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1、第十章甾體激素類藥物的分析2022/10/2第十章甾體激素類藥物的分析第十章甾體激素類藥物的分析2022/9/24第十章甾體激素類激素(Hormone,荷爾蒙) 是人體內(nèi)各種內(nèi)分泌腺所分泌的一種生物活性物質(zhì)。激素作用于特定的稱為靶器官的組織、細(xì)胞上而發(fā)揮作用。如果激素分泌出現(xiàn)平衡失調(diào),可使人體發(fā)生病變,如甲亢、糖尿病等。第十章甾體激素類藥物的分析激素(Hormone,荷爾蒙)第十章甾體激素類藥物的分析ABCD12345678910111213141516171819 基本結(jié)構(gòu) 概 述甾體激素類藥物均具有環(huán)戊烷駢多氫菲母核。第十章甾體激素類藥物的分析ABCD1234567891011121314
2、1516171 分類甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素雄性激素孕激素雌激素蛋白同化激素第十章甾體激素類藥物的分析 分類甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素雄性激素孕激素雌激素蛋白 (一)腎上腺皮質(zhì)激素43酮基(紫外吸收)天然皮質(zhì)激素:氫化可的松 母核有21個(gè)碳原子C17醇酮基(還原性)第十章甾體激素類藥物的分析 (一)腎上腺皮質(zhì)激素43酮基天然皮質(zhì)激素:氫化可的松醋酸地塞米松結(jié)構(gòu)修飾曲安息龍地塞米松磷酸鈉提高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)抗炎作用第十章甾體激素類藥物的分析醋酸地塞米松結(jié)構(gòu)修飾曲安息龍地塞米松磷酸鈉提高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性第十(二)雄性激素和蛋白同化激素 天然雄性激素:睪酮 43酮基4位引入鹵素或19位去甲基或?qū)環(huán)結(jié)
3、構(gòu)改造均明顯降低雄性作用,增加蛋白同化作用 母核有19個(gè)碳原子 A環(huán)中有43酮基結(jié)構(gòu)第十章甾體激素類藥物的分析(二)雄性激素和蛋白同化激素 天然雄性激素:睪酮 43結(jié)構(gòu)修飾增加脂溶性,制成油注射劑可口服、延效丙酸睪酮甲睪酮增加位阻,難代謝氧化,穩(wěn)定性增強(qiáng)可口服第十章甾體激素類藥物的分析結(jié)構(gòu)修飾增加脂溶性,制成油注射劑丙酸睪酮甲睪酮增加位阻,難代蛋白同化激素苯丙酸諾龍4-氯醋酸睪丸素 母核有18或19個(gè)碳原子第十章甾體激素類藥物的分析蛋白同化激素苯丙酸諾龍4-氯醋酸睪丸素 母核有18或19個(gè)碳(三)孕激素C17-甲酮基43酮基天然孕激素:黃體酮 母核有21個(gè)碳原子 口服被迅速破壞失效,只能肌注第
4、十章甾體激素類藥物的分析(三)孕激素C17-甲酮基43酮基天然孕激素:黃體結(jié)構(gòu)修飾醋酸甲地孕酮(孕酮類孕激素)炔諾孕酮(睪酮類孕激素)炔諾酮(睪酮類孕激素)口服、長(zhǎng)效口服、長(zhǎng)效,17-OH作成庚酸酯,注射一次可維持3個(gè)月第十章甾體激素類藥物的分析結(jié)構(gòu)修飾醋酸甲地孕酮(孕酮類孕激素)炔諾孕酮(睪酮類孕激素)(四)雌激素 天然的雌性激素:雌二醇 母核有18個(gè)碳原子 A環(huán)為苯環(huán),C3位上有酚羥基,C17位上有-羥基 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,口服無(wú)效第十章甾體激素類藥物的分析(四)雌激素 天然的雌性激素:雌二醇 母核有1結(jié)構(gòu)修飾 炔雌醇 戊酸雌二醇 苯甲酸雌二醇乙炔基引入,使仲醇變叔醇,增加空間位阻,阻礙酶對(duì)藥物
