白蘚組織培養(yǎng)及無性系建立的研究

1、白蘚組織培養(yǎng)及無性系建立的研究【摘要】目的對(duì)白蘚資源進(jìn)展種質(zhì)保存，滿足人們?cè)耘鄬?duì)種苗的需求。方法以白蘚嫩莖為材料，以植物組織培養(yǎng)方法為手段，進(jìn)展了愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷組織和不頂芽分化，試管苗生根，試管苗移栽、扦插和移植的研究。結(jié)果1/2S+BA0.5gL-1+NAA1.01.5gL-1為嫩莖愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基；S+AgN31.5gL-1+BA0.8gL-1+naa0.2gL-1是嫩莖愈傷組織和不定芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基；1/3S+IAA0.40.6gL-1是生根培養(yǎng)和試管苗生根繼代培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基；移栽的試管苗保持了野生白蘚的所有生物學(xué)性狀，成功地建立起白蘚的無性系。結(jié)論嫩

2、芽誘導(dǎo)的愈傷組織建立的無性系能對(duì)其進(jìn)展種質(zhì)保存，所繁殖的種苗能滿足人們?cè)耘嗟男枨??！娟P(guān)鍵詞】白蘚；愈傷組織；無性系；快速繁殖白蘚Ditanusdasyarpus，又稱八股牛，屬于蕓香科白蘚屬多年生草本植物，生長(zhǎng)于山坡、林下、林緣和草地。在我國(guó)的東北、華北、西北和華東等地有分布，朝鮮、蒙古和俄羅斯也有分布13。白鮮葉可提取芳香油；根莖作農(nóng)藥用，可防治多種病蟲害；根皮白蘚皮入藥，具有解毒、祛熱、利尿、除濕和殺蟲等成效，能治皮膚瘙癢、濕疹、黃水瘡、黃疸、肝炎和陰部瘙癢等疾病35。由于白蘚既可作無公害的農(nóng)藥，又是治療多種疾病的中藥，從而出現(xiàn)了人們大量采收，數(shù)量越來越少的現(xiàn)象。于是，遼寧南部地區(qū)有人試圖

3、對(duì)其進(jìn)展栽培，但由于人們長(zhǎng)期地過量采挖，已經(jīng)難以搜集到種子，只能將有限的野生植株挖回來作為種苗，這又使數(shù)量非常少的野生白蘚資源遭到了破壞。于是，我們對(duì)白蘚進(jìn)展了組織培養(yǎng)及無性系建立的研究，以期滿足人們?cè)耘鄬?duì)種苗的需求。雖然已多有蕓香科植物組織培養(yǎng)研究的報(bào)道69，但迄今未見白蘚組織培養(yǎng)及無性系建立的研究的報(bào)道。本研究以白蘚的嫩莖為材料，成功地誘導(dǎo)形成愈傷組織，建立起無性系。1材料1.1材料及滅菌五月上旬至中旬，將林緣草地上長(zhǎng)勢(shì)非常旺盛的白蘚嫩莖切下后，放到500l的磨口廣口瓶中，用自來水振蕩洗滌30in左右，再用0.05%安利洗滌液振蕩洗滌20in左右，然后移到超凈工作臺(tái)上，用70%75%的乙醇

4、滅菌約15s后，迅速用無菌水振蕩洗滌2次，倒入0.05%Hgl2溶液振蕩滅菌3in，接著用0.025%Hgl2溶液振蕩滅菌8in，再用無菌水振蕩洗滌6次漓干后，將裝有材料的瓶子置于27的溫箱中放置24h，然后再用0.025%Hgl2滅菌6in，接著用無菌水洗滌6次。即可獲得白蘚無菌嫩莖。1.2培養(yǎng)條件以S，1/2S，1/3S為根本培養(yǎng)基，附加不同種類不同濃度的BA，IBA，IAA，NAA和2,4-D。以S為根本培養(yǎng)基加蔗糖30gL-1，以1/2S為根本培養(yǎng)基加蔗糖15gL-1，以1/3S為根本培養(yǎng)基加蔗糖10gL-1。培養(yǎng)基胨力強(qiáng)度為180g/210，pH為5.86.0，培養(yǎng)溫度2025，光照

