倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡原理、使用與注意事項(xiàng)

1、倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡的使用XXX,YYY,ZZZ（版權(quán)所有,僅限個(gè)人1倒置相差顯微鏡倒置相差顯微鏡,是將相差顯微鏡和倒置顯微鏡相結(jié)合的產(chǎn)物,倒置相差顯微鏡 既具有倒置顯微鏡的倒置觀察方式,同時(shí)又具有與相差顯微鏡相一致的成像原理。因此,研究倒置相差顯微鏡的工作原理就需分別研究倒置顯微鏡和相差顯微鏡 的工作原理。1.1倒置顯微鏡的工作原理:倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣,主要包括三部分:機(jī)械部分、照明部分、光 學(xué)部分。其中與普通顯微鏡有明顯區(qū)別的是:物鏡與照明聚光系統(tǒng)的相對(duì)位置。相 比于普通顯微鏡,倒置顯微鏡的物鏡與照明聚光系統(tǒng)以載物臺(tái)為軸顛倒位置,物鏡在 載物臺(tái)之下,照明系統(tǒng)在在載物臺(tái)之上

2、。這樣的構(gòu)造使得照明聚光系統(tǒng)與載物臺(tái)的 有效距離可以顯著擴(kuò)大,便于放置培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等較厚的待觀察器具,而同時(shí) 物鏡與材料之間的工作距離不必很大。圖1.1倒置顯微鏡由于倒置顯微鏡觀察的材料一般都是培養(yǎng)的細(xì)胞，透明性大，結(jié)構(gòu)對(duì)比不明顯，故 倒置顯微鏡常配備相差物鏡，實(shí)際上也就構(gòu)成了倒置相差顯微鏡（圖1.1。1.2相差顯微鏡的工作原理：1.2.1光學(xué)知識(shí)鏡檢時(shí)，視場(chǎng)中的樣品只有在其透射光的波長（顏色和振幅（亮度與周圍介質(zhì)有明 顯變化時(shí)，才能被眼睛所分辨。照明光線通過無色透明的物體時(shí)，透射光的波長和振 幅都不發(fā)生明顯改變，尤其是振幅，幾乎無變化。所以用普通光學(xué)顯微鏡觀察時(shí)，難以 辨清這樣物體的結(jié)

3、構(gòu)，必須借助于固定和染色等理化方法，使樣品和背景的透射光在 波長或振幅上發(fā)生變化，即在顏色和亮度上有所差異，以供識(shí)別束光線在透過折射率n不同的透明介質(zhì)后，產(chǎn)生的衍射光和透過的直射光的波長沒有明顯變化,只是衍射光的振幅稍小于直射光,這也是透明不均質(zhì)物質(zhì)產(chǎn)生些 許明暗變化的原因，但這點(diǎn)變化很小，并不能有效分辨。變化明顯的是衍射光相對(duì) 透射光在相位上有1/4的滯后，雖然人眼不能分辨相位的差別,但可以分辨振幅和波 長的變化。相差顯微鏡就是利用這點(diǎn)，將相位的差別轉(zhuǎn)變成振幅的變化，也就是將 本來均為透明但折射率不同的各個(gè)結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)出明暗差距，從而可以被清楚地分辨?？梢姽夤饩€通過介質(zhì)水或其他小分子勻質(zhì)物質(zhì)時(shí)，

4、由于介質(zhì)分子遠(yuǎn)小于可見光 波長，故而光的衍射現(xiàn)象并不明顯，可以說透射光是直射光。但當(dāng)可將光透過細(xì)胞結(jié) 構(gòu)或其他粒徑與入射光波長相近的物質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生明顯的衍射現(xiàn)象，透射光轉(zhuǎn) 化為衍射光。也就是說，細(xì)胞等常見觀察物的結(jié)構(gòu)大小剛好可以使可將光產(chǎn)生衍射 現(xiàn)象。相差顯微鏡就是利用這點(diǎn)。光波通過小顆粒的物體后產(chǎn)生直射光和衍射光， 衍射光的光波振幅小，相位滯后。在光學(xué)系統(tǒng)中，這種直射光和衍射光相遇或光的疊 加，振幅發(fā)生變化，光線或明或暗，就是光的干涉現(xiàn)象。1.2.2相差顯微鏡結(jié)構(gòu)相差顯微鏡不同于普通光學(xué)顯微鏡，在裝置上有四種必不可缺的部件:相差物鏡 （內(nèi)有相板、具有環(huán)狀光闌的轉(zhuǎn)盤聚光器、合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡

5、和綠色的濾色鏡。122.1 相差物鏡（phase contrast objective相差物鏡與普通物鏡的主要區(qū)別在于具有相板結(jié)構(gòu)（圖1.2，相板（phase plate是 由光學(xué)玻璃制成的，利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，將直射光和衍射光的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎?幅差。RearFocalP由mPhase RingRearFocalP由mPhase RingPhase C artrast O bjecti vei ApertufeLens- EmemObjctiv&-BareF :Figure 1圖1.2相差物鏡（示相板在圓形相板的平面上，有一圈與周圍（里外相板厚度不同的或凸凹的圓環(huán)（圖1.3。相板分兩部分：

6、（1共軛面（conjugate area :通常為環(huán)狀，是通過直射光的部分。其環(huán)是凸起的，也可 能是凹陷的。（2補(bǔ)償面（complemetary area:共軛面內(nèi)外兩側(cè)部分，是通過衍射光的部分。在相板的共軛面或補(bǔ)償面上，涂有改變光波相位或吸收光線的物質(zhì)，通常為氟化 鎂。當(dāng)光線通過時(shí)，使光波的相位或振幅改變，從而達(dá)到不同的目的與觀察效果。圖1.3相板的種類及構(gòu)造左上:吸收直射光的明反差相板平面和剖面圖;左下:吸收直射光的暗反差相板剖 面圖;右上:吸收衍射光的明反差相板平面和剖面圖;右下:吸收衍射光的暗反差相板 剖面圖;黑色:吸收光線層;淺色:推遲相位層;白色:玻璃。相板的種類比較多，對(duì)光的吸收

7、率高低不同，所以產(chǎn)生不同的反差效果，從反差上 大致可分下列兩類（圖1.4:（1明反差（bright contrast或負(fù)反差（negative contrast:是指在相差顯微鏡的視場(chǎng)中, 物像亮度大于背景亮度的現(xiàn)象。在被檢物體的折射率大于周圍介質(zhì)時(shí)，直射光被相 板的共軛面（因?yàn)樵诠曹椕嫔贤坑懈淖兿辔缓臀展饩€的物質(zhì)推遲1/4波長,同時(shí)吸 收80%90%,振幅變小，致使僅由直射光照射的背景變暗。通過補(bǔ)償面的衍射沒有變 化，由于直射光推遲1/4波長，兩者（直射光與衍射光有完全相同的相位,合成波P等于 直射光S與衍射光D之合，即P=S+D,故振幅加大。所以被檢物體比只有直射光照射 的背景亮得多。（

8、2暗反差（dark contrast或正反差（positive contrast:是指在相差顯微鏡的視場(chǎng)中， 背景亮度大于物像亮度的現(xiàn)象。與明反差相反,把通過補(bǔ)償面（因?yàn)樵谙喟宓难a(bǔ)償面 上涂有改變光波相位的物質(zhì)的衍射光推遲1/4波長，使衍射光與直射光的相位相差 1/2波長，同時(shí)，直射光在共軛面（上涂吸光物質(zhì)被部分吸收（可能是為了避免背景過亮 影響觀察。由于兩者在像點(diǎn)相互干涉的結(jié)果，使合成波（P=S-D振幅變小，被檢物像的 影像比背景顯著變暗。圖1.4明反差與暗反差左:明反差,直射光（S與衍射光（D相位相同,兩波干涉結(jié)果合成波P=S+D,振幅加 大;右:暗反差，直射光與衍射光相位相差1/2波長,