5、的氧化代謝,可口服17位羥基酯化,酯在體內(nèi)緩慢水解,延效3位羥基酯化,酯在體內(nèi)緩慢水解,延效可口服高效長(zhǎng)效第十章甾體激素類藥物的分析結(jié)構(gòu)修飾 炔雌醇 戊酸雌二醇 人工合成代用品:非甾體化合物己烯雌二酚高效、長(zhǎng)效第十章甾體激素類藥物的分析人工合成代用品:非甾體化合物己烯雌二酚高效、長(zhǎng)效第十章甾體激43酮C17醇酮基C17羥基C17甲酮基A環(huán)為3OH苯環(huán)腎上腺皮質(zhì)激素+雄性與蛋白同化激素+雌性激素+孕激素+鑒別反應(yīng)UV、羰基試劑、氨基脲反應(yīng)還原性(堿性酒石酸酮、氨制AgNO3)可成酯與亞硝基鐵氰化鈉、間二硝基苯反應(yīng)UV、與重氮苯磺酸鹽反應(yīng)二、特殊官能團(tuán)與分析方法第十章甾體激素類藥物的分析43酮C1
6、7醇酮基C17羥基C17甲酮基第二節(jié) 鑒別試驗(yàn)一、物理常數(shù)的測(cè)定二、化學(xué)鑒別法三、制備衍生物測(cè)定熔點(diǎn)四、紫外分光光度法五、紅外分光光度六、薄層色譜法七、高效液相色譜法第十章甾體激素類藥物的分析第二節(jié) 鑒別試驗(yàn)一、物理常數(shù)的測(cè)定二、化學(xué)鑒別法三、制備第二節(jié) 鑒別試驗(yàn)二、化學(xué)鑒別法(一)呈色反應(yīng)(1)與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)強(qiáng)酸: H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl原理:酮基先質(zhì)子化,形成正碳離子,再與HSO4-作用呈色。第十章甾體激素類藥物的分析第二節(jié) 鑒別試驗(yàn)二、化學(xué)鑒別法(1)與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)強(qiáng)酸顯 色熒光加水稀釋氫化可的松棕黃色至紅色 綠色黃色至橙黃色炔雌醇橙紅黃綠玫紅絮狀炔雌醚橙紅黃綠紅
7、色潑尼松黃橙黃色漸變藍(lán)綠色潑尼松龍深紅灰色絮狀地塞米松淡紅棕色顏色消失苯甲酸雌二醇黃綠色藍(lán)色淡橙色與硫酸顯色反應(yīng)第十章甾體激素類藥物的分析顯 色熒光加水稀釋氫化可的松棕黃色至紅色 綠色黃色至橙1、C3酮基和C20酮基(1)與羰基試劑2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼反應(yīng)生成腙。(2)官能團(tuán)的呈色反應(yīng)(2)與羥胺或氨基脲分別生成具有一定熔點(diǎn)的肟或縮氨脲。第十章甾體激素類藥物的分析1、C3酮基和C20酮基(1)與羰基試劑2,4-二硝基苯+HCl黃色3,20-雙腙室溫下長(zhǎng)時(shí)間加熱第十章甾體激素類藥物的分析+HCl黃色3,20-雙腙室溫下長(zhǎng)時(shí)間加熱第十章甾體激素類藥結(jié)論:成腙反應(yīng)中 C20酮基受C1
8、8甲基的空間位阻影響,反應(yīng)較慢,需加熱或較長(zhǎng)時(shí)間放置,才完成反應(yīng)。 C11酮基受C18、C19位甲基甲基的阻礙,不發(fā)生反應(yīng)。 C3酮基空間位阻最小,最易起反應(yīng),室溫下先生成單腙。第十章甾體激素類藥物的分析結(jié)論:成腙反應(yīng)中 C20酮基受C18甲基的空間位阻影響,反2、C17醇酮基的呈色反應(yīng)(還原性) 能與堿性酒石酸銅試液(斐林試液)、氨制AgNO3試液(多倫試液)、四氮唑鹽反應(yīng)呈色。其中以四氮唑鹽的顯色反應(yīng)最為常用,不但可用作層析法的顯色劑,還可用于含量測(cè)定. 適用:腎上腺皮質(zhì)激素。第十章甾體激素類藥物的分析2、C17醇酮基的呈色反應(yīng)(還原性) 能與堿性酒石酸銅 2Cu2+ + 4OH-+ Cu
