噬菌體隨機(jī)肽庫 中文說明書 phage display

1、目錄簡介 2 培養(yǎng)基和溶液 5 常規(guī)M13方法 .6 淘選程序（固定靶分子）.8 結(jié)合克隆的特征.12 其他淘選方法（液相結(jié)合法）.15 其他抗原表位作圖方法（Protein A/G捕獲法）.16 附錄：優(yōu)化肽結(jié)合相互作用.19 文庫的氨基酸分布.21 試劑盒組成： （如無特殊說明，試劑盒中所有成分均需-20 隨機(jī)十二肽噬菌體展示文庫 100 l, 1.51013 pfu/ml。貯存于含50%甘油的TBS溶液中。復(fù)雜度 2.7109個(gè)轉(zhuǎn)化子。 -28 gIII測序引物 5-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3, 100 pmol, 1 pmol/ -96 gIII

2、測序引物 5-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3, 100 pmol/l, 1 pmol/ E.coli ER2738宿主菌 F lacIq (lacZ)M15 proA+B+ zzf:Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi (lac-proAB) (hsdMS-mcrB)5 (rk m k McrBC)。該菌株以含50%甘油的菌體培養(yǎng)物形式提供，非感受態(tài)細(xì)胞。貯存于-70 鏈霉親和素Streptavidin, 凍干粉 1.5 mg 生物素，10 mM 100 l Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注冊商標(biāo)。 概述噬

3、菌體展示是一項(xiàng)選擇技術(shù)，它將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白將展示在病毒顆粒的表面，而編碼這個(gè)融合子的DNA則位于該病毒粒子內(nèi)。噬菌體展示技術(shù)使大量隨機(jī)多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使得各種靶分子（抗體、酶、細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過一種被稱為淘選（panning）的體外選擇程序得以快速鑒定。最簡單的淘選程序，是將噬菌體展示肽庫與包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共溫育，先洗去未結(jié)合噬菌體，然后洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。被洗脫的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，然后再進(jìn)行下一輪的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)，以富集那些可結(jié)合序列。經(jīng)3-4輪淘選后，通過DNA測序?qū)γ總€(gè)可結(jié)合克隆進(jìn)行定性。 展

4、示在噬菌體表面的隨機(jī)肽庫可應(yīng)用于許多方面(3)，包括繪制抗原表位圖譜(4-6)、研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（7）和鑒定非肽配體的肽模擬型（8-11。）生物活性肽分子的鑒定可以通過對固定在平板上的純化受體進(jìn)行淘選（12）也可以在完整細(xì)胞上進(jìn)行淘選（13-15）。蛋白酶底物的鑒定可通過在隨機(jī)肽區(qū)域的上游加一段親和tag，然后選用特異性的介質(zhì)來區(qū)分切割和未切割的噬菌體（16）。另外，大的蛋白質(zhì)分子如：抗體（17）、激素（18）、蛋白酶抑制劑（19）、酶（20）和結(jié)合蛋白（21）也可展示在噬菌體上，通過對隨機(jī)突變文庫的篩選，分離出各種具有親和力或特異性改變的變異株。 Ph.D.-12噬菌體展示肽庫試劑

5、盒將隨機(jī)十二肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pIII)上，因而是一個(gè)組合文庫。所展示的十二肽表達(dá)在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一個(gè)氨基酸就是隨機(jī)十二肽的第一個(gè)氨基酸, 十二肽后面是一段短小的間隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser組成，然后是野生型pIII蛋白。該文庫含有2.7109個(gè)電轉(zhuǎn)化序列，用10 l本品提供的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)序列一次可產(chǎn)生55個(gè)拷貝，對原始文庫進(jìn)行大量測序（見附錄）表明該文庫序列具有廣泛的多樣性，無明顯的殘基位置偏嗜。建議不要擴(kuò)增原始文庫來進(jìn)行另外的淘選試驗(yàn)，因?yàn)橐坏┰贁U(kuò)增便會出現(xiàn)序列偏嗜現(xiàn)象。 NEB應(yīng)用本品分別鑒定出了與鏈霉親和素和單克隆抗體相結(jié)合的共

6、有結(jié)合肽序列（見圖2）。大量實(shí)驗(yàn)證明，任何情況下該文庫的復(fù)雜度都足以產(chǎn)生多個(gè)可編碼相同肽基序的DNA序列。圖2用Ph.D.-12肽庫測定抗原決定簇。用抗?-內(nèi)啡肽單克隆抗體對Ph.D.-12展示肽文庫進(jìn)行液相淘選，然后用ProteinA-瓊脂糖（第1和第3輪淘選）或Protein G-瓊脂糖(第2輪淘選)親和捕獲抗體-噬菌體復(fù)合物。每輪淘選所選到的結(jié)合序列與R-內(nèi)啡肽的前12個(gè)氨基酸殘基序列比較列于上圖內(nèi)，共有序列元件用方框示出。結(jié)果清楚地顯示該抗體的抗原決定簇序列落在R-內(nèi)啡肽的前四個(gè)氨基酸殘基（YGGF）處，在第三位有一定的可變性。第三輪篩有一個(gè)篩選到的克隆無插入子。培養(yǎng)基和溶液LB培養(yǎng)基

