實時熒光定量PCR技術(shù)原理及其儀器分析課件

1、 實時熒光定量PCR技術(shù)原理及其儀器分析PCR1983年 Cetus公司的Kary Mullis于12月16日第一次成功實驗發(fā)明了PCR，并于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎1995年 Perkin Elmer 公司研制出熒光定量PCR技術(shù)九十年代中期 PCR臨床應(yīng)用在國內(nèi)全面展開1998年 熒光定量PCR技術(shù)開始在中國應(yīng)用于臨床檢測PCR之父Mullis 循環(huán)次數(shù) DNA的鏈數(shù) 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10億 PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系PCR特點：高效擴(kuò)增、忠實復(fù)制實時熒光定量

2、PCR 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 非特異性熒光標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon SYBR Green SYBR Green 法工作機(jī)理 SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光 復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。SYBR Green 起始模板的測定基因型的分析融解曲線分析：可以優(yōu)化PC

3、R反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。 對DNA模板沒有選擇性 -適用于任何DNA 使用方便 -不必設(shè)計復(fù)雜探針 非常靈敏 便宜優(yōu) 點 容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件 對引物特異性要求較高缺 點每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光 對目標(biāo)序列的高特異性 -陰性結(jié)果確定 設(shè)計相對簡單 -與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好優(yōu) 點 只適合一個特定的目標(biāo) 委托公司標(biāo)記，價格較高 不易找到本底低的探針缺 點分子信標(biāo)法標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標(biāo)序列

4、互補(bǔ)莖由互補(bǔ)配對序列組成環(huán)莖熒光素 淬滅劑發(fā)夾型雜交探針應(yīng)用范圍 起始模板的定量 基因型分析 產(chǎn)物鑒定 SNP（單核苷酸多態(tài)性）分析高特異性：對目標(biāo)序列 檢測SNP最靈敏的試劑之一熒光背景低優(yōu) 點 只能用于一個特定目標(biāo) 設(shè)計困難 價格比較高缺 點熒光PRC的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)熱模塊系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)熒光檢測系統(tǒng)分析系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)熒光檢測系統(tǒng)CCDPMT，光電二極管，掃描機(jī)制PMT，光電二極管，旋轉(zhuǎn)機(jī)制使用方法使用注意事項1. 按照正確的開關(guān)機(jī)順序操作2. 應(yīng)該定期備份的實驗數(shù)據(jù)3. 良好的實驗室環(huán)境常見問題判斷樣本加熱塊是否被污染 不正常的高信號 污染 某個孔的信號明顯高出其他孔 污染清除樣本加熱塊污染 乙醇去

5、離子水蒸發(fā)熒光定量PCR的定量分析是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的每個標(biāo)本的Ct值進(jìn)行的。在獲得各個標(biāo)本的PCR擴(kuò)增曲線后，計算機(jī)軟件自動確定用于定量分析的Ct值。Q-PCR分析采用已知物的標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量未知目的物。 標(biāo)準(zhǔn)曲線定量拷貝數(shù)=DNA摩爾質(zhì)量DNA質(zhì)量（g）x 6.02 x 1023_相對定量分析用目的基因與對照基因進(jìn)行樣品間的比較。通過從目的基因的Ct減去對照基因Ct獲得相對于對照基因的定量，循環(huán)數(shù)差別是基數(shù)2的指數(shù)，表示這兩個基因的模板倍數(shù)差別。PCR效率（E）=10 -1(-1/S)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作已知基因DNA質(zhì)粒載體 RNA樣品PCRRNA樣品濃度克隆DNAase光密度儀縱坐標(biāo)：Ct 橫坐標(biāo)：lgRNA模板數(shù)RNA拷貝數(shù)熒光PCR的局限性在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中，由于無一統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各實驗室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品不相同，使實驗結(jié)果缺乏可比性。在相對定量中，其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物不受實驗條件的影響的，合理地選擇合適的不受實驗條件影響的內(nèi)源控制物是實驗結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵。與傳統(tǒng)PCR相比的不足之處（1）由于運用了封閉的檢測，減少了擴(kuò)增后電泳的檢測步驟，因此不能監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的大??；（2）熒光素種類以及檢測光源的局限性，從而相對地限制