9、2O + H2O橙紅色 2Ag+ + 2OH-+2Ag + CH3COOH黑色醋酸去氧皮質(zhì)酮第十章甾體激素類藥物的分析 2Cu2+ + 4OH-+ Cu2O + H2O橙+H2O+ CH3COOH+OH-醋酸潑尼松深紅色的三苯甲鐕四氮唑鹽第十章甾體激素類藥物的分析+H2O+ CH3COOH+OH-醋酸潑尼松深紅色的三苯結(jié)論: 三苯甲鐕于490nm處顯示最大吸收,可用比色法測(cè)含量。 四氮唑鹽反應(yīng)還用于腎上腺皮質(zhì)激素類藥物中雜質(zhì)“有關(guān)物質(zhì)”檢查的顯色劑。 反應(yīng)在堿性條件下(水解)進(jìn)行。第十章甾體激素類藥物的分析結(jié)論: 三苯甲鐕于490nm處顯示最大吸收,可用比色法測(cè)含量 適用:具有甲酮基或活潑亞甲
10、基的甾體激素類藥物。3.甲酮基的呈色反應(yīng) 能與亞硝基鐵氰化鈉、間二硝基酚、芳香醛反應(yīng)呈色。孕激素(1)甲酮基:黃體酮專屬性反應(yīng)。黃體酮其他甾體亞硝基鐵氰化鈉藍(lán)紫色淡橙色或不顯色第十章甾體激素類藥物的分析 適用:具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物。3.甲酮基結(jié)論: 在堿性條件下進(jìn)行。 與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)稱為堿性硝普鈉反應(yīng)。(2)亞甲基的反應(yīng):硫酸普拉睪酮 乙醇間二硝基苯氫氧化鈉紫紅色第十章甾體激素類藥物的分析結(jié)論: 在堿性條件下進(jìn)行。 與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)稱為堿性硝普 適用:雌激素類藥物。4.酚羥基的呈色反應(yīng) 能與重氮苯磺酸發(fā)生偶合反應(yīng),生成紅色偶氮染料。苯甲酸雌二醇H+紅色第十章甾體激素
11、類藥物的分析 適用:雌激素類藥物。4.酚羥基的呈色反應(yīng) 能與重氮苯磺酸有機(jī)氟F有機(jī)破壞有機(jī)氯5、鹵元素的呈色反應(yīng)茜素氟藍(lán)硝酸亞鈰硝酸硝酸銀呈藍(lán)紫色 ClAgCl氯原子結(jié)合在母核環(huán)上第十章甾體激素類藥物的分析有機(jī)氟F有機(jī)破壞有機(jī)氯5、鹵元素的呈色反應(yīng)茜素氟藍(lán)硝酸亞6、沉淀反應(yīng)(1)與堿性酒石酸銅(斐林試液)的沉淀反應(yīng)(2)氨制AgNO3(多倫試液)的沉淀反應(yīng)(3)與AgNO3的沉淀反應(yīng) 適用:含炔基的甾體激素類藥物(炔雌醇、炔諾酮)。 機(jī)理:HNO3+NaOH滴定,電位法指示終點(diǎn)第十章甾體激素類藥物的分析6、沉淀反應(yīng)(1)與堿性酒石酸銅(斐林試液)的沉淀反應(yīng)(2)(4)與HNO3-AgNO3的沉
12、淀反應(yīng) 適用:甾體激素類藥物C21位上有氯原子取代,如丙酸氯倍他索。 機(jī)理:有機(jī)氯原子水解加熱無(wú)機(jī)氯原子結(jié)合在母核環(huán)上的氯原子氧瓶燃燒法 破壞無(wú)機(jī)氯原子硝酸硝酸銀AgCl第十章甾體激素類藥物的分析(4)與HNO3-AgNO3的沉淀反應(yīng) 適用:甾體激素類藥物 原理:一些甾體激素類藥物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的結(jié)構(gòu),可先行水解,根據(jù)水解產(chǎn)物來(lái)鑒別。7、水解產(chǎn)物的反應(yīng) 適用: 本類藥物C3、C17或C21位上羥基的酯 結(jié)果: 醋酸酯水解后生成的醋酸可與乙醇反應(yīng),生成有香氣醋酸乙酯。 戊酸或己酸酯類水解后可生成有特臭的戊酸或己酸,進(jìn)行鑒別。第十章甾體激素類藥物的分析 原理:一些甾體激素類藥物具有醋酸
