HIV感染的血清學(xué)檢測培訓(xùn)課件

1、內(nèi)容HIV抗體檢測：HIV抗體篩查檢測HIV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)HIV P24抗原檢測：1HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022內(nèi)容HIV抗體檢測：1HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/202HIV抗體檢測全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范National Guideline for Detection of HIV/AIDS（2004年版）2HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022HIV抗體檢測全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范2HIV感染的血清學(xué)檢測HIV抗體檢測可用于監(jiān)測、診斷、血液篩查：以監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢而進(jìn)行的檢測，檢測的人群包括各類高危人群和一般人群。以診斷為目的的檢測是為了確定

2、個(gè)體HIV感染狀況而進(jìn)行的檢測，包括臨床檢測和自愿咨詢檢測、術(shù)前檢測、根據(jù)特殊需要進(jìn)行的體檢等。以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播HIV而進(jìn)行的檢測，包括獻(xiàn)血員篩查和原料血漿篩查。HIV抗體檢測分為篩查試驗(yàn)（包括初篩和復(fù)檢）和確認(rèn)試驗(yàn)3HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022HIV抗體檢測可用于監(jiān)測、診斷、血液篩查：3HIV感染的血清HIV抗體試劑盒進(jìn)展代次 抗原 方法特異性檢測 檢測時(shí)間1 全病毒 間接 IgG 抗體HIV-1 2個(gè)月2 重組或多肽 間接 IgG 抗體HIV-1 / -2 3-4 周3 重組+多肽 夾心 IgM / IgG 抗體 4-7 天 HIV-1 / -2 / -

3、O4 抗原+抗體 夾心IgM / IgG 抗體 抗原 5pg HIV-1 / -2 / -O p24 抗原4HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022HIV抗體試劑盒進(jìn)展代次 抗原 HIV抗體檢測篩查試驗(yàn)5HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022 HIV抗體檢測篩查試驗(yàn)5HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/2HIV抗體篩查檢測程序篩查、復(fù)檢、確認(rèn)原理酶聯(lián)免疫、凝集、層析標(biāo)本血液、唾液、尿液、組織液產(chǎn)品ELISA、快速、簡單6HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022HIV抗體篩查檢測程序篩查、復(fù)檢、確認(rèn)6HIV感染的血清學(xué)篩查試劑要求HIV 混合型國家SDA生物診斷試劑注冊批準(zhǔn)批檢合格臨床評估質(zhì)量優(yōu)良

4、7HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022篩查試劑要求HIV 混合型7HIV感染的血清學(xué)檢測10/篩查方法：常用的篩查方法是酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）快速檢測（RT）及其它檢測 (1)明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA) (2)斑點(diǎn)EIA或稱斑點(diǎn)ELISA (dot-EIA) (3)斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn) (4)艾滋病唾液檢測卡尿液HIV抗體檢測8HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022篩查方法：8HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/2022一、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)：ELISA 9HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022一、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)：ELISA9HIV感染的血清學(xué)檢測10/1包被抗原血中抗體與抗原反應(yīng)

5、顯色反應(yīng)酶聯(lián)免疫法病毒溶解抗原、重組的衍生抗原、合成肽抗原酶聯(lián)HRP、AP或化學(xué)發(fā)光10HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022包被抗原血中抗體與抗原反應(yīng)顯色反應(yīng)酶聯(lián)免疫法病毒溶解抗原、重（一）斑點(diǎn)EIA或稱斑點(diǎn)ELISA（dot-EIA）以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點(diǎn)狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10 min以內(nèi)，使用抗原量少。二、快速診斷試劑11HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022（一）斑點(diǎn)EIA或稱斑點(diǎn)ELISA（dot-EIA）二、快速（二）免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)與斑點(diǎn)EIA相似，也是以

6、硝酸纖維膜為載體。區(qū)別在于不用酶標(biāo)記抗體，而代之以紅色的膠體金（或膠體硒）A蛋白，用滲濾法作為洗滌方法。12HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022（二）免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)12HIV感染的血清學(xué)檢穩(wěn)定，可室溫長期保存。試驗(yàn)不需任何設(shè)備，迅速、簡便、特異性較好，敏感性約相當(dāng)于中度敏感的ELISA，適用于應(yīng)急檢測、門診急診個(gè)體檢測。已有被SFDA批準(zhǔn)注冊的進(jìn)口試劑和國內(nèi)產(chǎn)品。一般可在1030min內(nèi)判讀結(jié)果。 免疫膠體硒快速試驗(yàn)特點(diǎn)13HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022穩(wěn)定，可室溫長期保存。試驗(yàn)不需任何設(shè)備，迅速、簡便、特異性較樣品墊: 加入血漿,血清或全血樣品.紅細(xì)胞在此遷移過

