乳鐵蛋白分離和純化

1、關(guān)于乳鐵蛋白的分離與純化第1頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四乳鐵蛋白的價(jià)值乳鐵蛋白具有多種生物學(xué)功能,能提高腸道細(xì)胞對(duì)鐵離子的吸收，具有抗菌，抗病毒，抗氧化，抗癌，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等多種功能，并己廣泛應(yīng)用于食品，畜牧等行業(yè)。LF 可耐受較高溫 度,使之在 飼料加工過程中不易變性失活，它促進(jìn)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收,可以治療仔豬貧血。它具有廣譜的抗菌，抗 病毒作用,可用來預(yù) 防和 治療仔 豬 腹瀉:它 具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活性的作用，增強(qiáng)家畜對(duì) 疾病的抵抗力，它具有抗真菌和抗脂質(zhì)氧化作用,可用作防霉劑和抗 氧化劑。第2頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四乳鐵蛋白

2、LF ,是存在于哺乳動(dòng)物外分泌液中的一種鐵離子結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)鐵蛋 白相似，但鐵結(jié)合能力是轉(zhuǎn)鐵蛋白的 260 倍，LF是由689個(gè)氨基酸組成的單一多鏈分子。 每個(gè)分子中有2個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)可結(jié)合一個(gè)Fe3+和一個(gè)HCO3-或CO3。Lf 的鐵結(jié)合能力與鹽的種類和濃度有關(guān)，在有較高濃度碳酸鹽的場合，其鐵結(jié)合能力增強(qiáng)，而在有較高濃度檸檬酸鹽的情況下，其鐵結(jié)合能力則減弱。第3頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四自 1960年以來人們就試著采用各種方法來制備LF如離子交換層析色譜,超濾,固定化單克隆抗體,親和層析等從人乳或牛乳中分離純化 LF，但色譜法和固定化單克隆抗體法

3、雖能獲得較高純度的 LF但價(jià)格昂貴技術(shù)要求高,所以并不適用于工業(yè)化生產(chǎn).超濾法簡便費(fèi)用低,易形成 工業(yè)化生產(chǎn)，但 LF 純度低膜需要經(jīng)常清洗。第4頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四色譜法 吸附色譜法是利用固定基質(zhì)和吸附質(zhì)間物理或化學(xué)吸附強(qiáng)度的不同來分離物質(zhì)的。疏水性的相互作用色譜在乳鐵蛋白的分離上有重要的應(yīng)用。一般以Toyopearl為基質(zhì),在(NH4)2SO4溶液中達(dá)到吸附平衡后再裝柱,用去離子水0.25mol/L HAc和0.25mol/L NaOH洗脫,得純度為80%的乳鐵蛋白,其缺點(diǎn)是吸附容量比較小,效率比較低.第5頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)5

4、5分，星期四離子吸附法1 最早利用DEAE纖維素陰離子交換樹脂分離純化得到較純的Lf.2 磷酸纖維素交換色譜法羧甲基陽離子交換色譜法被廣泛應(yīng)用于Lf和乳過氧化氫酶的分離純化,用pH值7.7,濃度0.05mol/L的磷酸鈉溶液或濃度0.3mol/LNaCl溶液作為洗脫液來洗脫,它可將Lf的a,b兩種變異體分離出來,而且樹脂能用濃度0.2mol/L的NaOH溶液和濃度0.2mol/L的HCI溶液再生,此法相對(duì)來說要更有效第6頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四親合色譜法不容基質(zhì)-連接物-隔離臂-連接物-配體，基質(zhì)一般用瓊脂多糖,隔離臂一般多是有一定長度的可以連接基質(zhì)的有機(jī)物例

5、如，肝素瓊脂糖親合色譜能從瓊脂乳中一步分離來得到乳鐵蛋白,并且經(jīng)電泳分析表明其純度極高。第7頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四例如，換Cu2+的1,4一丁二醇二環(huán)氧甘油醚亞氨二乙酸瓊脂糖,用Cu2+交換后該樹脂呈藍(lán)色,裝柱時(shí)上面1/2或2/3是銅樹脂下半部分未直接交換的Cu2+樹脂,洗脫液為用pH值8.0-2.8濃度0.05mol/L的Tris-HAC溶液或濃度0.5mol/L的NaCI溶液作為洗脫液，一般來說,25mL的樹脂可以吸附1L干酪乳清的Lf和免疫球蛋白,并且產(chǎn)品的純度極高。第8頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四固定化單克隆抗體法利用抗