13、酯、戊酸酯及已酸酯的結(jié)構(gòu),三、制備衍生物測(cè)熔點(diǎn)(二)酯的水解醇制KOH 水解m.p.為150 156(一)酯的生成 + KOH丙酸睪丸素睪丸素m.p.為201+第十章甾體激素類藥物的分析三、制備衍生物測(cè)熔點(diǎn)(二)酯的水解醇制KOHm.p.為150m.p.約182(分解)(三)縮氨基脲的生成苯丙酸諾龍苯丙酸諾龍縮氨脲H2NCONHNH2(四)酮肟的生成炔諾酮HONH2炔諾酮肟m.p.約195(分解)醋酸潑尼松第十章甾體激素類藥物的分析m.p.約182(分解)(三)縮氨基脲的生成苯丙酸諾龍苯丙-3-酮(五)UV-ViS分光光度法240nm左右280nm左右苯環(huán)其他共軛結(jié)構(gòu)原 理200-760nm有
14、特征吸收。方 法可規(guī)定最大吸收波長(zhǎng)、A、吸收系數(shù)、A大/A小。第十章甾體激素類藥物的分析-3-酮(五)UV-ViS分光光度法240nm左右280 示 例曲安息龍丙酸倍氯米松溶劑甲醇乙醇濃度20g/ml20g/ml結(jié)果判斷在238nm處有最大吸收在239nm處有最大吸收,A為 0.570.60,在239nm與263nm 處的吸收度比值為2.252.45第十章甾體激素類藥物的分析 示 例曲安息龍丙酸倍氯米松溶劑甲醇乙醇濃度20g/ml2結(jié)構(gòu)特征: 酚羥基 C17 OH C17 乙炔基eg1:炔雌醇(六)IR法原料藥第十章甾體激素類藥物的分析結(jié)構(gòu)特征:eg1:炔雌醇(六)IR法原料藥第十章甾體激素類
15、藥1505cm-13505cm-13300cm-11590cm-13610cm-1酚羥基醇羥基1615cm-1苯環(huán)的骨架振動(dòng)第十章甾體激素類藥物的分析1505cm-13505cm-13300cm-11590ceg2:黃體酮-3-酮結(jié)構(gòu)特征:C17-酮基第十章甾體激素類藥物的分析eg2:黃體酮-3-酮結(jié)構(gòu)特征:C17-酮基第十章甾體激1700cm-1C=O20位酮基1665cm-13位酮基1615cm-1870cm-1C-H雙鍵第十章甾體激素類藥物的分析1700cm-1C=O20位酮基1665cm-13位酮基1七、TLC法八、HPLC應(yīng)用甾體激素類藥物原料與制劑的鑒別甾體激素類藥物原料與制劑的鑒
16、別(如:醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏)方法對(duì)照品法對(duì)照品法結(jié)果判斷要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同要求在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中,供試品峰的tR與對(duì)照品峰的tR一致第十章甾體激素類藥物的分析七、TLC法八、HPLC應(yīng)用甾體激素類藥物原料與制劑的鑒別甾第三節(jié) 特殊雜質(zhì)檢查 雜質(zhì)來(lái)源:原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物以及試劑和溶劑。一、有關(guān)物質(zhì)的檢查 其他甾體:有些雜質(zhì)與該甾體激素藥物結(jié)構(gòu)類似,也具有一定的藥理作用而又互不相同,因此在甾體激素類藥物的質(zhì)量控制中,“其他甾體”的限度檢查顯得很重要。第十章甾體激素類藥物的分析第三節(jié) 特殊雜質(zhì)檢查 雜質(zhì)來(lái)源:原料、中間體、