7、：每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。高壓滅菌，室溫貯存。 LB/IPTG/Xgal平板： LB培養(yǎng)基 + 15 g/L瓊脂粉。高壓滅菌，冷卻至低于70時(shí)，加入1 ml IPTG/Xgal*，混勻倒平板。平板4頂層瓊脂：每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl26H2O, 7 g瓊脂粉。高壓滅菌，分成50 ml等份。固體培養(yǎng)基室溫貯存，用時(shí)微波爐融化。 四環(huán)素貯液：以20 mg/ml的濃度溶于乙醇中。-20LB-Tet平板：LB培養(yǎng)基 + 15

8、g/L瓊脂粉。高壓滅菌，冷卻至低于70時(shí)，加入1 ml四環(huán)素貯液，混勻倒平板。平板4封阻緩沖液：0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。過濾除菌，4貯存。 TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mMPEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl。高壓滅菌，室溫貯存。 碘化物緩沖液：10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaCl。室溫避光貯存。 鏈霉親和素貯液：將1.5 mg鏈霉親和素凍干粉（本試劑盒提供）溶于1 ml 10 mM磷酸鈉(

9、pH7.2)、100 mM NaCl、0.02% NaN3溶液中。4或-20*IPTG/Xgal配方：將1.25 g IPTG (isopropyl D-thiogalactoside)和1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside)溶于25 ml二甲基甲酰胺中。溶液-20常規(guī)M13方法M13不是一個(gè)裂解性噬菌體，噬菌斑的形成不是由于菌體裂解而是由于細(xì)胞生長力減弱所致，因此其噬菌斑是渾濁的而不是清亮的。 菌株保存1. 本試劑盒提供的宿主菌是一個(gè)強(qiáng)F+菌株，生長迅速，特別適合于M13噬菌體的增殖。盡管ER2738是一個(gè)recA+菌株，但我們在

10、使用M13或噬菌粒載體的過程中從未發(fā)現(xiàn)有體內(nèi)重組現(xiàn)象發(fā)生。其他F+的商品菌株如：DH5F和XL1-Blue或許可以代替ER2738應(yīng)用,但未曾用本系統(tǒng)檢驗(yàn)過。 2. 由于M13是一個(gè)雄性特異性大腸桿菌噬菌體，建議用于M13增殖的所有菌液都是從F因子正向選擇培養(yǎng)基上挑菌接種的，而不是直接從本試劑盒提供的甘油菌接種培養(yǎng)的。ER2738的F因子上含有一個(gè)小轉(zhuǎn)座子，賦予該細(xì)胞四環(huán)素抗性，因此可以在含四環(huán)素的平板上鋪板篩選含F(xiàn)因子的細(xì)胞。 3. 從隨產(chǎn)品提供的ER2738甘油菌劃線接種LB-Tet平板，倒置平板37培養(yǎng)過夜。用封口膜封閉平板后44. 用于感染噬菌體的ER2738菌液既可以在LB也可以在L

11、B-Tet培養(yǎng)基中生長。只要不對培養(yǎng)物進(jìn)行連續(xù)稀釋，在非選擇性培養(yǎng)基中F因子的丟失并不嚴(yán)重。 避免噬菌體污染M13噬菌體的衣殼蛋白pIII通過與受體菌的F性纖毛相結(jié)合而介導(dǎo)感染。與野生型噬菌體相比，外源蛋白或多肽融合在pIII蛋白的N端展示明顯降低了文庫噬菌體的感染力。因此，當(dāng)有任何野生型噬菌體污染時(shí)，每輪淘選試驗(yàn)之間的擴(kuò)增步驟會強(qiáng)烈傾向于擴(kuò)增野生型噬菌體，如果同時(shí)沒有一個(gè)強(qiáng)有力的體外噬菌體結(jié)合選擇程序來避免，即使痕量水平的污染也會在三輪淘選后使淘選出的噬菌體多數(shù)為野生型。 1. 在本手冊所述的所有步驟中均使用帶濾芯吸頭，可以使污染外界環(huán)境中噬菌體的可能性大大降低。 2. 由于文庫噬菌體源于常