5、度3000Lx左右，光照1012hd-1。2方法2.1不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)的影響將無菌嫩莖用解剖刀切成長(zhǎng)約0.2的無生長(zhǎng)點(diǎn)莖段，接種到附加不同濃度BA、IBA、NAA的1/2S培養(yǎng)基上，進(jìn)展愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)到50d時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)結(jié)果。嫩莖愈傷組織的誘導(dǎo)試驗(yàn)重復(fù)了3次，每次試驗(yàn)繼代培養(yǎng)5代。2.2不同激素愈傷組織分化的影響將繼代培養(yǎng)45d生長(zhǎng)一致的愈傷組織顆粒分散成獨(dú)立的顆粒后，接種到以S+AgN31.5gL-1為根本培養(yǎng)基，附加不同濃度BA、2,4-D或NAA的培養(yǎng)基中，進(jìn)展愈傷組織的分化培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種100個(gè)愈傷組織顆粒，統(tǒng)計(jì)觀察分化率和分化不定芽的生長(zhǎng)狀況。2.3不同濃

6、度IAA對(duì)不定芽生根的影響把上述繼代培養(yǎng)的叢生狀、生長(zhǎng)旺盛、高0.5以上的不定芽從基部剪下，接種到以1/3S為根本培養(yǎng)基，附加濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2gL-1和1.4gL-1的IAA培養(yǎng)基上，進(jìn)展不定芽的生根培養(yǎng)。生根實(shí)驗(yàn)重復(fù)了3次，每次試驗(yàn)接種200個(gè)不定芽。2.4試管苗的移栽、扦插把繼代培養(yǎng)的生根試管苗培養(yǎng)瓶移到日光溫室中，除掉培養(yǎng)瓶瓶塞，在40007000Lx光照下煉苗4d，用鑷子將試管苗取出，在清水中洗去根部培養(yǎng)基后，移栽到上面分別鋪著一層厚為67的河沙、珍珠巖、山皮土、園土、爐灰渣小顆粒狀5種移栽基質(zhì)、下面為肥沃園土的溫室苗床上。移栽后前15d保持相對(duì)

7、濕度為95左右、溫度2028、沒有直射光的條件。把經(jīng)過上述煉苗4d的試管苗取出后，剪成長(zhǎng)2左右，至少具有兩個(gè)腋芽或一個(gè)頂芽和兩個(gè)腋芽的莖段后，將最下面的一個(gè)葉片剪掉后，把下部切口在濃度為90gL-1的IAA溶液中浸泡處理46in后取出，直接扦插到上面覆蓋著一層上述五種事先已經(jīng)澆透水的移栽基質(zhì)的苗床上，并采用與移栽一樣的條件進(jìn)展管理。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3結(jié)果3.1不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)的影響由表1可見，接種到附加不同濃度BA、IBA的培養(yǎng)基中不能誘導(dǎo)形成愈傷組織；接種到附加不同濃度BA、NAA的培養(yǎng)基上都能誘導(dǎo)形成愈傷組織。但從愈傷組織的誘導(dǎo)率和長(zhǎng)勢(shì)看兩個(gè)方面看，以8、9號(hào)兩種培養(yǎng)基的誘

8、導(dǎo)效果好。在這兩種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的材料，不僅誘導(dǎo)率達(dá)100，而且愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)好。觀察還說明，接種在這兩種培養(yǎng)基上的外植體，培養(yǎng)到10d時(shí)，大局部培養(yǎng)材料在切口部開場(chǎng)出現(xiàn)愈傷組織，隨后愈傷組織開場(chǎng)迅速生長(zhǎng)。初期形成的愈傷組織為無色、光滑的半透明狀，后來逐漸生長(zhǎng)變化成為直徑在0.1左右的綠色顆粒狀。把上述兩種培養(yǎng)基上由嫩莖誘導(dǎo)培養(yǎng)的、生長(zhǎng)狀態(tài)一致的綠色顆粒狀愈傷組織分散為獨(dú)立的顆粒后，接種到一樣的培養(yǎng)基上進(jìn)展愈傷組織的繼代增殖培養(yǎng)。在一樣的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)45d。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)繼代培養(yǎng)5代的研究證明：初期培養(yǎng)的愈傷組織為淺綠色顆粒，后來伴隨著顆粒狀愈傷組織的迅速生長(zhǎng)增殖，逐漸變成為綠色