17、異構(gòu)體、降解檢查方法:(具有一定分離能力)判定方法:規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色 1、TLC法(自身對(duì)照法)eg:氫化可的松中其他甾體的檢查 供試液:本品+氯仿-甲醇(9:1) 濃度:3.0mg/ml 對(duì)照液:供試液(3.0mg/ml)+氯仿-甲醇(9:1) 60g/ml 層析:供試液 對(duì)照液 點(diǎn)樣、展開、斑點(diǎn)檢出。 判斷:供試液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn),不得多于3個(gè),其顏色與對(duì)照液的主斑點(diǎn)比較,不得更深。第十章甾體激素類藥物的分析檢查方法:(具有一定分離能力)判定方法:規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目 2、HPLC法(自身對(duì)照法)圖A中峰1面積的四分之三判定方法: 規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)峰面積第十章甾體激素類藥
18、物的分析2、HPLC法(自身對(duì)照法)圖A中峰1面積的四分之三判定方二、游離磷酸鹽的檢查 方法:對(duì)照品比色法 雜質(zhì)來(lái)源:地塞米松磷酸鈉生產(chǎn)過(guò)程中,由磷酸酯化時(shí)殘存的過(guò)量磷酸鹽。 結(jié)果判斷:供試品溶液的吸光度不得大于對(duì)照溶液的吸光度。740nm 原理:供試液+鉬酸銨+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸 鉬藍(lán)第十章甾體激素類藥物的分析二、游離磷酸鹽的檢查 方法:對(duì)照品比色法 雜質(zhì)來(lái)源:地塞米三、有機(jī)溶劑殘留量的檢查eg:地塞米松磷酸鈉 方法:GC色譜法 雜質(zhì)來(lái)源:地塞米松磷酸鈉生產(chǎn)中,使用大量甲醇和丙酮。 結(jié)果判斷:不得出現(xiàn)甲醇峰,甲醇含量0.3 丙酮規(guī)定不得過(guò)5.0%第十章甾體激素類藥物的分析三、有機(jī)溶
19、劑殘留量的檢查eg:地塞米松磷酸鈉 方法:GC色譜四、硒的檢查氧瓶燃燒二氨基萘比色法測(cè)定 雜質(zhì)來(lái)源:地塞米松、氟輕松和曲安奈得等甾體激素類藥物,在生產(chǎn)中使用二氧化硒(SeO2)脫氫工藝,藥物可能引入雜質(zhì)硒。 方法:藥物 結(jié)果判斷:供試品溶液的吸光度不得大于硒對(duì)照溶液的吸光度(0.0050.01) 。378nm五、雌酮六、乙炔基第十章甾體激素類藥物的分析四、硒的檢查氧瓶燃燒二氨基萘比色法測(cè)定 雜質(zhì)來(lái)源:地塞米松、第四節(jié) 含量測(cè)定 常用方法容量法比色法紫外分光光度法熒光法氣相色譜法高效液相色譜四氮唑鹽比色法異煙肼比色法鐵-酚試劑比色法第十章甾體激素類藥物的分析第四節(jié) 含量測(cè)定 常用方法容量法比色法
20、紫外分光光度法熒一、HPLC法USP、BP、JP均采用方法:RPHPLC(內(nèi)標(biāo)法) 測(cè)定對(duì)象:甾體激素類藥物的原料和制劑。eg:黃體酮的含量測(cè)定色譜條件:固定相 ODS,檢測(cè)波長(zhǎng)254nm 流動(dòng)相 甲醇-水(65:35) 內(nèi)標(biāo)物 己烯雌酚系統(tǒng)適用性試驗(yàn):n1000,R符合規(guī)定。第十章甾體激素類藥物的分析一、HPLC法USP、BP、JP均采用方法:RPHPLC(測(cè)定樣品:黃體酮原料、注射液。定量方法:內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)-1第十章甾體激素類藥物的分析測(cè)定樣品:黃體酮原料、注射液。定量方法:內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)-1二、UV-ViS分光光度法1、-3-酮 240nm()2、苯環(huán) 280nm() 雌激素腎上腺皮質(zhì)激素