12、規(guī)克隆載體M13mp19，其含有l(wèi)acZ基因，當(dāng)鋪在含IPTG和Xgal的平板上時(shí)，噬菌斑將呈藍(lán)色。而外界污染的絲狀噬菌體在同樣的平板上將呈白色噬菌斑，同時(shí)這些噬菌斑還會比文庫噬菌體的噬菌斑更大更模糊。因此所有的滴度檢測步驟，建議一定要在LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)基上鋪板，如果有白色噬菌斑，則只挑取藍(lán)色噬菌斑進(jìn)行測序。 測定噬菌體滴度只有當(dāng)噬菌體的感染復(fù)度MOI (multiplicity of infection)值遠(yuǎn)低于1時(shí)（即細(xì)胞過量時(shí)），噬菌斑的數(shù)量才會隨著加入噬菌體的量而呈線性增加。正因如此，建議檢測噬菌體貯液的滴度時(shí)，在感染前進(jìn)行稀釋，而不是在高M(jìn)OI值的情況下稀釋被感染的細(xì)胞。

13、低MOI值有助于確保每個(gè)噬菌斑僅含一個(gè)DNA序列。 1. 接種ER2738單菌落于5-10 ml LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)中期（OD600 0.5）。 2. 細(xì)胞生長時(shí)，微波爐融化上層瓊脂，分成3 ml等份于滅菌試管中，每個(gè)噬菌體稀釋度一管。保存于453. 374. 在LB中準(zhǔn)備10倍系列稀釋的噬菌體。 建議稀釋范圍：擴(kuò)增的噬菌體培養(yǎng)物上清：108-1011；未擴(kuò)增的淘選洗脫物：101-104。每個(gè)稀釋度換一新鮮吸頭，建議使用帶濾芯吸頭以避免交叉污染。 5. 當(dāng)菌體培養(yǎng)物達(dá)對數(shù)中期，分成200 l等份于微量離心管中，每個(gè)噬菌體稀釋度一管。 6. 每管加入10 l不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩

14、混勻，室溫溫育1-5 min。 7. 將感染細(xì)胞加入45預(yù)溫的上層瓊脂培養(yǎng)管中，每次一管，快速混勻，立即傾注于378. 待平板冷卻5 min后，倒置于379. 檢查平板，計(jì)數(shù)有102個(gè)噬菌斑的平板上的斑數(shù)。然后用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10 l噬菌體的空斑形成單位（pfu）滴度。 淘選程序最簡單直接的淘選方法有：直接將靶分子包被于塑材表面（通過非特異的疏水作用或靜電相互作用），洗去過量的未吸附分子，然后將噬菌體庫覆蓋在已包被的靶分子的表面。根據(jù)靶分子的不同，直接包被法偶爾會導(dǎo)致配體結(jié)合位點(diǎn)難以進(jìn)入，這或許是由于分子的立體封阻或許是由于靶分子表面的部分變性而引起。在這些情況下，可先將噬菌體庫在

15、液相中與靶分子進(jìn)行預(yù)結(jié)合，然后將噬菌體-靶分子復(fù)合物親和捕獲于鏈霉親和素包被的表面（見15頁）或其他親和介質(zhì)上（見16頁）。由于直接包被法相對簡單，建議先按以下步驟試用此方法。如果沒有淘選到明顯的共有結(jié)合序列，再進(jìn)行上述液相結(jié)合試驗(yàn)中的一種。 第一天 根據(jù)需同時(shí)在其上進(jìn)行文庫淘選的靶分子的數(shù)量和種類不同，淘選試驗(yàn)可以在單個(gè)滅菌聚苯乙烯培養(yǎng)皿、12-或24-孔板、96孔微量板中進(jìn)行。每種靶分子至少包被一個(gè)板（或一個(gè)孔）。下述方法中給出的量是6015 mm培養(yǎng)皿的用量，括號中為微孔板的用量，其他中等尺寸的孔相應(yīng)地調(diào)整此用量。但每種情況下，加入的噬菌體數(shù)量都是相同的：1.51011個(gè)病毒子。 1.

16、準(zhǔn)備100 g/ml的靶分子溶液（溶于0.1 M pH 8.6的NaHCO3）。 如果需要穩(wěn)定靶分子，也可使用其他相似離子強(qiáng)度的緩沖液（含金屬離子等）。2. 每板（孔）加入1.5 ml（微孔板每孔150 l）上述溶液，反復(fù)旋轉(zhuǎn)直到表面完全濕潤（小心不要使溶液濺出）。 3. 在增濕容器（如：排列有濕紙巾的可封口塑料盒）中4輕微震蕩，孵育過夜。平板可在此容器中4第二天 4. 挑ER2738單克?。ㄊ删w滴度測定時(shí)鋪的板）于10 ml LB液體培養(yǎng)基中。如果同一天擴(kuò)增洗脫的噬菌體，也可將ER2738接種于20 ml LB液體培養(yǎng)基，這時(shí)請用250 ml三角瓶（不要用50 ml錐形管）。375. 倒掉