9、兩波干涉結(jié)果合成波P=S-D，振幅 變小。由上所述,正是由于相板的存在,相差顯微鏡才具有其特殊的分辨能力。在相差 物鏡內(nèi)的后焦面上裝有種類不同的相板,因而物鏡在明暗反差上可區(qū)分為兩大類,即 明反差（B或負(fù)反差（N物鏡和暗反差（D或正反差（P物鏡。物鏡的反差類別,用英文 字母B或N或D或P標(biāo)志在物鏡外殼上，并兼有高H（High、中M（Medium和低 L（Low等三種不同的反差。有的相差物鏡用ph字樣的標(biāo)示。同一反差類別的物鏡，依放大率的不同，又可分為10 x、20 x、x40、和100 x數(shù)種, 因此,相關(guān)物鏡種類頗多,一套可多達(dá) 20余種。相差物鏡多為消色差物鏡或平場(chǎng)消色差物鏡（PL。1.2

10、.2.2 轉(zhuǎn)盤聚光器（turret condenser位于鏡臺(tái)之下，普通聚光器的所在位置上，由聚光鏡和環(huán)狀光闌（annular diapheragm構(gòu)成。環(huán)狀光闌位于聚光鏡之下，是一種特殊的光闌裝置,由大小不同的 環(huán)狀通光孔構(gòu)成,不同規(guī)格的通光孔環(huán)狀光闌裝配在一個(gè)可旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上,按需 要調(diào)轉(zhuǎn)使用（圖 1.5。環(huán)狀光闌的環(huán)寬與直徑各不相同，與不同放大率的相差物鏡內(nèi) 的相板相匹配，不可濫用。轉(zhuǎn)盤前端朝向使用者一面有標(biāo)示窗（孔，轉(zhuǎn)盤上的不同部位 標(biāo)有0、 1、 2、 3和4或0、 10、 20、 40和100字樣，通過標(biāo)示窗顯現(xiàn)。 “0”表示非相 差的明視場(chǎng)的普通光闌。 1或10、 2或20、 3或

11、40和4或100，表示與相應(yīng)放大率 的相差物鏡相匹配的不同規(guī)格的環(huán)狀光闌的標(biāo)志。通過手動(dòng)轉(zhuǎn)入的標(biāo)示窗內(nèi)之?dāng)?shù)字， 表示該數(shù)字所代表的環(huán)狀光闌已進(jìn)入光路。標(biāo)示孔明示場(chǎng)光IW圖1.5轉(zhuǎn)盤聚光器的構(gòu)造122.3 合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡（centering telescope合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡簡稱CT,又名合軸調(diào)中目鏡。它是眼透鏡，可行升降調(diào)節(jié)，具有 較長的焦距的一種望遠(yuǎn)目鏡。鏡筒較長，其直徑與觀察目鏡相同。它的功用僅作為 環(huán)狀光闌的環(huán)孔（亮環(huán)與相差物鏡相板的共軛面環(huán)孔（暗環(huán)的調(diào)中合軸與調(diào)焦之用。 相差顯微鏡使用時(shí)，轉(zhuǎn)盤聚光器的環(huán)狀光闌與相差目鏡必須匹配，且環(huán)狀光闌的孔環(huán) 與相差物鏡相板共軛面的環(huán)孔在光路中要準(zhǔn)確合

12、軸，并完全吻合或重疊。以保證直 射光和衍射光各行其路,使成像光線的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姷恼穹?。但是，鏡體的光 路中前述兩環(huán)的影像較小，一般目鏡難以辨清，不能進(jìn)行調(diào)焦與合軸的操作，所以必須 借助合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡。1.2.2.4 綠色濾色鏡（green filter相差物鏡的種類,從色差消除情況來分，多屬消色差物鏡（achromatic objective或 PL物鏡。消色差物鏡的最佳清清晰范圍的光譜區(qū)為510630nm。欲提高相差顯微 鏡的性能最好以波長范圍小的單色光照明，即接物鏡最佳清晰范圍的波長的光線進(jìn) 行照明。所以，使用相差物鏡時(shí)，在光路上加用透射光線波長為500600nm左右的綠 色濾色鏡,