21、雄性激素和蛋白同化激素孕激素(一)UV分光光度法缺點(diǎn):專屬性不強(qiáng)第十章甾體激素類藥物的分析二、UV-ViS分光光度法1、-3-酮 240nm(示例:醋酸地塞米松片的含量均勻度檢查(1)配制供試液,取10片分別進(jìn)行測(cè)定(2)測(cè)定:240nm(3)計(jì)算第十章甾體激素類藥物的分析示例:醋酸地塞米松片的含量均勻度檢查第十章甾體激素類藥物的分(二) 比色法有色甲瓚四氮唑鹽醇酮基-a-17COH -1、 四氮唑鹽比色法(1)原理:腎上腺皮質(zhì)激素類C17-醇酮基強(qiáng)還原性。H氯化三苯四氮唑(TTC)三苯甲瓚深紅第十章甾體激素類藥物的分析(二) 比色法有色甲瓚四氮唑鹽醇酮基-a-17COH -1、藍(lán)四氮唑(BT
22、)525 nm第十章甾體激素類藥物的分析藍(lán)四氮唑(BT)第十章甾體激素類藥物的分析25氫氧化四甲基銨對(duì)照液供試液ATTC4045暗(2)方法:對(duì)照品法(3)影響因素A. 基團(tuán)對(duì)反應(yīng)速度的影響C11= OC11OHC21OH未酯化C21-OH酯化第十章甾體激素類藥物的分析25氫氧化四甲基銨對(duì)照液供試液ATTC4045暗(2)B、溶劑和水分的影響 以無(wú)水乙醇為溶劑,水含量大時(shí),呈色減慢,不超過(guò)5對(duì)結(jié)果沒有影響。C、O2與光線的影響避光、隔絕空氣、快速、充N2D、堿的種類及加入順序以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳加入順序:皮質(zhì)激素溶液四氮唑鹽堿試液第十章甾體激素類藥物的分析B、溶劑和水分的影響 以無(wú)水乙醇
23、為溶劑,水含量大時(shí),E. 溫度與時(shí)間室溫(25)反應(yīng)4045 minF. 干擾物的影響 油膏、冷霜等制劑含聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂對(duì)BT的顯色反應(yīng)有干擾,要先分離后測(cè)定。第十章甾體激素類藥物的分析E. 溫度與時(shí)間室溫(25)反應(yīng)4045 minF. 干(1) 原理異煙腙(黃)HCl420nm2、異煙肼比色法C3-酮基+異煙肼H2O腎上腺皮質(zhì)激素 雄性激素蛋白同化激素孕激素第十章甾體激素類藥物的分析(1) 原理異煙腙(黃)HCl420nm2、異煙肼比色法C3(2)方法:對(duì)照品法60異煙肼無(wú)水甲醇對(duì)照液供試液A暗60第十章甾體激素類藥物的分析(2)方法:對(duì)照品法60異煙肼無(wú)水甲醇對(duì)照液供試液A暗60(3)影響因素A.反應(yīng)速度(反應(yīng)專屬性) C3=OC17= O 、C20= O C11= O 不反應(yīng)B. 溶劑的選擇異煙肼鹽酸鹽受溶解度的影響無(wú)水甲醇無(wú)水乙醇對(duì)試劑的穩(wěn)定性好呈色強(qiáng)度較無(wú)水乙醇中高對(duì)植物油的溶解度小第十章甾體激素類藥物的分析(3)影響因素A.反應(yīng)速度(反應(yīng)專屬性) C3=OC17=C.水分
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