7、程中被去除質(zhì)控條:固定的含捕捉硒標(biāo)物的特異性試劑,不管樣品中有無被檢測物都應(yīng)出現(xiàn)紅色線條.控制測試結(jié)果的有效性病人條:固定的含特異性分析試劑,任何與硒標(biāo)特異性試劑結(jié)合的分析復(fù)合物在此被結(jié)合固定,形成三文治結(jié)合物,肉眼可見的紅色線條說明有陽性反應(yīng)連接物墊:含分析特異性試劑結(jié)合的硒標(biāo),為一種肉眼可見的紅色信號,被分析物和硒標(biāo)特異性試劑在此反應(yīng)結(jié)合14HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022樣品墊: 加入血漿,血清或全血樣品.紅細(xì)胞在此遷移過程中被去 撕下所需的測試紙條數(shù),撕下表面保護(hù)膜15HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022 撕下所需的測試紙條數(shù),撕下表面保護(hù)膜15HIV感染的血清學(xué)血清/血漿

8、樣品加50ul樣品于樣品墊中15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果16HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022血清/血漿樣品15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果16HIV感染的血清學(xué)檢測1全血樣品 加50ul樣品于樣品墊中手指血方法靜脈血方法加一滴緩沖液15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果17HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022全血樣品手指血方法靜脈血方法加一滴緩沖液15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果1病人條質(zhì)控條18HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022病人條質(zhì)控條18HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/2022 注意事項(xiàng)非EDTA抗凝的血漿樣品可能會 得到不正確的結(jié)果反應(yīng)條顏色深淺的程度與樣品中 抗體的滴度沒有必然的聯(lián)系 結(jié)果的判斷19HIV感染的血清學(xué)檢測

9、10/2/2022 注意事項(xiàng)非EDTA抗凝的血漿樣品可能會19HIV感染的 （三）艾滋病唾液檢測卡在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同時(shí)檢測含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測唾液中的HIV IgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可避免靜脈穿刺。但樣品預(yù)處理時(shí)間長且售價(jià)較高。以唾液為樣品測定HIV抗體的ELISA、免疫印跡法（WB）試劑已經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)。20HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022 （三）艾滋病唾液檢測卡20HIV感染的血清學(xué)檢測10/1（四）明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）PA是HIV血清抗體檢測的一種簡便方

10、法，是將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用，混勻后保溫（一般為室溫）。當(dāng)待檢樣品含有HIV抗體時(shí)，經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA試劑（AFD HIV-1/2 PA），已經(jīng)我國食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）注冊批準(zhǔn)；HIV-1、HIV-2抗原分別致敏的PA試劑（SERODIA-HIV-1/2）可初步區(qū)分HIV-1型和HIV-2型，目前我國尚未引進(jìn)。21HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022（四）明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）21HIV感染的血清學(xué)檢測10 尿液測定采樣優(yōu)點(diǎn)，尤其對

11、吸毒者標(biāo)本機(jī)理：IgA為主，IgG少量HIV-1型抗體陽性結(jié)果務(wù)必用血清學(xué)檢測22HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022 尿液測定22HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/2022快速試劑的應(yīng)用偏遠(yuǎn)地區(qū)急診臨床（高危）職業(yè)暴露臨產(chǎn)23HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022快速試劑的應(yīng)用偏遠(yuǎn)地區(qū)23HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/2結(jié)果報(bào)告： 對呈陰性反應(yīng)的樣品，可由實(shí)施檢測的實(shí)驗(yàn)室出具HIV抗體陰性報(bào)告。 對呈陽性反應(yīng)的樣品，須進(jìn)行復(fù)檢，不能出陽性報(bào)告。復(fù)檢試驗(yàn)： 對初篩呈陽性反應(yīng)的樣品用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的篩查試劑重復(fù)檢測。 如果兩種試劑復(fù)測均呈陰性反應(yīng)，則報(bào)告HIV抗體陰性

