氨肽酶抑制劑對(duì)全反式維甲酸誘導(dǎo)人急性早幼粒白血病細(xì)胞株NB4細(xì)

1、氨肽酶抑制劑對(duì)全反式維甲酸誘導(dǎo)人急性早幼粒白血病細(xì)胞株NB4細(xì)【摘要】為了研究氨肽酶抑制劑烏苯美司bestatin對(duì)全反式維甲酸ATRA誘導(dǎo)人APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞分化作用的影響及其可能機(jī)制，NB4細(xì)胞經(jīng)bestatin和ATRA單用或結(jié)合應(yīng)用途理一定時(shí)間后，用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)D11b表達(dá)，四氮唑藍(lán)NBT復(fù)原實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分化細(xì)胞功能，RT-PR法檢測(cè)-y和-EBPRNA表達(dá)，esternblt檢測(cè)-y蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示：NB4細(xì)胞經(jīng)100g/lbestatin和10nl/LATRA結(jié)合處理72小時(shí)后，其分化的形態(tài)更明顯；100g/lbestatin與不同濃度ATRA結(jié)合處理7

2、2小時(shí)，能增強(qiáng)NB4細(xì)胞的NBT復(fù)原才能，與單用相應(yīng)濃度ATRA組相比，差異顯著P0.01；從48-96小時(shí)，100g/lbestatin能增強(qiáng)10nl/LATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞的NBT復(fù)原才能，且呈時(shí)間依賴(lài)性，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)ATRA組相比，差異明顯P0.01；與單用10nl/LATRA組相比，ATRA10l/L)和bestatin100g/l聯(lián)用途理72小時(shí)，NB4細(xì)胞D11b陽(yáng)性表達(dá)率明顯增加P0.01；與單用10nl/LATRA組相比，聯(lián)用100g/lbestatin處理4小時(shí)后，NB4細(xì)胞-yRNA表達(dá)的降低更明顯P0.05；50、75、100g/lbestatin與10nl/LATRA

3、結(jié)合處理8小時(shí)后，NB4細(xì)胞-y蛋白表達(dá)程度明顯降低，與單用ATRA組相比差異顯著P0.05；藥物聯(lián)用各組NB4細(xì)胞-y蛋白表達(dá)程度與NBT復(fù)原才能之間呈負(fù)相關(guān)r=-0.940，p=0.017；與100g/lbestatin聯(lián)用不能增強(qiáng)10nl/LATRA上調(diào)-EBPRNA的表達(dá)；50、75、100g/lbestatin單獨(dú)處理對(duì)NB4細(xì)胞的分化無(wú)影響。結(jié)論：氨肽酶抑制劑bestatin可以增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，這可能與bestatin協(xié)同ATRA下調(diào)-y的表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞株EffetfAinpeptidaseInhibitrnDifferentiatinInduti

4、nAtivityfAll-transRetiniAidinHuanAutePryelytiLeukeiaNB4ellsandItsehanisAbstratThisstudyaspurpsedtinvestigatehetherainpeptidaseinhibitr，bestatin，anptentiateall-transretiniaid(ATRA)-induingdifferentiatininNB4ells，andtexplreitsehanis.TheNB4ellsereexpsedtEitherbestatinandATRAalnerinbinatin，therphlgialha

5、ngesfNB4ellserebservedbyptialirspy，theD11bexpressinaseasuredbyflytetry，thefuntinfdefferentiatinellsasanalyzedbynitrblue-tetrazliu(NBT)redutinassay，theRNAexpressinsf-yand-EBPinNB4ellseredetetedbyRT-PR，the-yprteinexpressinasdeterinedbyesternblt.Theresultsshedthattreatentithbestatinalneinduednsignifian

6、thangesinrphlgy，NBTredutinativityandD11bexpressininNB4ells.NB4ellsinubatedith10nl/LATRAplus100g/lbestatinshedrerphlgifeaturefetayelyteandbandneutrphilthanATRAalnetreatedells.100g/lbestatinenhanedtheNBTredutinativityinNB4ellsinduedbyvariusnentratinsfATRA(10，20，40nl/L).TheeffetsfvariusnentratinsfATRAi

7、nbinatinith100g/lbestatinerestatistiallydifferentfrtheeffetfATRAalne(P0.01).Fr48t96hurs，100g/lbestatintie-dependentlyinreasedNBTredutininNB4ellsinduedby10nl/LATRA(P0.01).10nl/LATRAplus100g/lbestatinfr72hursprinentlyelevatedD11bexpressininNB4ellsasparedithATRAalnetreatedNB4ells(P0.01).Thereasasubstan