17、每板中的包被液，板倒置在干凈的紙巾上用力拍甩以除去殘余溶液。每板（或孔）加滿封阻液，46. 按5中所述方法除去封阻液。再用TBST (TBS+0.1% v/v Tween-20)緩沖液快速洗板6次。每次均旋轉(zhuǎn)以使板或孔的底部及邊緣均被洗到，傾去緩沖液，倒置在干凈紙巾上拍甩以除去殘余溶液（或使用自動洗板機(jī)）。此操作要快以避免板干燥。7. 用1 ml（微孔板則用100 l）的TBST緩沖液稀釋41010的噬菌體（即10 l的原始文庫），然后加到已包被好的板上，室溫溫和搖動10-60 min。 8. 傾倒除去未結(jié)合噬菌體，倒置板在干凈的紙巾上拍甩除去殘余溶液。 9. 按6中所述方法用TBST緩沖液洗

18、板10次，每次換一干凈紙巾以避免交叉污染。 10. 根據(jù)所研究的分子間相互作用，用1 ml（微孔板則用100 l）適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液洗脫結(jié)合的噬菌體。一般情況下，是將靶分子的已知配體以0.1-1 mM的濃度溶于TBS溶液中或者用游離靶分子溶液（100 g/ml溶于TBS中）從固定靶分子上將結(jié)合的噬菌體競爭性洗脫下來。室溫溫和搖動10-60 min，將洗脫液吸入另一干凈微量離心管中。 10a.另外，也可用非特異性緩沖液如0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA來分離已結(jié)合的分子：溫和搖動10 min，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中。然后再用150 l（微量孔則

19、用15 l）1M HCl（pH 9.1）中和上述洗脫液。 11. 按上述常規(guī)M13方法中的程序測定少量（1 l）洗脫物的滴度。如需要，可對第一或第二輪洗脫物滴度測定所得的噬菌斑進(jìn)行測序，方法見下述。（必要時(shí)可將剩余洗脫物4貯存過夜，第二天擴(kuò)增。這時(shí)，可將ER2738在LB-Tet培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第二天將培養(yǎng)物1:100稀釋于20 ml LB中（用250 ml三角瓶盛裝），加入未擴(kuò)增洗脫物。3712. 剩余洗脫物應(yīng)當(dāng)被擴(kuò)增：將洗脫物加入到20 ml ER2738培養(yǎng)物中（菌體應(yīng)當(dāng)處于對數(shù)前期），37劇烈搖動培養(yǎng)4.5 hr。 13. 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一離心管中，然后，414. 將上清的上部80%轉(zhuǎn)

20、入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl。讓噬菌體4第三天 15. 416. 沉淀物重懸于1 ml TBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管中，417. 上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60 min。 418. 沉淀物重懸于200 l TBS, 0.02% NaN3中。離心1 min，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉(zhuǎn)入新鮮管中。此即為擴(kuò)增后的洗脫物。 19. 根據(jù)上述常規(guī)M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定擴(kuò)增后的洗脫物。420. 再包被一個(gè)板或孔準(zhǔn)備第二輪淘選時(shí)用，見第8頁步驟1-3。 第四和第五天 21. 計(jì)數(shù)板上藍(lán)斑數(shù)確定滴度。用這個(gè)值來計(jì)算

21、相應(yīng)于1-21011 pfu的加入量。如果滴度太低，接下來的幾輪淘選可用低至109 pfu的噬菌體加入量進(jìn)行試驗(yàn)。 22. 進(jìn)行第二輪淘選：用第一輪淘選擴(kuò)增的洗脫物中1-21011 pfu的噬菌體量重復(fù)步驟4-18，在清洗步驟中將Tween的濃度增至0.5% (v/v)。 23. 在LB/IPTG/Xgal平板上測定第二輪淘選所得洗脫物擴(kuò)增后的滴度。 24. 再包被一個(gè)板或孔準(zhǔn)備第三輪淘選時(shí)用，見第8頁步驟1-3。 第六天25. 進(jìn)行第三輪淘選：用第二輪淘選擴(kuò)增的洗脫物中21011 pfu的噬菌體量重復(fù)步驟4-11，清洗步驟中同樣用0.5% (v/v)的Tween。 26. 在LB/IPTG/

22、Xgal平板上測定第三輪淘選所得洗脫物未擴(kuò)增時(shí)的滴度。第三輪洗脫物不必再擴(kuò)增，除非還要進(jìn)行第四輪淘選（可選步驟，見附錄）。滴度測定時(shí)得到的噬菌斑可做測序用：只要注意平板培養(yǎng)時(shí)間不要超過18小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間過長容易出現(xiàn)缺失。其余洗脫物427. 挑一ER2738單克隆于LB-Tet培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜（不要接種稀釋后的鋪板培養(yǎng)物）。 對照淘選試驗(yàn)按照上述程序，以鏈霉親和素作為靶分子，在封阻液中加入0.1 g/ml的鏈霉親和素以結(jié)合BSA中混有的少量生物素。用0.1 mM的生物素（溶于TBS中）洗脫結(jié)合噬菌體，至少作用30 min。經(jīng)三輪富集/擴(kuò)增后，得到的鏈霉親和素結(jié)合肽的共有序列應(yīng)當(dāng)含有如下基序： H