9、的顆粒。培養(yǎng)45d的增殖系數(shù)為28.5。上述試驗(yàn)結(jié)果說明，1/2S+BA0.5gL-1+NAA1.01.5gL-1的培養(yǎng)基為白蘚嫩莖顆粒狀愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。表1不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響略3.2不同激素對(duì)愈傷組織分化的影響由表2可以看出，在不同濃度的BA與不同濃度NAA配合使用的培養(yǎng)基上，顆粒狀愈傷組織的分化情況較好，尤其是濃度為0.8gL-1的BA與濃度為0.2gL-1的NAA培養(yǎng)基上，不僅愈傷組織的分化率到達(dá)了98%，而且分化不定芽長(zhǎng)勢(shì)好。試驗(yàn)過程中的觀察還發(fā)現(xiàn)，在這一培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)10d左右愈傷組織顆粒即可分化出可見的淺綠色芽點(diǎn)，隨后，伴隨著愈傷組織顆粒的不

10、斷分化增加和分化不定芽的生長(zhǎng)，先分化的不定芽基部又會(huì)分化出數(shù)量不等的不定芽，形成了綠色的叢生不定芽。分化培養(yǎng)到45d時(shí)，每個(gè)愈傷組織顆粒就會(huì)分化形成為有39個(gè)不定芽組成的叢生不定芽。把上述分化培養(yǎng)的綠色不定芽從基部剪下，接種到一樣的培養(yǎng)基上進(jìn)展不定芽的分化培養(yǎng)。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)繼代5代的研究證明：不定芽經(jīng)過40d培養(yǎng)，平均每個(gè)培養(yǎng)的不定芽可再分化生長(zhǎng)出高0.5以上不定芽5.4個(gè)。觀察還說明，經(jīng)過40d的培養(yǎng)，所培養(yǎng)的不定芽都分化生長(zhǎng)為叢生狀，并且分化的不定芽葉片伸展、莖較粗壯、生長(zhǎng)旺盛。上述說明，S+AgN31.5gL-1+BA0.8gL-1+NAA0.2gL-1這一培養(yǎng)基是白蘚

11、嫩莖顆粒狀愈傷組織和不定芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。表2不同激素愈傷組織分化的影響略3.3不同濃度IAA對(duì)不定芽生根的影響試驗(yàn)觀察說明，不定芽接種培養(yǎng)8d時(shí)，有的培養(yǎng)基上開場(chǎng)出現(xiàn)根原基。培養(yǎng)到25d時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)的3次重復(fù)試驗(yàn)的平均結(jié)果證明：在附加濃度為0.4gL-1，0.6gL-1的IAA培養(yǎng)基上，不僅平均生根率到達(dá)了96.5%和97%，平均每株生根數(shù)為6.1條，而且生根試管苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛。觀察還說明，不定芽接種到上述兩種培養(yǎng)基上10d時(shí)，培養(yǎng)材料幾乎都形成了根原基，隨后伴隨著根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，試管苗也迅速生長(zhǎng)。培養(yǎng)到25d時(shí)，就可以生長(zhǎng)成為高45左右、葉片伸展、莖粗壯、根系興旺的旺盛試管苗。把生根試管苗剪

12、成長(zhǎng)1左右、至少具有兩個(gè)腋芽或頂芽的莖段，接種到一樣的培養(yǎng)基上進(jìn)展生根繼代培養(yǎng)。經(jīng)過25d的培養(yǎng)，又可以培養(yǎng)成1代旺盛的試管苗。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)6代的繼代培養(yǎng)研究證明，用這種生根繼代培養(yǎng)的方法進(jìn)展繁殖，不僅培養(yǎng)材料的生根率近100%、25d的繁殖系數(shù)為3.1，而且?guī)缀鯖]有無效苗，繁殖試管苗生長(zhǎng)非常旺盛。上述結(jié)果說明，1/3S+IAA0.40.6gL-1這一培養(yǎng)基是白鮮不定芽生根培養(yǎng)和試管苗生根繼代培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。3.4試管苗的移栽、扦插和移植移栽后10d可見成活生長(zhǎng)，25d時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)證明，以河沙和爐灰渣為移栽基質(zhì)平均成活率分別為95%，97.4%，移栽成活后15d左右開場(chǎng)正常生