8、tialdereasein-yRNAlevelshen100g/lbestatinasaddedt10nl/LATRA(P0.05).Variusnentratins(50，75，100g/l)fbestatinbinedith10nl/LATRAdn-regulatedtheexpressinf-yprtein，hihasnegativelyrrelatediththeNBTredutinativityfNB4ellsinduedby10nl/LATRAalnerplusbestatinatvariusnentratins(r=-0.940，P=0.017).Hever，100g/lbest

9、atinplus10nl/LATRAuldntindueanysignifianthangesinthelevelsf-EBPRNAasparedithATRAalnetreatedNB4ells.ItisnludedthatanainpeptidaseinhibitrbestatinanptentiateATRA-induingdifferentiatinfNB4ells，pssiblybydn-regulating-yexpressininsynergyithATRA.Keyrdsbestatin;ATRA;ellline，NB4;differentiatin氨肽酶抑制劑烏苯美司besta

10、tin能抑制氨肽酶N/D13和亮氨酸氨基肽酶活性，通過(guò)增強(qiáng)宿主免疫功能及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用1，2。有研究提示，bestatin可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞的分化1，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。我們以NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)形態(tài)、功能和外表分化抗原等多層次實(shí)驗(yàn)研究，理解bestatin是否能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化及或?qū)TRA的誘導(dǎo)分化作用的增強(qiáng)效應(yīng)，并初步討論其可能的機(jī)理。材料和方法主要試劑Bestatin、ATRA均購(gòu)于Siga公司。bestatin以無(wú)菌去離子水溶解為1g/l，分裝之后-20保存；ATRA以無(wú)水乙醇溶解成10-5l/L的儲(chǔ)存液，4避光保存，使用時(shí)用RPI1640細(xì)胞培養(yǎng)液將其稀釋為相

11、應(yīng)工作濃度。NBT為BBI公司產(chǎn)品，以PBS配成0.1%溶液，過(guò)濾除菌后4避光保存，使用前1周內(nèi)配制。RPI1640為Gib公司產(chǎn)品。胎牛血清為JRH公司產(chǎn)品。D11b-FIT標(biāo)記單克隆抗體為T(mén)eteh公司產(chǎn)品。D13-PE標(biāo)記單克隆抗體為BetnDikinsn公司產(chǎn)品。TRIzL試劑為Gib公司產(chǎn)品，-LV逆轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA合成酶為Prega公司產(chǎn)品。鼠抗人-y單克隆抗體-33及羊抗人-Atin多克隆抗體I-19均為Santaruz公司產(chǎn)品，使用時(shí)以TBST液分別按1500和11000稀釋。EL顯色液為Santaruz公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理人APL細(xì)胞株NB4細(xì)胞浙江大學(xué)腫瘤研究所

12、惠贈(zèng)及人髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，置37、5%2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天傳代1次。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為7104/l，以不同濃度ATRA和bestatin單獨(dú)或結(jié)合處理，于不同時(shí)間搜集細(xì)胞進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察取空白對(duì)照組及藥物處理各組細(xì)胞懸液，離心，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，用光學(xué)顯微鏡Leia，4010觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。四氮唑藍(lán)nitrblue-tetrazliu，NBT復(fù)原實(shí)驗(yàn)按文獻(xiàn)3報(bào)道的方法進(jìn)展。空白對(duì)照組及藥物處理各組細(xì)胞與NBT共孵育后，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下10010觀(guān)察，胞漿內(nèi)含有藍(lán)黑

13、色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。細(xì)胞外表分化抗原D11b和D13的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL-60細(xì)胞和NB4細(xì)胞或藥物處理后各組NB4細(xì)胞離心，用PBSpH7.4洗滌，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2105/50l，加D13-PE標(biāo)記單克隆抗體8l或D11b-FIT標(biāo)記單克隆抗體5l，避光孵育30分鐘，用PBS洗滌，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以ellquest1.2軟件進(jìn)展分析。細(xì)胞總RNA提取和RT-PR反響總RNA提取用TRIzL一步法抽提細(xì)胞總RNA，按試劑說(shuō)明書(shū)操作。甲醛變性凝膠電泳證實(shí)為完好RNA，紫外分光光度儀定量，A260n/280n比值均在1.8-2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄反響樣品總R

