粒徑和表面電荷測定

1、聚乙烯亞胺-DNA復(fù)合物粒徑和表面電荷的測定實驗導(dǎo)讀在聚乙烯亞胺作為基因藥物載體的研究中，PEI-DNA復(fù)合物的粒徑在生物相容性和細(xì) 胞轉(zhuǎn)染中起著重要作用。帶電荷的結(jié)合物隨孵育時間的延長，會發(fā)生復(fù)合物的聚集和沉淀， 同時復(fù)合物的表面電荷大小和介質(zhì)的離子強(qiáng)度也直接影響著聚集程度。通常認(rèn)為PEI-DNA 結(jié)合物在低N/P比時所形成的聚集，主要是因為結(jié)合物間范德華力的作用，相反高N/P比 時，聚集程度降低，是因為結(jié)合物表面較高電荷所產(chǎn)生的靜電作用，發(fā)生靜電排斥，使其在 生理條件下比較穩(wěn)定。介質(zhì)的離子強(qiáng)度與聚集程度密切相關(guān)。在所用的介質(zhì)中，有低離子強(qiáng) 度的雙蒸水，5%葡萄糖溶液，中高離子強(qiáng)度的生理鹽水

2、、磷酸緩沖溶液等。在10mmol/l的 氯化鈉溶液中，60分鐘后結(jié)合物的粒徑可達(dá)500nm，在150mmol/l的氯化鈉溶液中，放置 30分鐘后，其粒徑可能大于900nm，而在0.5XPBS緩沖溶液中，PEI-DNA結(jié)合物具有穩(wěn) 定的粒子大小，可在3小時內(nèi)保持在120-400nm左右。下圖是用透射電鏡測定復(fù)合物的粒 徑。圖1聚乙烯亞胺-DNA復(fù)合物的透射電鏡照片一、實驗?zāi)康牧私饩坳栯x子載體與質(zhì)粒DNA復(fù)合物的結(jié)合過程，掌握納米復(fù)合物的制備。掌握納米復(fù)合物粒徑和表面電荷的測定方法。二、實驗原理非病毒性納米轉(zhuǎn)基因載體與質(zhì)粒DNA復(fù)合物的粒徑大小直接關(guān)系和影響著體外細(xì)胞和 體內(nèi)動物的基因轉(zhuǎn)染效率。因

3、此，對載體/DNA粒徑尺寸的控制在研究中有著重要的意義， 同時也需要用準(zhǔn)確的實驗方法測定和監(jiān)控實驗過程中納米載體/DNA復(fù)合物納米微粒的形 成、聚集過程，納米微粒的外觀形態(tài)等，為基因轉(zhuǎn)染效率的提高提供科學(xué)的依據(jù)。測定納米 粒子粒徑的方法較多，而納米動態(tài)光散射式粒徑分布儀是較為常用和方便的測定方法。納米動態(tài)光散射式粒徑分布儀在納米微粒測定時，采用動態(tài)光散色原理。在光學(xué)測量系 統(tǒng)中，光源為650納米半導(dǎo)體鐳射光，檢測器為光電倍增管，能測定的納米微粒粒徑范圍是 1-6000納米。下圖是LB-550型納米動態(tài)光散射式粒徑分布儀。圖2 LB-550型納米動態(tài)光散射式粒徑分布儀三、儀器與試劑1 儀器：90

4、Plus/BI-MAS （Brookhaven Instruments Corporation）粒徑儀。2試劑：聚乙烯亞胺，質(zhì)粒DNA pCAG。四、實驗步驟（注：以下均為無菌操作）1）聚乙烯亞胺載體材料溶液的配制稱取PEI25 kDa 90 mg，將其溶于20 ml水中得到母液，其含N濃度為100nmol/pL。取30 pl 該母液稀釋至0.5mL得到含N濃度為6 nmol/pl的PEI溶液。取DNA溶液，稀釋使其含P的濃度為1pg/pl，即3 noml/pl。2）配制不同N/P比的PEI/DNA復(fù)合物取PEI溶液30pl （即含N摩爾量為180nmol），加水270pl，配成300pl的P

5、EI溶液；取DNA母液30pl （即含P摩爾量為90nmol），加水270pl，配成300pl的DNA溶液；然后將上述的PEI溶液和DNA溶液渦旋混勻，得到N/P比為2:1的溶液，室溫下靜置30min，加生理鹽水至總體積到5ml,加在比色皿中，然后用90Plus/BI-MAS （Brookhaven InstrumentsCorporation）測定顆粒的粒徑。3）通過調(diào)整二者的加樣體積（其中DNA的用量都是30艇），可以得到N/P比為5:1，8:1，10:1，15:1，20:1的PEI/DNA復(fù)合物。加樣體積如下表：PEI與DNA的N/P比加PEI溶液體積（含N摩爾量）加水的體積加DNA溶液

6、體積（含P摩爾量）加水的體積2:130gl (180nmol)270gl30gl (90nmol)270gl5:175gl (450nmol)225 gl30gl (90nmol)270gl8:1120gl (720nmol)180gl30gl (90nmol)270gl10:1150gl (900nmol)150gl30gl (90nmol)270gl15:1225gl (1350nmol)75 gl30gl (90nmol)270gl20:1300gl (1800nmol)0gl30gl (90nmol)270gl4.作圖。以N/P比值為橫坐標(biāo)，以粒徑大小為縱坐標(biāo)做圖。分析不同N/P對粒徑

7、大小的影響。五、數(shù)據(jù)處理1記錄儀器上的粒徑測定值，設(shè)置測定次數(shù)為5次，將所測定的數(shù)值進(jìn)行篩選，平均值的誤 差進(jìn)算。2對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。以N/P比值為橫坐標(biāo)，以粒徑大小為縱坐標(biāo)做圖。分析不同N/P對粒 徑大小的影響。下圖是聚陽離子載體材料/DNA復(fù)合物的粒徑分布圖圖3圖3聚陽離子載體材料/DNA復(fù)合物的粒徑分布圖示意圖ooooooooooo 0864208642 nz 11 1 1 1 1六、注意事項1聚乙烯亞胺與質(zhì)粒DNA配置時要緩慢混合，如果滴加速度過快會造成局部過濃現(xiàn)象而出 現(xiàn)沉淀。2在配置完畢后，要注意時間的控制，放置30分鐘后要立即測定，時間過長會出現(xiàn)聚集。七、思考題 在PEI溶液與DN

8、A溶液在混勻過程中，為什么要靜置30min？時間過長或過短有什么影 響？常見的測量微粒粒徑的方法有哪些？并簡要闡述這幾種方法各自的優(yōu)缺點(diǎn)。概述儀器90Plus/BI-MAS除測定微粒的粒徑外，還能在哪些方面進(jìn)行應(yīng)用？八、參考文獻(xiàn)1.Michael Neu,Dagmar Fischer and Thomas KisselRecent advances in rational gene transfer vector design based on Poly(ethleneimine) and its derivatives. The Journol of Gene Medicine. 2005;7:992-10092 .JiYoung M.Dang, KamW.Leong. Natural polymers for gene delivery and tissue engineering Advanced Drug Delivery. 2006;58:487-4993.Tae Gw