核酸及其多糖的提取課件

1、核酸及其多糖的提取 核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學(xué)研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作 。 第一部分：DNA提取方法簡介 第二部分：DNA提取常見問題、 原因分析及其對策 第三部分：RNA提取方法簡介 第四部分：RNA提取及其常見問題、原因分析及其對策DNA提取的基本步驟 I.材料準(zhǔn)備 II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放 III.核酸分離、純化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì) V.核酸溶解在適量緩沖液或水中基因組DNA提?。翰牧蠝?zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)

2、胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它基因組DNA CTAB法 CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。 該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇 終

3、濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入 Tris-HCl （pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性； NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； -巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。CTAB法流程圖 植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液SDS法DNA提取緩沖液組份Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS終濃度 10

4、 mM 20 mM 0.4M 2%SDS法流程圖 （以動(dòng)物組織為例）動(dòng)物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液 非基因組DNA的提取 質(zhì)粒DNA的提取 堿裂解法 煮沸法線粒體、葉綠體 DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法質(zhì)粒DNA的提?。翰牧蠝?zhǔn)備使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）質(zhì)粒DNA的提取：細(xì)胞裂解菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時(shí)間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時(shí)間也不

5、宜過長，否則會有基因組DNA的污染G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁質(zhì)粒DNA提取堿裂解法煮沸法質(zhì)粒DNA提取堿裂解法 堿裂解法原理 染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA煮沸法煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉

6、合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。核酸分離純化 吸附材料結(jié)合法： 硅質(zhì)材料 高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值 洗脫?？旖?高效。 陰離子交換樹脂 低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用 于純度要求高的實(shí)驗(yàn) 磁

7、珠 磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從 而達(dá)到分離目的 核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法核酸分離、純化 蛋白質(zhì)的去除： 酚/氯仿抽提 使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌 蛋白酶處理核酸分離、純化：多糖去除高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。

8、用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。多酚的去除 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合 鹽離子的去除：70的乙醇洗滌 核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長期

9、儲存建議使用TE緩沖液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase pH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解RNA提取的通用方法 異硫氰酸胍/苯酚法 原理： 1.細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放； 2.釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離； 3.有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。 步驟：材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除

10、雜物。洗滌：70乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNARNA提取常見問題 RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 電泳帶型異常 下游實(shí)驗(yàn)效果不佳RNA降解 新鮮細(xì)胞或組織： 裂解液的質(zhì)量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 組織裂解不充分 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟，胸腺等)，很難避免 RNA 的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。 冷凍樣品： 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70冰箱保存。樣品要相對小一點(diǎn)； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與

11、裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。多糖的提取 多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通過糖苷鍵連接在一起的聚合物，它是生物體除蛋白質(zhì)和核酸以外的又一類重要的信息分子。 種類繁多的植物多糖，存在于植物中的部位不盡相同。而且， 一般植物細(xì)胞壁比較牢固，在提取前需進(jìn)行專門的破細(xì)胞操作。植物多糖提取的研究中采用了許多不同的方法，包括溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶解法、超濾法、超聲波強(qiáng)化法、微波法。1溶劑提取法 溶劑提取法首先要考慮的因素是選擇溶劑，一般都應(yīng)遵循相似相溶的原則，即極性強(qiáng)的有效成分選擇極性強(qiáng)的溶劑，極性弱的有效成分選擇極性弱的溶劑。多糖是極性大分子化合物應(yīng)選

12、擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑。一般植物多糖提取多數(shù)采用熱水浸提法，該法所得多糖提取液可直接或離心除去不溶物；或利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)， 用高濃度乙醇沉淀提純多糖。2酸提法 有些多糖適合用稀酸提取, 并且能得到更 高的提取率。 孟憲元等在茜草多糖提取研究中, 發(fā)現(xiàn)相對于水提, 以稀酸提取茜草多糖, 產(chǎn)品純度較高。 具體方法如下: 茜草根粗粉1000g，5%HC1浸泡， 離心， 取上清液加入EtOH并調(diào)節(jié)至濃度為70% ，靜置， 2500 rpm 離心，收集棕色沉淀物，95% EtOH 洗滌3 次，以4% HCl 溶解加1%活性炭脫色， 真空抽濾，濾液4過夜，棄去容器底部少許沉淀物，溶液置透析袋

13、內(nèi)， 逆水法透析3日，冷凍干燥， 得白色粉末約10g (多糖A) 。3堿提法 采用稀堿提取: 多為0.1 1M 氫氧化鈉、氫氧化鉀，為防止多糖降解，常通以氮?dú)饣蚣优饸浠c或硼氫化鉀。 堿提優(yōu)勢也是因多糖類的不同而異。與酸提類似, 堿提中堿的濃度也應(yīng)得到有效控制,因?yàn)橛行┒嗵窃趬A性較強(qiáng)時(shí)會水解。 4酶提法在多糖的提取過程中, 使用酶可降低提取條件,在比較溫和的條件中分解植物組織, 加速多糖的釋放或提取。此外,使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等非目的物, 常用的酶有蛋白酶, 纖維素酶, 果膠酶等。周峙苗得到酶解法提取羊棲菜多糖的最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：加纖維素酶量為8% (酶/藻粉) ，果膠酶量為4% (酶/藻粉) ，pH3.4，酶解時(shí)間3h， 酶解溫度為50。5超濾法超濾是一種膜分離技術(shù)，所采用的超濾膜能夠從水和其