12、；如均呈陽性反應(yīng)，或一陰一陽，需送艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)。 對初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)者不能出陽性報(bào)告，可出具“HIV抗體待復(fù)查”報(bào)告。24HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022結(jié)果報(bào)告：24HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/2022初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)樣品的轉(zhuǎn)送： 填寫“HIV抗體待復(fù)測送檢單”，經(jīng)1名檢驗(yàn)人員和1名具有中級以上技術(shù)職稱的人員審核簽字。送當(dāng)?shù)匕滩『Y查中心實(shí)驗(yàn)室，再轉(zhuǎn)送艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室，或在本實(shí)驗(yàn)室復(fù)檢后直接送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室。 對篩查陰性和陽性者，均需做好檢測后咨詢。25HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)樣品的轉(zhuǎn)送：25HIV感染的血清學(xué)檢測10樣本初篩檢測一陰

13、一陽均陽性反應(yīng)陰性報(bào)告送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)重復(fù)檢測陰性報(bào)告均陰性反應(yīng)陽性反應(yīng)原有試劑另一種原理初篩試劑用初篩試劑陰性反應(yīng)HIV抗體初篩檢測流程圖26HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022樣本初篩檢測一陰一陽均陽性反應(yīng)陰性報(bào)告送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)重 初篩試驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告 對HIV抗體篩查試驗(yàn)：“” “HIV抗體陰性”報(bào)告（可用附表“+” 不能出陽性報(bào)告，可出具“HIV抗體待復(fù)查”報(bào)告27HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022 初篩試驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告 對HIV抗體篩查試驗(yàn)：27HIV感染的對HIV抗體篩查試驗(yàn)，呈陰性反應(yīng)者可出具“HIV抗體陰性”報(bào)告28HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022對HIV抗體篩

14、查試驗(yàn)，呈陰性反應(yīng)者可出具“HIV抗體陰性”報(bào)對初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)者不能出陽性報(bào)告，可出具“HIV抗體待復(fù)查”報(bào)告29HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022對初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)者不能出陽性報(bào)告，可出具“HIV抗體待復(fù)30HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/202230HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/2022 HIV抗體檢測確認(rèn)試驗(yàn) 31HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022 HIV抗體檢測確認(rèn)試驗(yàn) 31HIV感染的血清學(xué)檢測10/1HIV抗體確認(rèn)試驗(yàn)確認(rèn)試驗(yàn)的試劑： 必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑。確認(rèn)試驗(yàn)方法： 包括免疫印跡試驗(yàn)(WB)、條帶免疫試驗(yàn)(LIATEK

15、HIV)、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)及免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。國內(nèi)常用的確認(rèn)試驗(yàn)方法是WB。32HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022HIV抗體確認(rèn)試驗(yàn)確認(rèn)試驗(yàn)的試劑：32HIV感染的血清學(xué)檢測蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB）廣泛使用的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)基本原理HIV全病毒抗原經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳,將分子量大小不等的HIV抗原蛋白帶分離開來,然后再把這些已經(jīng)分離的不同蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀,每一條硝酸纖維素膜上均含有經(jīng)電泳分離過的HIV病毒抗原。33HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB）33HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/20將待檢血清樣品加到硝酸纖維素膜上,恒溫

16、震蕩,使其充分接觸反應(yīng),血清中若含有抗HIV抗體,就會與膜條上的抗原帶相結(jié)合。加入酶偶聯(lián)的抗人IgG抗體和底物，即可使有反應(yīng)的抗原-抗體結(jié)合帶呈現(xiàn)紫褐色,根據(jù)出現(xiàn)條帶情況判定結(jié)果。34HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022將待檢血清樣品加到硝酸纖維素膜上,恒溫震蕩,使其充分接觸反應(yīng)蛋白質(zhì)抗原分子經(jīng)電泳分開血液中的抗體與抗原反應(yīng)，形成不同的條帶Western Blot35HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022蛋白質(zhì)抗原分子經(jīng)電泳分開血液中的抗體與抗原反應(yīng)，形成不同的條方法加血漿YYY洗加酶結(jié)合物(Ab-HRP) YYYYYYY洗加底物YYYYYY36HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022方