23、is-Pro-Gln (HPQ) (8)。 圖3隨機(jī)十二肽-gIII融合蛋白的N末端序列。融合蛋白表達(dá)時(shí)N端有一段信號肽前導(dǎo)序列，蛋白分泌后前導(dǎo)序列被切除，使隨機(jī)肽直接位于成熟蛋白的N末端，下箭頭指示前導(dǎo)序列的切割位點(diǎn)。-28和-96引物的互補(bǔ)位置也在圖中標(biāo)出。圖4精簡遺傳密碼表。文庫的隨機(jī)序列區(qū)域僅用32個(gè)密碼子編碼所有20種氨基酸。這使單密碼子氨基酸的出現(xiàn)頻率相對較高，同時(shí)排除了三個(gè)終止密碼子中的兩個(gè)。在構(gòu)建該文庫的菌株中，琥珀終止子TAG(*)可被Gln抑制。結(jié)合克隆的特征鑒定噬菌斑的擴(kuò)增 1. 將ER2738過夜培養(yǎng)物按1:100稀釋接種于LB培養(yǎng)基，分1 ml到培養(yǎng)管中。每個(gè)要鑒定的

24、克隆一管。一般情況下，由第三輪淘選物中取10個(gè)克隆便足以檢測結(jié)合肽中的共有序列。 2. 用滅菌牙簽或吸頭，挑一藍(lán)色噬菌斑到上述1 ml培養(yǎng)管中。注意：要從總量不到100個(gè)噬菌斑的平板上挑選，以便保證每個(gè)被挑的噬菌斑僅含一個(gè)DNA序列。 3. 374. 備選步驟。除測序單個(gè)克隆外，也可以對整個(gè)被選噬菌體集合進(jìn)行測序。這樣只通過一個(gè)步驟就可以得到共有結(jié)合序列，但這種情況只是當(dāng)公有序列元件出現(xiàn)在每個(gè)克隆的12殘基“框架”內(nèi)相同位置的時(shí)候。加10 l未擴(kuò)增的洗脫物到1 ml稀釋的過夜培養(yǎng)物中，375. 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量離心管中，離心30 sec。上清轉(zhuǎn)入以新鮮管中，再離心。用移液器將80%的上清轉(zhuǎn)入新鮮

25、離心管，此即為擴(kuò)增噬菌體貯液，可以4貯存幾個(gè)星期而對滴度影響不大。長期貯存應(yīng)用滅菌甘油1:1稀釋后，-20測序模板的快速純化(22)本方法非?？焖?，無需酚或?qū)游?，可以產(chǎn)生足夠純的模板進(jìn)行手工或自動雙脫氧測序。 1. 按上述方法進(jìn)行噬菌斑擴(kuò)增，在第一步離心后，將500 l含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新鮮離心管。 2. 加200 l PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置10 min。 3.離心10 min，棄上清液。 4. 短暫離心，小心吸去殘余上清。 5. 沉淀物徹底重懸于100 l碘化物緩沖液中，加入250 l乙醇。室溫溫育10 min。短時(shí)間的室溫溫育使單鏈?zhǔn)删wDNA沉淀而大多數(shù)噬菌體蛋白保持在溶液

26、中。6. 離心10 min，棄上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暫真空干燥。 7. 沉淀重懸于30 l TE 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA中。 8. 5 l的上述模板溶液足夠進(jìn)行35S或33P標(biāo)記的手工雙脫氧測序, 或染料標(biāo)記的自動循環(huán)雙脫氧測序。根據(jù)測序方法的不同, 適當(dāng)增減模板用量。 測序指南1. 建議用-28引物進(jìn)行手工雙脫氧測序，而-96引物應(yīng)用于自動測序。 2. 所讀序列相應(yīng)于模板的反義鏈。然后將互補(bǔ)鏈寫出，與圖3中的上鏈對照進(jìn)行檢查。檢查隨機(jī)區(qū)域內(nèi)每個(gè)密碼子的第三位是否為G或T。根據(jù)圖4所列的遺傳密碼表由此鏈翻譯得到氨基酸序列。 3. 本文庫的宿

