯燥，得甲醇提取干膏84.5g。甲醇提取物用500l的水混懸，依次用二氯甲烷3次、正丁醇3次萃取，得二氯甲烷萃取物45.3g。2.2連翹抗氧化有效成分的別離取連翹二氯甲烷萃取物(24g)進展硅膠柱色譜，醋酸乙酯-甲醇100121梯度洗脫，薄層色譜配合檢識，得到6個

9、組分Fr.16。Fr.4再經(jīng)硅膠柱色譜，三氯甲烷-甲醇201洗脫，重結(jié)晶，得到化合物120g，298g，320g，425g。2.3DPPH自由基消除活性抗氧化活性是參照文獻13稍加修改后用光譜儀檢測。用乙醇溶解的不同濃度的樣品100l與120l/LDPPH溶液100l，參加96孔板中，混勻后，室溫放置30in，然后在517n處測吸收度。DPPH自由基程度用irplatereader(SPETRAax340P,leularDevies,Sunnyvale,A,USA)測定。用百分率與不加樣品的對照組進展自由基消除效果的比擬，然后用半數(shù)抑制率I50抑制50%的DPPH自由基生成所需樣品的濃度表示抗

10、氧化活性。2.4統(tǒng)計學(xué)方法每組結(jié)果以s表示，控制組與樣品處理組間通過SAS8.1(SASInstituteIn.,ary,N,USA)軟件，用ne-ayANVA分析數(shù)據(jù)。P0.05那么可認為組間具有統(tǒng)計學(xué)的顯著差異。3結(jié)果3.1體外DPPH消除作用DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基,1,1-diphenyl-2-piryhydrazyl)是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517n處有強烈吸收，在有自由基去除劑存在時，自由基去除劑提供一個電子與DPPH的孤對電子配對，而使其褪色，褪色程度與其承受的電子呈定量關(guān)系，在517n處的吸光度變小，其變化程度與自由基去除程度呈線性

11、關(guān)系，即自由基去除劑的去除自由基才能越強，吸光度越校轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.連翹甲醇提取物及其不同溶劑萃取物均有濃度依賴性的DPPH消除作用，尤其是二氯甲烷萃取物具有較強的DPPH消除作用見圖1。如下圖，不同濃度的連翹的甲醇提取物以及其二氯甲烷萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物均顯示出劑量依賴性地DPPH自由離子基消除活性P0.05。尤其是二氯甲烷萃取物對DPPH自由離子基的產(chǎn)生具有最強的抑制作用P0.05，在100g/l濃度就去除75%的DPPH，在各萃取組分中活性最強，可判斷為活性成分集中在連翹的二氯甲烷萃取物中。3.2連翹有效成分的鑒定從連翹二氯甲烷萃取物中，別離得到4個化合物。根據(jù)它們的理化

12、性質(zhì)及其質(zhì)譜、1H-NR、13-NR，與文獻1416一致，被鑒定為連翹脂素(phillygenin)、連翹苷(phillyrin)、frsythialanA、連翹酯苷(frsythsideA)(見圖2)。3.3連翹有效成分的鑒定對所別離的4個化合物進展DPPH自由基去除活性檢測，結(jié)果frsythianlanA和連翹酯苷(frsythsideA)具有較高的DPPH去除活性見表1。它們的半數(shù)抑制率I50分別為154.05和69.80g/l，而其它兩個化合物的半數(shù)抑制率超過200g/l。表1連翹有效成分的DPPH自由基去除作用(略)4討論活性氧自由基是生物體生命活動過程中由機體生物化學(xué)反響所產(chǎn)生的中

13、間產(chǎn)物，是一些處于激發(fā)態(tài)的含氧基團，在生物體衰老與疾并正常的免疫代謝、細胞信號傳導(dǎo)等過程中都起著重要的作用。在正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和去除是平衡的，一旦自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)自由基代謝可能失衡，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、細胞損傷、DNA斷裂等。研究發(fā)現(xiàn)，生物體的多種疾病都與自由基對機體的氧化損傷有關(guān)。抗氧化劑或自由基去除劑能有效抑制或緩解自由基對機體的不利影響，起到防并治病和延緩衰老的作用，因此尋找和開發(fā)可以去除氧自由基的抗氧化劑成為當(dāng)前許多學(xué)科研究的熱點。本實驗采用了DPPH自由基去除活性方法來測定連翹各組分的抗氧化活性，這種方法在國外廣泛用于植物材料的總抗氧化活性的評價和

14、抗氧化劑的篩眩DPPH是一種穩(wěn)定存在的有機自由基，由于苯環(huán)的內(nèi)軛和位阻及硝基的吸電子作用，呈現(xiàn)紫色，被復(fù)原后變?yōu)闇\黃色，通過測定反響體系在517n附近的吸收峰的下降程度可以直接評價其抗氧化活性，變化程度與自由基去除程度呈線性關(guān)系。該方法簡便易行，且靈敏度高。實驗結(jié)果說明，連翹的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇和水萃取物都具有一定的抗氧化活性。甲醇提取物和二氯甲烷萃取物具有較強的抗DPPH自由基活性，尤其是二氯甲烷萃取物具有最強的抗氧化活性P0.05，從中別離、鑒定了有效成分frsythialanA和連翹酯苷，但其確切的作用機制尚需進一步實驗證實。在接下來的實驗中，課題組將結(jié)合化學(xué)成分研究配合現(xiàn)代

15、藥理學(xué)跟蹤，對獲得的主要成分進展深化研究，為其開發(fā)利用提供化學(xué)和藥理學(xué)根據(jù)，以便擴大我國藥用資源的開發(fā)和利用。【參考文獻】1BekanKB,AesBN.ThefreeradialtheryfagingaturesJ.PhysilRev.，1998，78(2):547.2SiesH.xidativestress:xidantsandantixidantsJ.ExpPhysilgy.，1997，82(2):291.3EvansP，HalliellB.Freeradialsandhearing:ause，nsequene，andriteriaJ.AnnNYAadfSi.，1999，884(ttxii

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