淺議青霉素結(jié)合蛋白測定技術(shù)

1、淺議青霉素結(jié)合蛋白測定技術(shù)【論文關(guān)鍵詞】氘標(biāo)記青霉素結(jié)合蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳熒光放射自顯影【論文摘要】當(dāng)前,細菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重,給臨床治療帶來困難,對-內(nèi)酰胺類抗生素而言,某些菌青霉素結(jié)合蛋白(pbps)改變造成的耐藥性,是-內(nèi)酰胺類抗生素的特點。一般細菌的pbps當(dāng)前,細菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重,給臨床治療帶來困難,對卜內(nèi)酞胺類抗生素而言,某些菌青霉素結(jié)合蛋白(pbps)改變造成的耐藥性,是卜內(nèi)酞胺類抗生素的特點。一般細菌的pbps均為胞漿膜上的蛋白質(zhì),是細菌致死的靶位。它的數(shù)目、位置、親和力的變化造成與卜內(nèi)酞胺類抗生素不易結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。人們常采用sds聚丙烯酞胺凝膠電泳和放射自顯影的

2、方法研究pbps圖譜,以便理解敏感菌和耐藥菌的區(qū)別。所以,pbps測定技術(shù)是研究壓內(nèi)酸胺類耐藥性的重要手段l。的穿透力弱,用一般放射自顯影法不能獲得pbps圖譜,需采用熒光閃爍劑增效的“熒光放射自顯影法。國內(nèi)有關(guān)pbps測定技術(shù)報道甚少,以3h標(biāo)記者更少,本文介紹這一技術(shù)。1材料與方法1.1材料垂直板凝膠電泳槽(吳縣科研儀器廠);ng一l型真空凝膠枯燥器(太倉電視機廠);tgll一1a型臺式高速冷凍離心機(中科院上海生物化學(xué)研究所);8438一超低溫冰箱(fraslentifi。,美國);電泳儀dy一1型(上海醫(yī)用分析儀器廠);丙烯酞胺(aerylaide,臨海止學(xué)廠產(chǎn));甲撐雙丙烯酞胺.(b

3、ig;瑞士產(chǎn)品);n,n,n,n一四甲基乙二胺(teed,上海前進農(nóng)場制劑廠);3h標(biāo)記青霉素乙酞呱陡鹽(neengiandnulear,美國);x光底片(天津感光材料廠;kdakdiangnstiefilx一atar13x18e);2,5一二苯基嗯哇(pp,閃爍純,上海試劑一廠);月桂酞肌氨酸鈉(sarksyl,siga);十二烷基硫酸鈉(sds,上海新華化工廠);二甲基亞礬(ds,北京旭東化工廠)。1.2方法參加不同濃度的氖標(biāo)記青霉素37保溫10in,在冰浴中參加5非標(biāo)記青霉素g鈉鹽20萬單位/l,冷凍離心5000:/inl仇,棄去上清,菌體沉淀用50以磷酸緩沖液(ph6.8)做成菌懸液,

4、然后參加5一10拼一20%sarksyl,37保溫10in使細胞溶解,參加30協(xié)一樣品緩沖液,煮沸3in,置室溫備用。別離膠(10%):aerylaide:bis(30:0.5)6.7l,tris(ph8.8,1.5l/l)5l,10%sds0.2l,蒸餾水8.1l,真空攪拌10一15in除去氣體,再參加teed,濃縮膠(5%):按上述配方依次為1.7l,2.5l,0.1而,5.6l,7.5,和150。先配制別離膠,灌注直立式電泳槽后,使凝膠凝固。次日參加濃縮凝膠,放入加樣梳,靜置2h。在加樣槽內(nèi)依次分別參加pbps樣品。接通電流,第一小時維持電壓在60v,至染料前沿到達別離膠和濃縮膠交界處調(diào)

