核酸及其多糖的提取課件

1、核酸及其多糖的提取 核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作 。 第一部分：DNA提取方法簡介 第二部分：DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 第三部分：RNA提取方法簡介 第四部分：RNA提取及其常見問題、原因分析及其對策DNA提取的基本步驟 I.材料準備 II.破碎細胞或包膜內容物釋放 III.核酸分離、純化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質 V.核酸溶解在適量緩沖液或水中基因組DNA提?。翰牧蠝蕚渥詈檬褂眯迈r材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細

2、胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它基因組DNA CTAB法 CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。 該復合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇 終

3、濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入 Tris-HCl （pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性； NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解細胞膜，并結合核酸，使核酸便于分離； -巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。CTAB法流程圖 植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液SDS法DNA提取緩沖液組份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS終濃度 10

4、 mM 20 mM 0.4M 2%SDS法流程圖 （以動物組織為例）動物組織細胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液 非基因組DNA的提取 質粒DNA的提取 堿裂解法 煮沸法線粒體、葉綠體 DNA的提取差速離心結合SDS裂解法質粒DNA的提取：材料準備使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質粒增加）培養(yǎng)時應加入篩選壓力，否則菌體易污染，質粒易丟失盡量選擇高拷貝的質粒，如為低拷貝或大質粒，則應加大菌體用量菌株不要頻繁轉接（質粒丟失）質粒DNA的提?。杭毎呀饩w量適當培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質粒易被打斷復性時間也不

5、宜過長，否則會有基因組DNA的污染G菌、酵母質粒的提取，應先用酶法或機械法處理，以破壁質粒DNA提取堿裂解法煮沸法質粒DNA提取堿裂解法 堿裂解法原理 染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子； 當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質粒DNA煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉

6、合環(huán)狀分子；當加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質粒DNA在冷卻時即恢復其天然構象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞碎片結合形成沉淀，而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。差速離心法原理是利用物質比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質置于均勻介質（蔗糖）中，以一定的轉速進行離心，比重大的物質優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。核酸分離純化 吸附材料結合法： 硅質材料 高鹽低pH值結合核酸，低鹽高pH值 洗脫?？旖?高效。 陰離子交換樹脂 低鹽高pH值結合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用 于純度要求高的實驗 磁

7、珠 磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從 而達到分離目的 核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應提供相應的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法核酸分離、純化 蛋白質的去除： 酚/氯仿抽提 使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌 蛋白酶處理核酸分離、純化：多糖去除高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。

8、用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。多酚的去除 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結合 鹽離子的去除：70的乙醇洗滌 核酸沉淀、溶解當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長期

9、儲存建議使用TE緩沖液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解RNA提取的通用方法 異硫氰酸胍/苯酚法 原理： 1.細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放； 2.釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離； 3.有機溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。 步驟：材料準備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使細胞及核蛋白復合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除

10、雜物。洗滌：70乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNARNA提取常見問題 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 電泳帶型異常 下游實驗效果不佳RNA降解 新鮮細胞或組織： 裂解液的質量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 組織裂解不充分 另外某些富含內源酶的樣品 (如脾臟，胸腺等)，很難避免 RNA 的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液。 冷凍樣品： 樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70冰箱保存。樣品要相對小一點； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與

11、裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預冷，碾磨過程中及時補充液氮。多糖的提取 多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通過糖苷鍵連接在一起的聚合物，它是生物體除蛋白質和核酸以外的又一類重要的信息分子。 種類繁多的植物多糖，存在于植物中的部位不盡相同。而且， 一般植物細胞壁比較牢固，在提取前需進行專門的破細胞操作。植物多糖提取的研究中采用了許多不同的方法，包括溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶解法、超濾法、超聲波強化法、微波法。1溶劑提取法 溶劑提取法首先要考慮的因素是選擇溶劑，一般都應遵循相似相溶的原則，即極性強的有效成分選擇極性強的溶劑，極性弱的有效成分選擇極性弱的溶劑。多糖是極性大分子化合物應選

12、擇水、醇等極性強的溶劑。一般植物多糖提取多數(shù)采用熱水浸提法，該法所得多糖提取液可直接或離心除去不溶物；或利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質， 用高濃度乙醇沉淀提純多糖。2酸提法 有些多糖適合用稀酸提取, 并且能得到更 高的提取率。 孟憲元等在茜草多糖提取研究中, 發(fā)現(xiàn)相對于水提, 以稀酸提取茜草多糖, 產(chǎn)品純度較高。 具體方法如下: 茜草根粗粉1000g，5%HC1浸泡， 離心， 取上清液加入EtOH并調節(jié)至濃度為70% ，靜置， 2500 rpm 離心，收集棕色沉淀物，95% EtOH 洗滌3 次，以4% HCl 溶解加1%活性炭脫色， 真空抽濾，濾液4過夜，棄去容器底部少許沉淀物，溶液置透析袋

13、內， 逆水法透析3日，冷凍干燥， 得白色粉末約10g (多糖A) 。3堿提法 采用稀堿提取: 多為0.1 1M 氫氧化鈉、氫氧化鉀，為防止多糖降解，常通以氮氣或加硼氫化鈉或硼氫化鉀。 堿提優(yōu)勢也是因多糖類的不同而異。與酸提類似, 堿提中堿的濃度也應得到有效控制,因為有些多糖在堿性較強時會水解。 4酶提法在多糖的提取過程中, 使用酶可降低提取條件,在比較溫和的條件中分解植物組織, 加速多糖的釋放或提取。此外,使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質等非目的物, 常用的酶有蛋白酶, 纖維素酶, 果膠酶等。周峙苗得到酶解法提取羊棲菜多糖的最佳實驗參數(shù)為：加纖維素酶量為8% (酶/藻粉) ，果膠酶量為4% (酶/藻粉) ，pH3.4，酶解時間3h， 酶解溫度為50。5超濾法超濾是一種膜分離技術，所采用的超濾膜能夠從水和其