27、主菌為ER2738 (supE), 在此菌株中，終止密碼子TAG被谷氨酰胺(Gln)所抑制。因此翻譯時(shí)，應(yīng)將TAG翻譯為谷氨酰胺（見圖4）。 用ELISA檢測所選多肽對靶分子的結(jié)合1. 在擴(kuò)增噬菌斑進(jìn)行DNA測序（見12頁）時(shí)，將所剩余的含噬菌斑上清42. 對每一個(gè)要鑒定的噬菌斑克隆，接種一管ER2738于20 ml LB培養(yǎng)基中，373. 于每管ER2738培養(yǎng)液中加入5 l噬菌體上清，374. 上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，10,000 rpm離心10 min。上清移入新鮮離心管，再離心。 5. 取80%上清于新鮮離心管中，加1/6體積的PEG/NaCl。46. 47. 沉淀重懸于1 ml TB

28、S中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管，4離心5 min除去沉淀中的殘留細(xì)胞。 8. 上清轉(zhuǎn)入新鮮微量離心管，加1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上作用15-60 min。 49. 沉淀重懸于50 l TBS中，按6-7頁常規(guī)M13方法中所述測定噬菌體滴度。410. 用100-200 l 100 g /ml的靶分子(溶于0.1 M pH 8.6 NaHCO3中)包被ELISA板的每個(gè)孔，每個(gè)待鑒定克隆一排包被孔。在密封的濕盒（如：排有濕紙巾的封口塑料盒）中411. 甩出多余靶分子溶液，并倒置平板在紙巾上拍甩除去殘液。每孔加滿封阻液。另外，每個(gè)待鑒定克隆的一排未包被孔也加入封阻液，以檢測所選序列對BSA包

29、被塑料板的結(jié)合力。在將噬菌體加入靶分子包被板前，還要再準(zhǔn)備一個(gè)微量滴定板進(jìn)行噬菌體的系列稀釋，這個(gè)板也要封阻。單獨(dú)在另外一個(gè)封阻板中進(jìn)行稀釋是為了避免稀釋過程中有噬菌體吸附到靶分子上。最后，所有封阻板412. 甩出封阻液，用1TBS/Tween洗板6次，每次均倒置平板在干凈紙巾上拍甩去洗液，Tween濃度應(yīng)當(dāng)與淘選清洗步驟中所用濃度相同。 13. 在單獨(dú)的封阻板中每孔預(yù)先加入200 l TBS/Tween，由每排第一孔加入1012個(gè)病毒子開始對噬菌體進(jìn)行4倍系列稀釋至第12孔2105個(gè)病毒子。 14. 用多通道移液器將每排稀釋好的噬菌體加入包被有靶分子的板中。室溫震蕩作用1-2 hrs。 15

30、. 用1TBS/Tween洗板6次（同步驟12）。 16. 在封阻液中以1:5,000的比例稀釋HRP標(biāo)記的抗-M13抗體（Pharmacia #27-9411-01）。每孔加入200 l稀釋抗體，室溫震蕩作用1 hr。 17. 用1TBS/Tween洗板6次（同步驟12）。 18. 按下述方法準(zhǔn)備HRP底物溶液：ABTS貯液可以提前準(zhǔn)備：將22 mg ABTS（Sigma #A1888）溶于100 ml 50 mM的檸檬酸鈉溶液（pH 4.0）中，過濾除菌，4貯存。對每個(gè)待檢測板，于檢測步驟前將36 19. 每孔加200 l底物溶液，室溫作用10-60 min。 20. 用讀板儀記錄405-

31、415 nm處的吸光值。其他淘選方法 (液相結(jié)合法)除直接用靶分子包被平板外，也可以使靶分子和噬菌體在液相中反應(yīng)，然后親和捕獲噬菌體/靶分子復(fù)合物。根據(jù)靶分子的不同，液相結(jié)合可能會產(chǎn)生比表面結(jié)合更好的結(jié)合動力學(xué)特征，還會避免塑料表面的靶分子有部分變性的問題。親和捕獲要求在靶分子上有某種親和tag，通常的做法是將靶分子生物素化，然后用固定化的鏈霉親和素捕獲靶分子/噬菌體復(fù)合物。 靶分子的生物素化1. 將2 mg靶蛋白溶于1 ml 50 mM的NaHCO3 (pH 8.5) 中，為了保持靶蛋白的穩(wěn)定性，也可用其他緩沖液，但不要用含游離氨基的緩沖液（如：Tris）。 2. 用前，溶解1 mg Sul

32、fo-NHS-LC-生物素(可從Pierce購買，貨號 #21335)于1 ml水中，震蕩混勻。加74 l此溶液到靶蛋白溶液中，本試劑為生物素的水溶性活性酯，可以特異性地結(jié)合到溶液中（或表面）賴氨酸殘基的-氨基上。剩余的未用溶液應(yīng)拋棄，因?yàn)橘A存期內(nèi)此酯很容易就會水解掉。 3. 將管冰上放置2 hrs。 4. 透析除去未反應(yīng)的生物素，對1升TBS緩沖液進(jìn)行透析，至少更換兩次透析液，也可用凝膠過濾或CentriconTM（Amicon）等超濾裝置。 5. 用Bradford或Lowry方法對生物素化蛋白進(jìn)行定量。靶蛋白的生物素化可用商品抗生物素抗體進(jìn)行Western檢測或ELISA得以證實(shí)。通過染