14、NA4g及隨機(jī)引物0.5g，705分鐘，立即冰浴，離心。依次加5逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5l、10l/LdNTP1.25l、-LV200U，RNase抑制劑0.6l，DEP水補(bǔ)至反響體積為25l，于2710分鐘，3760分鐘，7210分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰浴1分鐘，完畢反響。PR反響PR引物為上海Sangn公司合成。引物序列、反響條件及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。反響體系包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2l、10PR緩沖液2.5l、25l/Lgl21.5l、10l/LdNTP0.5l、25l/L(-y與-EBP)或2.5l/L(-atin)上游及下游引物各0.5l、TaqDNA聚合酶1U，用滅菌去離子水補(bǔ)至終體積為25l。預(yù)實(shí)驗(yàn)確定產(chǎn)

15、物與循環(huán)之間呈線(xiàn)性關(guān)系范圍。取5l反響產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠含0.5g/l溴化乙錠電泳，電場(chǎng)強(qiáng)度5V/，紫外燈下觀(guān)察電泳結(jié)果，用凝膠成像系統(tǒng)BI-RAD公司掃描分析條帶灰度，以目的基因與-atin的灰度比做半定量分析。Table1.Sequenesfpriers，nditinfPRandsizesfPRprduts略esternblt搜集藥物處理各組細(xì)胞細(xì)胞數(shù)為2106/l，預(yù)冷的PBS漂洗2次，重懸于100lLaiulis上樣緩沖液0.125l/LTris-Hl，pH6.8，4%SDS，5%甘油中，超聲波裂解，于4離心13000g15分鐘，搜集上清，蛋白樣品保存于-80。按蛋白定量試劑盒

16、Bi-Rad公司操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)展蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜以5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，分別與抗人-y和抗人-atin抗體及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育。EL顯色，顯影于膠片。圖像分析處理系統(tǒng)IageStatin2000R掃描，測(cè)定條帶的面積和灰度，以二者之乘積進(jìn)展半定量比較分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，以XD表示，多組間比較F檢驗(yàn)后采用方差分析及Tukey檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearsn相關(guān)。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果NB4細(xì)胞外表有D13的表達(dá)NB4細(xì)胞D13陽(yáng)性表達(dá)率為94.79%平均熒光強(qiáng)度為1739.59，對(duì)照組HL-60細(xì)

17、胞D13陽(yáng)性表達(dá)率為95.49%平均熒光強(qiáng)度為3107.49。兩者的D13平均熒光強(qiáng)度有一定的差異，但陽(yáng)性百分率差異不明顯。Bestatin與ATRA結(jié)合處理后NB4細(xì)胞形態(tài)改變明顯100g/lbestatin單獨(dú)作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。10nl/LATRA單獨(dú)作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞呈現(xiàn)局部分化的形態(tài)，細(xì)胞核/漿比例減小，核變小有凹陷。100g/lbestatin與10nl/LATRA結(jié)合處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞形態(tài)分化更加明顯，細(xì)胞漿內(nèi)空泡增多，核凹陷、扭曲更加明顯，形態(tài)似晚幼粒及桿狀核粒細(xì)胞的細(xì)胞增多圖1。Bestatin與ATRA結(jié)合應(yīng)用后NB4細(xì)胞NBT復(fù)原才能

18、明顯增加以一定濃度50、75和100g/lbestatin單獨(dú)處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞的NBT復(fù)原才能無(wú)明顯改變與空白對(duì)照組相比較，P0.05；不同濃度10、20和40nl/LATRA作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞的NBT復(fù)原才能呈濃度依賴(lài)性增加，與空白對(duì)照組相比，差異明顯。100g/lbestatin與不同濃度ATRA結(jié)合處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞的NBT陽(yáng)性率明顯地進(jìn)步，與單用相應(yīng)濃度ATRA組相比，差異顯著表2。Table2.EffetfbestatinntheNBTredutinativityfNB4ellsinduedbyATRA.(略)100g/lbestatin單獨(dú)處理細(xì)胞不同時(shí)間

19、48小時(shí)-96小時(shí)，NB4細(xì)胞的NBT復(fù)原才能改變不明顯與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組相比，P0.05；10nl/LATRA處理細(xì)胞至72小時(shí)，開(kāi)場(chǎng)出現(xiàn)NB4細(xì)胞NBT復(fù)原才能的增強(qiáng)，并呈時(shí)間依賴(lài)性，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，有明顯差異；而10nl/LATRA與100g/lbestatin結(jié)合處理48小時(shí)，就出現(xiàn)NB4細(xì)胞NBT復(fù)原才能的明顯增強(qiáng)，且此作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)單用10nl/LATRA組相比，差異顯著圖2。Bestatin與ATRA結(jié)合處理后NB4細(xì)胞D11b表達(dá)明顯增強(qiáng)100g/lbestatin單獨(dú)處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞D11b陽(yáng)性表達(dá)率FI為13.40.6稍有增加，