13、使照明光線中的紅光和藍(lán)光被吸收，只透過綠光，可提高物鏡的分辨能力。 該濾色鏡兼有吸熱的作用，以利活體觀察。1.2.2.5相差顯微鏡的光路與成像相并顯微鏡的照明光束，由轉(zhuǎn)盤聚集器環(huán)狀光闌的環(huán)狀孔射入聚光鏡，透射載物 臺(tái)上的被檢樣品，經(jīng)樣品后，入射光除透射的直線光外，同時(shí)產(chǎn)生衍射光。衍射光的振幅較小，相 位滯后。直射光和衍射光進(jìn)入物鏡，前者由環(huán)狀的共軛面、后者由較大的補(bǔ)償面透 過相板，前后相互干涉造像。樣品的影像由直射光（S和衍射光（D經(jīng)干涉后的合成波 （P造成，即P=SD;背景僅由直射光形成。由于直射光和衍射光兩種光波的相位差異 不同造成不同的反差效果，或明反差或暗反差不等視所用物鏡的相板類別而

14、定。成 像光束由物鏡射入目鏡，在目鏡的視場(chǎng)光闌處再次放大，并由出射光瞳射出目鏡。（圖 1.6光源圖1.6相差顯微鏡光路圖根據(jù)上述原理和結(jié)構(gòu)所制成的顯微鏡便是相差顯微鏡。1.2.3相差顯微鏡的使用1.2.3.1相差物鏡的調(diào)換安裝從物鏡轉(zhuǎn)換器上拆下普通物鏡，旋入相差物鏡,與普通目鏡配套使用123.2轉(zhuǎn)盤聚光器的調(diào)換安裝旋轉(zhuǎn)聚光器升降螺旋,把普通明視場(chǎng)聚光器至最低位,旋松固緊螺絲,卸下聚光 器。把轉(zhuǎn)盤聚光器安放到相應(yīng)位置上,旋緊固緊螺絲,轉(zhuǎn)動(dòng)聚光器升降螺旋,使聚光器 升至最高位置。轉(zhuǎn)盤聚光器的標(biāo)示孔,朝向操作者。此時(shí),轉(zhuǎn)盤聚光器上面的聚光鏡 部分,進(jìn)入光路;下面的環(huán)狀光闌轉(zhuǎn)盤,可視需要轉(zhuǎn)動(dòng)使用,把與

15、物鏡匹配的環(huán)孔旋入 光路,使之處于轉(zhuǎn)盤聚光鏡下。轉(zhuǎn)盤聚光器調(diào)換安裝后,要進(jìn)行合軸調(diào)中,使聚光器的光軸與顯微鏡的主光軸合 一。其步聚如下:(1 把轉(zhuǎn)盤聚光器的環(huán)狀光闌調(diào)至“0位”,明視場(chǎng)照明的普通可變光闌進(jìn)入光路。(2旋轉(zhuǎn)聚光器升降螺旋,聚光器升至最高位。(3 接通照明光源,使視場(chǎng)明亮。(4把被檢樣品放到載物臺(tái)上,用低倍(4x物鏡聚焦。(5縮小鏡座上的視場(chǎng)光闌開孔,至最小。(6 從目鏡觀察,在暗視場(chǎng)中可見一縮小的、明亮的、多角形的視場(chǎng)光闌圖像。(7 轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤聚光器的兩個(gè)調(diào)中桿,推動(dòng)聚光器,把視場(chǎng)中的明亮的多角形的視場(chǎng) 光闌圖像,調(diào)至視場(chǎng)中央。(8開放視場(chǎng)光闌至視場(chǎng)同大,視兩者周邊是否完全重合;否