33、料HABA 2-(4淘選基本與8-10頁的程序相同，只是用鏈霉親和素100 g/ml鏈霉親和素溶于0.1 M NaHCO3 (pH 8.6)中而不是用靶蛋白分子包被板。封阻液應(yīng)含有0.1 g/ml的鏈霉親和素以結(jié)合BSA封阻液中含有的生物素。并用下述步驟代替淘選試驗(yàn)中的步驟7。 7a. 封阻板時(shí)（步驟5），預(yù)先將噬菌體與生物素化靶蛋白分子結(jié)合。即：在微量離心管中混合0.1 g生物素化靶蛋白（對25 kDa蛋白來說 10 nM終濃度）和1.51011 pfu的投入噬菌體（原始文庫10 l的量）于400 l TBS中, 室溫作用10-60 min。為了保證靶蛋白的穩(wěn)定性，也可使用相同離子強(qiáng)度的其他

34、緩沖液（含金屬離子等）。 7b. 將噬菌體-靶蛋白溶液加入到已清洗過的封阻板中，室溫溫育10 min。 7c. 加入生物素至終濃度0.1 mM繼續(xù)溫育5 min，這一步驟將直接結(jié)合在鏈霉親和素上的噬菌體（即那些展示有HPQ序列的噬菌體）從板上置換下來。而生物素化靶蛋白從鏈霉親和素上解離的速度是非常慢的，所以該濃度的生物素不會將生物素化靶蛋白置換下來。繼續(xù)第8頁第8步。 其他測定抗原表位的方法 (用Protein A/G捕獲法進(jìn)行液相結(jié)合) 除了在固定于表面的抗體上進(jìn)行淘選試驗(yàn)外，還可以先讓文庫與抗體在液相中反應(yīng)，然后用Protein A和/或Protein G-瓊脂糖珠對抗體-噬菌體復(fù)合物進(jìn)行

35、親和捕獲。這種液相淘選每個(gè)試驗(yàn)所需的抗體量遠(yuǎn)少于表面淘選試驗(yàn)，而且噬菌體展示肽更容易接近抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)，也避免了抗體在塑料板表面的部分變性現(xiàn)象。用Protein A-瓊脂糖和Protein G -瓊脂糖交替淘選可以避免偶爾選擇到特異性結(jié)合到Protein A或Protein G上的肽序列的可能性。不能與Protein A很好結(jié)合的抗體（如：綿羊、山羊、雞和大鼠多克隆抗體，以及人IgG3和小鼠IgG1單克隆抗體），可以在所有淘選實(shí)驗(yàn)中選用Protein G-瓊脂糖。 本方法簡便易行，只要有合適的捕獲融合蛋白的親和介質(zhì)，就可以用任何與親和tag融合的靶蛋白對多肽文庫進(jìn)行淘選。 1. 接種ER

36、2738 (可用滴度測定時(shí)鋪板的菌)于10 ml LB液體培養(yǎng)基中, 如果同一天還要擴(kuò)增洗脫下來的噬菌體，就同時(shí)接種ER2738于20 ml LB液體培養(yǎng)基中（用250 ml的三角瓶培養(yǎng)，不要用50 ml的培養(yǎng)管）。372. 吸取50 l Protein A-瓊脂糖介質(zhì)（50%的水懸液）于微量離心管中，加1 ml TBS+0.1% Tween (TBST)溶液。輕彈管壁或溫和震蕩重懸介質(zhì)。對于山羊、雞、綿羊和大鼠多克隆抗體，以及人IgG3亞類單克隆抗體，每輪淘選中的這一步均用Protein-G。如果結(jié)合及清洗緩沖液(TBS)的pH可達(dá)8.6，小鼠IgG1亞類單克隆抗體也可使用Protein A

37、。 3. 用臺式微量離心機(jī)（CapsulefugeTM或其他）低速離心30 sec沉淀介質(zhì)，小心吸去上清，注意不要使介質(zhì)懸起。 4. 介質(zhì)重懸于1 ml封阻緩沖液中，45. 作用其間，用TBS緩沖液將1.51011個(gè)噬菌體粒子（相當(dāng)于10 l原始文庫）和300 ng抗體稀釋至終體積200 l，抗體終濃度為10 nM。室溫作用20 min。 6. 封阻反應(yīng)后，按步驟3沉淀介質(zhì)，并用1 ml TBS洗4次，每次均需沉淀介質(zhì)。 7. 將噬菌體-抗體混合物加入洗過的介質(zhì)中，溫和混勻，室溫作用15 min并不時(shí)混勻。 8. 按步驟3沉淀介質(zhì)，棄上清，用1 ml TBTS洗10次。 9. 重懸沉淀介質(zhì)于1