20、但與對(duì)照組FI為12.30.9相比，差異不顯著P0.05。10nl/LATRA單獨(dú)處理72小時(shí)之后，NB4細(xì)胞D11b陽(yáng)性表達(dá)率FI為19.24.2明顯進(jìn)步，與對(duì)照組相比，差異顯著P0.01；100g/lbestatin與10nl/LATRA結(jié)合處理72小時(shí)后，NB4細(xì)胞D11b陽(yáng)性表達(dá)率FI為31.08.4的進(jìn)步更加明顯，與單用10nl/LATRA組相比，差異明顯P0.01圖3。Bestatin和ATRA單獨(dú)及結(jié)合處理后NB4細(xì)胞-EBPRNA表達(dá)的變化NB4細(xì)胞低表達(dá)-EBPRNA。10nl/LATRA處理12小時(shí)之后，NB4細(xì)胞-EBPRNA表達(dá)程度明顯進(jìn)步，與對(duì)照組相比較，差異顯著(P

21、0.01)；100g/lbestatin處理12小時(shí)之后，NB4細(xì)胞-EBPRNA的表達(dá)程度無(wú)明顯變化；其與10nl/LATRA結(jié)合處理也未能增強(qiáng)ATRA上調(diào)-EBPRNA表達(dá)的作用表3。Table3.EffetsfbestatinandATRAnexpressinf-yRNAand-EBPRNAfNB4ells(略)Bestatin和ATRA單獨(dú)及結(jié)合處理后NB4細(xì)胞-y表達(dá)的變化NB4細(xì)胞-yRNA呈高程度表達(dá)。10nl/LATRA單獨(dú)處理4小時(shí)后，NB4細(xì)胞-yRNA表達(dá)下降，與空白對(duì)照組相比較，差異明顯P0.05。100g/lbestatin單獨(dú)處理4小時(shí)后，NB4細(xì)胞-yRNA表達(dá)程

22、度改變不明顯；但100g/lbestatin與10nl/LATRA結(jié)合處理4小時(shí)后，NB4細(xì)胞-yRNA表達(dá)程度降低更明顯，與單用ATRA組相比，差異顯著P0.05圖4，表3。Figure4.EffetfbestatinandATRAntheexpressinf-yRNAfNB4ellsaftertreatentfr4hurs.:arker;Lane1:ntrl.Lane2:bestatin(100g/l).Lane3:ATRA(10nl/L).Lane4:bestatin(100g/l)+ATRA(10nl/L).NB4細(xì)胞-y蛋白呈高表達(dá)。10nl/LATRA單獨(dú)處理8小時(shí)后，NB4細(xì)胞-

23、y蛋白表達(dá)程度明顯下降P0.01。50、75、100g/lbestatin分別單獨(dú)處理8小時(shí)后，NB4細(xì)胞-y蛋白表達(dá)程度無(wú)明顯改變；但50、75、100g/lbestatin均能與10nl/LATRA協(xié)同下調(diào)NB4細(xì)胞-y蛋白的表達(dá)程度，與單用ATRA組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05圖5。不同濃度0、50、75、100g/lbestatin與10nl/LATRA結(jié)合處理的各組NB4細(xì)胞-y蛋白表達(dá)程度與NBT復(fù)原才能之間呈負(fù)相關(guān)r=-0.940，P=0.017圖6。討論ATRA對(duì)APL的有效治療是白血病誘導(dǎo)分化治療的成功典范。但單用ATRA治療易復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐藥，與其他化療藥物聯(lián)用時(shí)療效有一

24、定的進(jìn)步，但毒副反響增加。因此，尋找可以增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用而毒副反響輕的藥物，成為臨床治療中的關(guān)注問(wèn)題之一7，8。最近，Hiran等7根據(jù)NBT復(fù)原實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出，bestatin可能增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，但未做進(jìn)一步的研究。本研究通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、功能和外表分化抗原等多層次的檢測(cè)及分析比照，說(shuō)明一定濃度范圍的bestatin本身不能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化，但確能增強(qiáng)ATRA對(duì)NB4細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。Hiran等7認(rèn)為，bestatin增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)分化作用可能與其抑制細(xì)胞外表D13活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與HL-60細(xì)胞相似，NB4細(xì)胞外表D13陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)94.79%，該藥是否通過(guò)抑制D13表達(dá)從而增強(qiáng)ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的作用，尚待進(jìn)一步研究證實(shí)