16、則,復(fù)用調(diào)中螺桿,使 聚光器精神調(diào)中。1.2.3.3 把綠色濾色鏡放入鏡座的濾色鏡架上。1.2.3.4相板圓環(huán)與環(huán)狀光闌圓環(huán)的合軸調(diào)中相差物鏡的后焦面裝有相板。按物鏡放大率與反差效果的不同,相板圓環(huán)(共軛 面的大小與結(jié)構(gòu)亦不同。轉(zhuǎn)盤聚光器的環(huán)狀光闌為一系列的透光的,不同大小的明 亮環(huán)孔,與不同放大率的物鏡相應(yīng)。使用時(shí)嚴(yán)格匹配,當(dāng)物鏡更換時(shí),環(huán)狀光闌亦作相 應(yīng)的更換或調(diào)整。在視場(chǎng)中觀察所見,環(huán)狀光闌為一明亮的圓環(huán),而相板的圓環(huán)為一暗環(huán)。互相匹 配的明環(huán)與暗環(huán)大小一致。在使用時(shí)兩者要合軸,互相重疊。兩環(huán)的重疊,須通過合 軸調(diào)節(jié)方能取得。其方法如下:(1 相差物鏡與環(huán)狀光闌的匹配:正確地匹配取決于所

17、用物鏡放大率。例如,當(dāng)使用40 x相差物鏡時(shí),環(huán)狀光闌轉(zhuǎn)向ph3或40位，使相應(yīng)地環(huán)狀光闌進(jìn)入光路。(2把CT放入目鏡筒:從目鏡筒取出一個(gè)目鏡,換入調(diào)中合軸望遠(yuǎn)鏡(CT。CT為 一眼透鏡,也是可行升降調(diào)節(jié)的望遠(yuǎn)目鏡,專為觀察視場(chǎng)中明環(huán)與暗環(huán)圖像之用。因 為用一般目鏡看不見兩環(huán)的清晰圖像。CT在使用前眼透鏡應(yīng)處于最低位，即CT為 最短小的狀態(tài)。(3明環(huán)與暗環(huán)的聚焦:一手固定位于目鏡筒中的CT鏡筒,使其透鏡位置不能上 移，另一手逆時(shí)針轉(zhuǎn)到CT上部可調(diào)的眼透鏡部分。轉(zhuǎn)動(dòng)的同時(shí)，通過CT向現(xiàn)場(chǎng)中觀 察，剛旋轉(zhuǎn)時(shí)，兩環(huán)可能為模糊的圖像，繼續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)CT目鏡可調(diào)部分至清晰地窺見明環(huán) 與暗環(huán)止。 (圖 1.7圖

18、5-12光環(huán)與相板的合軸過程乩未調(diào)正狀態(tài)* b.近調(diào)正狀態(tài);c. (E常態(tài)圖1.7光環(huán)與相板的合軸過程(4明環(huán)與暗環(huán)的調(diào)中重疊:相板的暗環(huán)是固定不動(dòng)的，處于光路之中,暗環(huán)的中心, 即顯微鏡光軸的中心。環(huán)狀光闌的亮環(huán)可調(diào)節(jié)移動(dòng)。轉(zhuǎn)盤聚光器環(huán)狀光闌的位置， 因聚光器的可調(diào)其中心位置，往往偏離光軸軸心，需調(diào)整，使其歸中。環(huán)狀光闌的調(diào)中 裝置或部件,因廠家或型號(hào)的不同而有別。如OLYMPUS BH2-PC型相差顯微鏡，環(huán) 狀光闌調(diào)中裝置為位于轉(zhuǎn)盤聚光器兩側(cè)的兩個(gè)伸縮自如的調(diào)中螺桿,用以操縱改變 環(huán)狀光闌的方位，達(dá)到調(diào)中;而Nikon FIVORPHOT型顯微鏡的相差裝置，其環(huán)狀光闌 的調(diào)中部件為位于轉(zhuǎn)