17、法加血漿YYY洗加酶結(jié)合物YYYYYYY洗加底物YYYYY其可檢測標(biāo)本中針對HIV不同抗原的抗體，故被用做確認(rèn)試劑。不同的研究機(jī)構(gòu)有不同的判定標(biāo)準(zhǔn)37HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022其可檢測標(biāo)本中針對HIV不同抗原的抗體，故被用做確認(rèn)試劑。3WB結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)無HIV-1特異性條帶ENV 或ENV+p24CHINA無條帶1 ENV + p24/p31FDA（USA）無條帶或只有P172 ENV+GAG+POLWHO陰 性陽 性組 織“不確定”()：出現(xiàn)HIV-1特異性條帶，但帶型不足以 確認(rèn)陽性，每三個(gè)月隨訪一次，共兩次， 仍屬可疑，判為陰性38HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022W

18、B結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)無HIV-1特異性條帶ENV 或ENV+HIV抗體確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果a 強(qiáng)陽性對照（HIV-1和HIV-2）b弱陽性對照（HIV-1）c陰性對照d典型的HIV-2血清陽性反應(yīng) a b c dgp160gp120 p66p55p51 gp41p39 p31P24p17 血清對照HIV-2特異帶39HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022HIV抗體確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果a 強(qiáng)陽性對照（HIV-1和HIV-2不確定標(biāo)本的處理原因特異性和非特異性因素標(biāo)本種類，操作技術(shù)，感染時(shí) 間，指征把握等處理隨訪（注意一根條帶）保存40HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022不確定標(biāo)本的處理原因特異性和非特異性40H

19、IV感染的血清學(xué)試驗(yàn)中應(yīng)注意的問題嚴(yán)格按照說明書操作和閱讀判斷結(jié)果典型帶型和顏色；強(qiáng)調(diào)env帶非典型全而淡、一根主要條帶、高危人群、不確定，等等特異性高，但也有漏檢核對、多種、操作技術(shù)41HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022試驗(yàn)中應(yīng)注意的問題嚴(yán)格按照說明書操作和閱讀41HIV感染的血免疫印跡法（WB，HIV-1/2混合型）HIV-1陽性反應(yīng)不確定反應(yīng) 出現(xiàn)HIV-2指示條帶報(bào)告HIV-1陽性不確定反應(yīng)陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)報(bào)告陰性每3個(gè)月隨訪1次，共2次，仍屬可疑，則報(bào)告陰性；如隨訪期間HIV抗體出現(xiàn)陽性反應(yīng)則報(bào)告陽性。隨訪期間可根據(jù)需要，檢測病毒核酸和或P24抗原，作為輔助診斷。陰性反應(yīng)報(bào)告陰

20、性篩查試驗(yàn)陽性反應(yīng)樣品報(bào)告HIV-2血清學(xué)陽性免疫印跡法（WB，HIV-2）圖2 HIV抗體確認(rèn)檢測流程42HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022免疫印跡法（WB，HIV-1/2混合型）HIV-1陽性反應(yīng)不P24抗原檢測43HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022P24抗原檢測43HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/2022窗口期4th gen3rd gen= =1st-2nd genHIV antigenIgM abIgG abDetection limit= window第一/二代試劑檢測IgG抗體，第三代試劑檢測IgG 、IgM抗體,第四代試劑同時(shí)檢測IgG、 IgM抗體和P24抗原使窗口

21、期縮短。44HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022窗口期4th gen3rd g窗口期窗口期的決定因素初篩試劑質(zhì)量和測試技術(shù)機(jī)體免疫反應(yīng)病毒特性窗口期無法避免45HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022窗口期窗口期的決定因素45HIV感染的血清學(xué)檢測10/1/ P24抗原測定適用范圍HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷。HIV-1陽性母親所生嬰兒的鑒別診斷。第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性反應(yīng)， 但HIV-1抗體確認(rèn)陰性者的診斷。監(jiān)測病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。46HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022 檢測原理P24抗原的檢測通常是采用ELISA夾心法，已知抗體包被固相反應(yīng)板孔底，加入待測血清，若血清中含有P24抗原則與包被抗體形成抗原-抗體復(fù)合物，再加入酶（HRP）標(biāo)記的HIV-1抗體與抗原結(jié)合，加底物顯色，在酶標(biāo)儀上讀結(jié)果。47HIV感染的血清學(xué)檢測10/2/2022檢測原理P24抗原的檢測通常是采用ELISA夾心法，已知抗體為了提高檢測血清中P24抗原的敏感性，需先將血清中免疫復(fù)