13、長(zhǎng)。扦插后15d可見成活生長(zhǎng)，30d時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)證明，以爐灰渣為扦插基質(zhì)，成活率為91%。扦插苗前50d植株較小，后期長(zhǎng)勢(shì)與移栽苗一致。上述說明，爐灰渣是白鮮試管苗移栽和扦插的理想基質(zhì)。把在日光溫室中移栽、扦插成活的試管苗于五月中旬和下旬先后兩次移植到山坡上，移植的白蘚試管苗保持了野生白蘚的所有生物學(xué)性狀，但與當(dāng)年的白蘚實(shí)生苗相比，試管苗移植后的前70d生長(zhǎng)較慢、植株較小，后期葉色濃綠、生長(zhǎng)非常旺盛而整齊，根系興旺相當(dāng)于實(shí)生苗的1.52倍，移植苗當(dāng)年可正常開花結(jié)實(shí)。4討論本研究以無生長(zhǎng)點(diǎn)嫩莖為材料建立起白蘚的無性系。這說明白蘚的非分生細(xì)胞和組織也具有全能性。用愈傷組織的繼代培養(yǎng)的方法進(jìn)展繁殖，4

14、5d的增殖系數(shù)為28.5。按照這個(gè)速度計(jì)算，每年的繁殖數(shù)量為28.58個(gè)；用不定芽分化繼代的方法進(jìn)展繁殖，平均40d能培養(yǎng)5.4個(gè)不定芽。按照這個(gè)速度計(jì)算，每年的繁殖數(shù)量為5.49個(gè)；用生根繼代的方法進(jìn)展繁殖，25d的繁殖系數(shù)為3.1。按照這個(gè)速度計(jì)算，每年的繁殖數(shù)量為3.114.6個(gè)。上述計(jì)算結(jié)果證明：無論采用上述哪種方法進(jìn)展繁殖，每年都能繁殖出大量的試管苗，滿足人們消費(fèi)對(duì)大量種苗的需要，但由于采用生根繼代的方法繁殖的試管苗生長(zhǎng)旺盛、沒有無效苗。所以，消費(fèi)上應(yīng)采用生根繼代的方法繁殖白蘚試管苗。如今許多研究指出，通過繼代培養(yǎng)的愈傷組織分化的試管苗容易發(fā)生變異1112，但在本研究中由白蘚無生長(zhǎng)點(diǎn)

15、嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的的試管苗不僅保持了白蘚的所有生物性狀，并且試管苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛而整齊。這可能是由以下原因引起的：一是本研究的環(huán)境較為穩(wěn)定，不易使培養(yǎng)材料發(fā)生變異；二是白蘚本身具有穩(wěn)定的遺傳性，不易受到培養(yǎng)環(huán)境的影響發(fā)生變異。這說明通過白蘚嫩莖誘導(dǎo)的愈傷組織建立的無性系可以對(duì)其進(jìn)展種質(zhì)保存。【參考文獻(xiàn)】1中國(guó)科學(xué)院植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志(第43卷:第2分冊(cè)).北京:科學(xué)出版社,1997:167.2中國(guó)科學(xué)院植物研究所.中國(guó)高等植物圖鑒(第2冊(cè)).北京:科學(xué)出版社,1980：551.3李書心.遼寧植物志(上冊(cè)).沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1991：1045.4江蘇新醫(yī)學(xué)院.中草藥大辭典(上冊(cè)).上海:上海人民出版社,1977：737.5韓全忠,王正興.大連地區(qū)植物志(中冊(cè)).大連:大連理工大學(xué)出版社，1993：419.6張紅梅,肖小琴,及華,等.花葉連翹的組織培養(yǎng)與快速繁殖J.植物生理學(xué)通訊，2002,38(5):453.7丁桂琴,王鳳英.金緣連翹的組織培養(yǎng)技術(shù)研究J.科技咨詢報(bào)，2022,(14):253