19、盤聚光器表面，可向任一方向滑動(dòng)的環(huán)狀鈕。調(diào)中時(shí)，手指調(diào)中 裝置，移動(dòng)明環(huán)，使之與暗環(huán)合一。在兩環(huán)調(diào)中過程，始終在通過CT的觀察下進(jìn)行。在調(diào)節(jié)過程中，如亮環(huán)比暗環(huán)小，并位于暗環(huán)內(nèi)側(cè)時(shí)，應(yīng)降低聚光器位置，使亮環(huán)放 大。若亮環(huán)大于暗環(huán)時(shí)，應(yīng)提升聚光器，使亮環(huán)縮小。如聚光器已升至最頂點(diǎn)還不能 完全重合，可能是載玻片過厚之故(5回裝觀察目鏡:待相差物鏡的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的亮環(huán)調(diào)中、重疊后,從目鏡筒 中取出CT,放回觀察用的接目鏡，以便鏡檢觀察。1.2.3.5 相差物鏡的選擇 相差物鏡有不同倍率、不同反差類別和反差程度之分。相差物鏡的反差類別和 反差程度以及放大倍數(shù),皆用英文字母和數(shù)字標(biāo)示在物鏡殼中(表1.

20、1。20XPH20倍正反差反差程度高20XPM40倍正反差反差程度中等lOOxPLIOO倍正反差反差程度低40XNH40倍負(fù)反差反差程度高40XNM40倍負(fù)反差反差程度中等100XNL100倍負(fù)反差反差程度低100XDH100倍暗反差反差程度高40XDM40倍暗反差反差程度中等20XDL20倍暗反差反差程度低10XBH10倍明反差反差程度高20XBM20倍明反差反差程度中等40XBL40倍明反差反差程度低表 1.1 物鏡標(biāo)示解讀相差鏡檢時(shí),依被檢樣品的種類、結(jié)構(gòu)和反差程度的不同,而確定應(yīng)選用相差物 鏡的種類。這不存在死硬的規(guī)定,可依觀察者的習(xí)慣和愛好而變。通常是哪一種相 差物鏡都能得到清晰的像

21、，只是有的物鏡更好些而已，因此可任意選擇。暗反差物鏡 對(duì)習(xí)慣于明視場(chǎng)鏡檢者適宜。當(dāng)與染色標(biāo)本進(jìn)行比較或進(jìn)行測(cè)定以及加強(qiáng)半透明物 體的反差時(shí),多用暗反差;而計(jì)算數(shù)量或觀察物體運(yùn)動(dòng)以及研究極小的樣品時(shí),多使用 明反差。一般來說，相差物鏡的應(yīng)用范圍如表1.2。字母反差應(yīng)用D/P暗/正觀察細(xì)胞或細(xì)胞核的內(nèi)部結(jié)構(gòu)B/N明/負(fù)觀察微小的物體如孢子、鞭毛和活的樣品等H高當(dāng)樣品反差較低時(shí)L低當(dāng)樣品反差較高時(shí)M中當(dāng)樣品反差為中等時(shí)表1.2物鏡應(yīng)用范圍（引自相關(guān)作者總之,在相差鏡檢時(shí)，于諸多的相差物鏡中選一物鏡，絕非易事。除參考上表所列 應(yīng)用范圍外，最佳方法是通過各種類型的相差物鏡進(jìn)行實(shí)際鏡檢測(cè)定,找出最宜相差

22、物鏡。1.3倒置相差顯微鏡圖 1.8 倒置相差顯微鏡如圖 1.8即為倒置相差顯微鏡,可以看到整體的倒置構(gòu)造,以及聚光器、環(huán)形光 闌、相差物鏡等結(jié)構(gòu)。前面已經(jīng)介紹了倒置顯微鏡和相差顯微鏡的原理以及使用方法。倒置相差顯微 鏡就是二者的組合體,其原理與使用方法也就是二者的原理與使用方法,一一對(duì)應(yīng),不 再贅述。2熒光顯微鏡2.1 熒光概念熒光是物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài),再回到低能狀 態(tài)時(shí)釋放出的光,是非溫度輻射光,又稱冷光。依據(jù)產(chǎn)生原因,熒光可分為:化學(xué)熒光 （氧化還原反應(yīng)發(fā)出的熒光、光化熒光（光源激發(fā)而產(chǎn)生的熒光、生物熒光、放射熒 光四種。熒光顯微鏡應(yīng)用的是光化熒光，通常利用

23、紫外光（320-400nm激發(fā)熒光物質(zhì)， 產(chǎn)生可見光熒光,多余的能量以熱能放出?？梢哉J(rèn)為是被檢物體自己發(fā)出可見光,從 而被觀察到。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。對(duì) 被檢物體來說，熒光產(chǎn)生方式有兩種:自發(fā)熒光，經(jīng)過紫外光照射直接發(fā)出熒光;繼發(fā) 熒光，被觀察物體經(jīng)過熒光染料處理之后，經(jīng)過紫外光照射才能發(fā)出熒光。細(xì)胞中有 些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后產(chǎn)生自發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光， 但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)出繼發(fā)熒光，熒光染料種 類很多（表 1.3名稱濃度（處理時(shí)間（min吖啶橙 0.11.00.53熒光紅 0.11.