6、原-抗體之間的高特異性結(jié)合在68周的鼠腹中注入人或牛的乳鐵蛋白進(jìn)行免疫,經(jīng)一系列操作分離出抗體,用抗體和異丙醇活化的親合凝膠混合制得免疫親合色譜。用脫脂牛初乳或常乳作為料液, 用洗脫0.2 mol/L pH2.7醋酸緩沖液(含0.1 5mol/L NaCl)洗脫。 成本貴第9頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四超濾法是一種基本的膜分離技術(shù)，其原理是根據(jù)膜孔徑不同可以實(shí)現(xiàn)不同分子質(zhì)量和分子形狀的大分子物質(zhì)的分離，非常適合熱敏性的功能性組分的分離。選用孔徑或截留分子量不同的一系列超濾膜，可以以干酪乳清為原料生產(chǎn) Lf基料。第10頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55

7、分，星期四鹽析法 和層析法從牛初乳中分離純化乳鐵蛋白并利用電泳和分光光度法檢測其純度和含量所獲得的乳鐵蛋白的分子質(zhì)量為90000u,純度大約為92%。采用3次鹽析和1次凝膠層析的方法。第11頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四試驗(yàn)方 法乳樣前期處理：乳樣在鹽析和凝膠層析之前要進(jìn)行前期處理,即除去脂 肪和大量的酪蛋白,物料的前期處理方法基本相同采用新鮮牛初乳通過離心脫去脂肪(4，3000r/min、30min)得到脫脂乳， 將脫脂乳稀釋后， 邊攪拌邊向其中加入 1mol/L 鹽酸溶液調(diào)整脫脂乳的 pH 值到 4.6(酪蛋白的等電點(diǎn))，室溫放置 30min，離心除去酪蛋白(4

8、、10000r/min、30min)，得到的上清就是我們需要的乳清，用它來分離 Lf第12頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四鹽析：選用硫酸胺沉淀以除去分子量比較小的蛋白，將乳清用30%的飽和硫酸銨沉淀 30min后，4條件4000r/min離40min;將得到的上清液再用50%的飽和硫酸銨沉30min后,4條件下4000r/min離心40min，除去免疫球蛋白沉淀，將得到的上清液用85%的飽和硫酸銨沉淀30min。 此時(shí)需在PH8.5的情況下，44000r/min,離心40min。此時(shí)收集沉淀，并用蒸餾水溶解。第13頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星

9、期四凝膠層析：為了獲得較高純度的LF，選用 sephadex-G-100 對(duì)LF進(jìn)行分離和純化。將透析后的乳清1mL加入平衡過的凝膠層析柱，在20條件下以0.2mL/min的流速 進(jìn)行洗脫，洗脫液選用pH7.4的PBs（Nacl含量 8g/1000mL)，待出現(xiàn)峰值后收集洗脫液，每管收集lmL。第14頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四LF 的鑒 定采用非連續(xù)性SDS電泳對(duì)脫脂乳和鹽析分離得到的上清液，以及凝膠層析的洗脫產(chǎn)物進(jìn)行檢測。采用分光光度法對(duì)凝膠層析所得到的乳鐵蛋白的濃度進(jìn)行測定。第15頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四結(jié)果與分析由于LF的

10、pH為7.0-8.0,所以本試驗(yàn)?zāi)z層析選用的洗脫液為pH7.4的PBS，在這個(gè)pH范圍內(nèi)均可以得到LF。由圖1可知峰l顯示樣品的吸收峰峰值較小，說明LF含量較低，但是非LF成分含量卻很低,可以忽略,樣品純度比較高經(jīng)SDS電泳檢測僅出現(xiàn)一條可見的區(qū)帶,相對(duì)分子質(zhì)量為9000u,對(duì)電泳凝膠進(jìn)行掃描和計(jì)算機(jī)分析LF的純度達(dá) 到92%,LF峰2和峰3顯示樣品的吸收峰峰值較大,說明LF含量較高,但是樣品不純,含有其他成分,經(jīng)SDS電泳檢測結(jié)果為峰2樣品中含有兩種成分,峰3樣品中含有三種成分。峰IV則說明樣品的各個(gè)成分含量都很低,經(jīng)SDS電泳檢測可見條帶非常不清晰.第16頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四分光光度法采用分光光度法測定LF濃度,首先利用純度為92%的LF溶液在400-650nm下掃描，發(fā)現(xiàn)在475nm波長產(chǎn)生特征吸 收峰(見圖3)于475nm測定其吸光度,作出濃度C與吸光度A之間關(guān)系的線性回歸方程,如圖四,得方程為:c=827.49A+5.7315(R2=0.9954)。第17頁，共19頁，2022年，5月20日，17點(diǎn)55分，星期四圖4顯示A475值未能達(dá)到一般分光光度法的線性范圍(0.1-