38、 ml 0.2 M的Glycine-HCl (pH 2.2), 1 mg/ml BSA中, 洗脫結(jié)合的噬菌體，室溫作用10 min。 10. 用臺式微量離心機(jī)離心洗脫混合液1 min，小心將上清轉(zhuǎn)入一新鮮微量離心管中，注意不要吸起沉淀的介質(zhì)。 11. 立即用150 l 1 M Tris-HCl, pH 9.1中和洗脫液。 12. 在LB/IPTG/Xgal平板上測定一小量洗脫液的滴度。方法按常規(guī)M13方法中所述，6-7頁。 13. 剩余洗脫液應(yīng)被擴(kuò)增：加洗脫液到20 ml ER2738培養(yǎng)物（此時(shí)應(yīng)處于對數(shù)早期）中，37劇烈搖動培養(yǎng)4.5 hrs。（或者，洗脫物4貯存過夜，第二天擴(kuò)增。這樣的話

39、，應(yīng)做ER2738在LB-Tet中的過夜培養(yǎng)，第二天，按1:100的比例稀釋于20 ml LB中，同時(shí)加入未擴(kuò)增洗脫液，250 ml三角瓶14. 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，415. 80%的上清轉(zhuǎn)入另一新鮮離心管，加1/6體積的20% PEG, 2.5 M NaCl。使噬菌體416. 417. 沉淀重懸于1 ml TBS中，懸液轉(zhuǎn)入一微量離心管，418. 上清轉(zhuǎn)入一新鮮微量離心管，再用1/6體積的PEG/NaCl重新沉淀。冰上作用15-60 min。 419. 沉淀重懸于200 l TBS, 0.02% NaN3中。離心1 min沉淀任何不溶性物質(zhì)。上清轉(zhuǎn)入一新鮮管中。此即為擴(kuò)增的洗脫液。 20.

40、按常規(guī)M13方法（6-7頁）中所述，在LB/IPTG/Xgal平板上測定擴(kuò)增洗脫液的滴度。421. 第二天，計(jì)數(shù)板上藍(lán)斑數(shù)目確定噬菌體滴度。并用這個(gè)值計(jì)算對應(yīng)于1-21011 pfu的輸入噬菌體體積。如果滴度太低，可以用低至109 pfu的輸入噬菌體量再進(jìn)行幾輪淘選。 22. 進(jìn)行第二輪淘選試驗(yàn)：用第一輪擴(kuò)增洗脫物中相應(yīng)于1-21011 pfu的量作為輸入噬菌體量重復(fù)步驟1-21。用Protien G-瓊脂糖而不是Protein A-瓊脂糖，并將結(jié)合和清洗緩沖液中Tween的濃度提高至0.5%（v/v）。 23. 進(jìn)行第三輪淘選試驗(yàn)：用第二輪擴(kuò)增洗脫物中相應(yīng)于1-21011 pfu的量作為輸入

41、噬菌體量重復(fù)步驟1-21。如果第一輪用的是Protein A-瓊脂糖，那么這一輪還用Protein A-瓊脂糖，保持結(jié)合和清洗緩沖液中Tween的濃度仍為0.5%（v/v）。預(yù)算好滴度測定步驟地時(shí)間，使LB/IPTG/Xgal板培養(yǎng)時(shí)間不超過18 hrs，因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間過長可能會產(chǎn)生缺失。 24. 挑選10個(gè)或更多的噬菌斑擴(kuò)增噬菌體，并按12-13頁所述方法制備DNA測序模板。 25. 如果第三輪測序的克隆中沒有明顯的共有序列，則擴(kuò)增第三輪的剩余洗脫物（步驟13-21），附錄優(yōu)化肽結(jié)合相互作用有幾個(gè)變量會影響淘選過程中的選擇嚴(yán)格程度。根據(jù)所研究的相互作用的不同，調(diào)整選擇或洗脫的強(qiáng)度對獲得結(jié)合肽共有序列是必需的。1.去污劑：在結(jié)合或清洗Buffer中添加去污劑（通常是Tween-20）能降低噬菌體與靶分子和/或封阻試劑BSA之間的非特異性相互作用。最初幾輪淘選中用較低濃度的Tween會增加洗脫物滴度，然后每輪逐漸增加Tween濃度（最大可到0.5%）來逐步提高選擇的嚴(yán)格性。然而，在同步實(shí)驗(yàn)中，我們用0.5%恒定Tween濃度和逐步增加的Twe