24、00.53伊紅 Y0.112金色胺 0.11.00.53酸性品紅 0.112玫瑰紅 B0.1110瑰紅 G0.10.00113甲基綠 0.10.0113剛果紅 0.112中性紅 0.10.0055數(shù)小時(shí)硫酸黃連素 0.10.0021數(shù)小時(shí)表 1.3 常用熒光染料使用濃度及處理時(shí)間一覽表注:被檢物經(jīng)熒光染料處理后,熒光的顏色基本與染料的顏色相似,但在不同波長 紫外線的激發(fā)下,其顏色也有差異。2.2熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)與原理熒光顯微鏡利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源,經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光（如 紫外光365nm或紫藍(lán)光420nm作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不 同顏色的熒光后,再通過物鏡和目

25、鏡的放大進(jìn)行觀察（圖 2.1。這樣在強(qiáng)烈的對(duì)襯背 景下,即使熒光很微弱也易辨認(rèn),敏感性高,主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等 的研究。圖2.1熒光顯微鏡2.2.1熒光顯微鏡分類熒光顯微鏡按照明方式可分為落射式和透射式兩類。落射式熒光顯微鏡是近代 發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，其激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作 為照明聚光器和收集熒光的物鏡。透射式熒光顯微鏡較為原始，其激發(fā)光源是通過 聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。2.2.2落射式熒光顯微鏡落射式熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。 更適用于不透明及半透明標(biāo)本,如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀

26、察。落射式熒光顯微鏡的構(gòu)造主要包括:汞燈光源、激發(fā)濾板、雙色束分離器（分色 鏡和壓制濾板四部分（圖2.2。 -objectII圖2.2落射式熒光顯微鏡光路圖222.1汞燈光源汞燈光源發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡 普遍采用?，F(xiàn)在多采用100200W的超高壓直流汞燈作光源，它是用石英玻璃制作， 中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅 速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)5070個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需 515mi n。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射 光量子的結(jié)果。超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。

27、因此，燈室必須有良好的散熱條件,工作環(huán)境溫度 不宜太咼。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動(dòng)一次工作 時(shí)間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。因此，使用時(shí)盡量減 少啟動(dòng)次數(shù)。燈泡在使用過程中,其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能 重新啟動(dòng)。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉,以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極,一般需要等 15min。超高壓汞燈（100W或200W光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。在 燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng),燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡,前面安 裝有集光透鏡。2.2.2.2激發(fā)濾板熒光光源采用超高壓汞燈,它可

28、發(fā)出各種波長的光,但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn) 生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長,所以需要加用激發(fā)濾板（一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色 激發(fā)濾片,僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上,而將其他光都吸收掉。根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn),可選用以下四類激發(fā)濾板,以便提供一定波長范圍 的激發(fā)光。紫外光激發(fā)濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可 見光通過。常用型號(hào)為UG-1或UG-5,外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。紫外藍(lán)光激發(fā)濾板:此濾板可使300450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號(hào)為ZB-2 或 ZB-3,外加 BG-38。紫藍(lán)光激發(fā)濾板:它可使350490nm的光通過。常用型號(hào)為QB2