5、高電壓至120v,走完全程約需3一4h,用考馬斯藍r250染色30一45in,過夜脫色?？菰锲鬟M展真空枯燥,將凝膠片和x光底片貼緊,置于x光射線暗匣內(nèi),放超低溫冰箱一70使曝光1zr,將x光底片顯影,定影,沖洗得到pbps的放射自顯影圖譜。x光底片預(yù)曝光條件:(1)國產(chǎn)x光底片用照相閃光燈紅色濾光片,加6層紅色玻璃紙濾過,x光底片上覆蓋6層紅色玻璃紙,間隔 50,閃光燈閃二次;(2)進口x光底片預(yù)曝光用x光機最小功率100a40kv,間隔 40e,每張x光底片曝光0.04s。參加不同濃度的甲氧西林保溫3710in,然后參加飽和量的氛標(biāo)記青霉素,37保溫10in,再按上述方法繼續(xù)進展實驗。2結(jié)果

6、與討論本法測定肺炎鏈球菌全細胞中pbps的含量,首先需要別離菌體蛋白,為使菌體蛋白濃度維持在一定的程度上,必須控制菌齡和菌液濃度。菌液濃度約fu/l。肺炎鏈球菌破碎細胞的方法以采用離子型去污劑sarksyl為宜,它能選擇性地作用于胞漿膜(3),使胞漿膜破裂,菌體蛋白釋放出來,與此同時,已經(jīng)與青霉素結(jié)合的膜蛋白pbps也一起釋放出來。樣品制備完畢,煮沸3in,以便除去某些蛋白質(zhì)的干擾,青霉素與pbps結(jié)合較結(jié)實,不會被破壞。本實驗采用sds一page方法(4-5),sds在別離膠與濃縮膠中的終濃度均為0.1%。別離膠濃度為10%,濃縮膠濃度為5%。氖標(biāo)記物穿透力較弱,用一般放射自顯影方法不能得出

7、圖象,本實驗采用熒光放射自顯影法(6-8)(flur,aphy),檢測聚丙烯酞胺凝膠片上3h標(biāo)記的蛋白質(zhì),有一定的優(yōu)點。pp是熒光增效劑,其作用原理不是直接依賴sh放射出來的日射線,而是藉助3h上的日粒子與pp互相作用發(fā)射出的光,造成x光底片的部分發(fā)黑得到深淺不同的暗線,從而獲得青霉素結(jié)合蛋白的圖譜。肺炎鏈球菌的pbps圖譜上可見有三條區(qū)帶,即p即;(a,b),pbpz和pbp3。一般情況下,青霉素濃度越大,親和力越強,顏色越深,在競爭性試驗中,甲氧西林濃度越大,親和力越強,顏色越淺。據(jù)報道(7-9),x光底片預(yù)曝光可增加熒光放射自顯影法的靈敏度,.因為預(yù)曝光可以糾正樣品放射性和x光底片圖象吸

8、收值之間的非線性關(guān)系,所以,經(jīng)預(yù)曝光的x光底片上所得到的圖象可以正確反映出樣品的放射性分布情況。用國產(chǎn)x光底片不經(jīng)預(yù)曝光時,無圖象出現(xiàn),經(jīng)預(yù)曝光那么有圖象出現(xiàn)(見圖1),用進口x光底片未經(jīng)預(yù)曝光者,圖象的暗線區(qū)別不大(見圖2)。預(yù)曝光后的x光底片顯示出暗線深淺不同的正確圖象(見圖3)。國產(chǎn)x光底片與進口x光底片比較,國產(chǎn)片敏感性較低,預(yù)曝后的x光底片上出現(xiàn)的暗線普遍較淺且細,pbpi。不可見。參考文獻5zighelbis.ehanisfresistanetpeniillininstrelrta1981,7(3):1696bannerra,hskeyra.afildetetinethdfrtritiu-labelledprteinsandnuleiaidsinplyarylaidegels.9rajbiahe1974;48,837laskeyra,illsad.quantitativefildetetinf3handinplyarylaidegelsbyflurgraphy.eurjbpl1nr1975;58;3338illiasnr,hakenbekr,tasza.isrnvinteratinf(ilataan