29、4（BG12。藍(lán)綠光激發(fā)濾板:最大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達(dá)明色素可用之 （如B-7激發(fā)。近年開始采用金屬膜干涉濾板,由于針對(duì)性強(qiáng),波長適當(dāng),因而激發(fā)效果比較玻璃 濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板，均遠(yuǎn) 比玻璃濾板效果好。激發(fā)濾板分薄厚兩種,一般暗視野選用薄濾板,亮視野熒光顯微鏡可選用厚一 些?；疽笫且垣@得最明亮的熒光和最好的背景為準(zhǔn)。2.2.2.3 雙色束分離器光路中需加上一個(gè)雙色束分離器（分色鏡,它與光鈾呈 45 度角,激發(fā)光被反射到 物鏡中,并聚集在樣品上,樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射 的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)

30、入物鏡,反回到雙色束分離器,使激發(fā)光和熒光分開,殘余激發(fā)光再被 壓制濾板吸收。2.2.2.4 壓制濾板 每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長 更長的可見熒光。熒光具有專一性， 一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒 光，在物鏡后面需加壓制濾板。它的作用有二：一是吸收 和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目 鏡、以免干擾熒光和損傷眼睛。二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒 光色彩。 2.2.3 透射式熒光顯微鏡 透射式熒光顯微鏡常用暗視野集光器，也可用普 通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到 標(biāo)本上這是比較舊式的熒光顯微 鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光 減弱所以對(duì)觀

31、 察較大的標(biāo)本材料較好。 透射式熒光顯微鏡的主要構(gòu)造包括：汞燈光源、激發(fā)濾 板、暗場(chǎng)聚光鏡、壓制濾板四部分（圖 2.3）。 圖 2.3透射式熒光顯微鏡光路圖 2.2.3.1 暗視野聚光鏡 透射式熒光顯微鏡與落射式熒光顯微鏡的主要結(jié)構(gòu)的功能相 似，如激發(fā)濾板、暗視野聚光鏡、 壓制濾板等。其中暗視野聚光器需進(jìn)行主要介 紹。暗視野聚光鏡又稱暗場(chǎng)聚光鏡，在熒光顯微鏡中 的應(yīng)用日益廣泛。因?yàn)榧ぐl(fā) 光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡，可以使用 薄的激發(fā) 濾板，增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無色濾板 （不透 過紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度

32、和反襯度， 提高了圖像的質(zhì)量，觀察 舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒?？梢?說，暗視野聚光鏡是將激發(fā)光匯聚，隔絕可 見光，維持暗場(chǎng)的特殊聚光鏡。2.3熒光顯微鏡使用2.3.1熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求載玻片：載玻片厚度應(yīng) 在0.8 1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo) 本上聚集。載玻片必須光潔， 厚度均勻，無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載 玻片。 蓋玻片：蓋玻片厚度在 0.17mm 左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用 干涉蓋玻片，這是一 種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長的光起不同干涉作用的 物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使 熒光順利通過，而反射激發(fā)光，

33、這種反射 的激發(fā)光還可激發(fā)標(biāo)本。標(biāo)本：組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，應(yīng)控制在 10um左右為好，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部 不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷。采用 石蠟制片時(shí)。必須徹 底脫蠟，因?yàn)槭灡旧砜砂l(fā)青色熒光。玻片最好用瑩石玻璃制成的。 封裱劑： 封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時(shí)較 亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸鹽緩沖液的等 量混合液作封裱劑。 鏡油：一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須 使用鏡油，最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也

34、可 用，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。 2.3.2熒光顯微鏡使用方法 打開燈 源，超高壓汞燈要預(yù)熱15min才能達(dá)到最亮點(diǎn)。透射式熒光顯微鏡需在光源與 暗視野聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝 上相應(yīng)的壓制濾片。 落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片、雙色束分離器、壓 制濾片的插塊。用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光 源中心，使其位于整個(gè)照明 光斑的中央。 放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。 使用 中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起 眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本 時(shí)，必須用無熒光的特殊油鏡；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需 待汞燈完 全冷卻后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。 觀察。 例如： 在熒光顯 微鏡下用藍(lán)紫光濾光片， 觀察到經(jīng) 0.01吖啶橙熒光染料染色的細(xì)胞， 細(xì)胞核和 細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光（暗綠色和橙紅色。 2.3.3 熒光顯微鏡使用注 意事項(xiàng) 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。 應(yīng)