單克隆抗體的制備

1、單克隆抗體的制備.抗原的制備：全病毒作為抗原病毒特定蛋白作為抗原動物免疫融合：(1)骨髓瘤細胞準(zhǔn)備脾淋巴細胞準(zhǔn)備飼養(yǎng)細胞準(zhǔn)備細胞融合雜交瘤細胞的檢測及篩選陽性雜交瘤細胞的亞克隆腹水的制備吼吼吼，俺是分界線，吼吼吼單抗特性的鑒定：(1)單抗效價測定單抗特異性鑒定雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性鑒定單抗的反應(yīng)性：(1)間接ELISA試驗間接免疫熒光試驗微量細胞培養(yǎng)中和試驗抗原制備（一）全病毒作為抗原收獲病毒直接收獲病毒培養(yǎng)上清液（馬立克是細胞結(jié)合性病毒，不能用此法）培養(yǎng)細胞反復(fù)凍融-離心（30000rpm離心1h）-重懸（用什么溶液重懸,TNE可以嗎）- 收獲病毒2仮復(fù)凍融三次使細胞破碎釋放出病毒（1）

2、提純濃縮病毒PEG沉淀法3慢慢攪動并加入NaCl終濃度是）.5mol/L有助于病毒的沉淀，再量加入10%PEG（ 般使用PEG6000）4 C過夜或放置一段時間8000r/mir離心30分鈍收集病毒沉定；病毒沉淀中加入適量PBS 4C過夜；1000r/mii離心1小時。沉淀即為農(nóng)縮的病毒（2）提純濃縮病毒一一蔗糖密度梯度離心法配制25%, 35%, 45%, 55%, 65%蔗糖溶液4用長針管抽取2ml蔗糖溶液，從離心管的底部注入（濃度由低到高）抽取lml病毒液沿管壁緩慢注入6.38000rpm,2h 離心7用注射針抽取離心后出現(xiàn)的病毒條帶&用2mL的PBS溶解測病毒濃度（用紫夕分光光度計測蛋

3、白質(zhì)濃度AQ80C保存?zhèn)湟徊《镜膬龃妫ň唧w程序是什么）使用滅菌過的1次性塑料凍存管貼上標(biāo)簽，標(biāo)上菌（毒）號及時間，備甩血清可用過濾滅菌牛奶要先脫脂用離心方法去余上層油脂一般在1O0C間歇煮沸23次 每次1030min,備用。在最適宜的培養(yǎng)條件下將細胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期進行純度僉查后，與保護劑混合均勻分裝 微生物咅養(yǎng)物濃度以細胞或孢子不少于1010個/ml為宜（二）病毒特定蛋白作為抗1原核表達載體的構(gòu)建目的基因引物設(shè)計PCR擴增目的片段選取適當(dāng)帶標(biāo)簽的表達載體與目的片段進行連接轉(zhuǎn)化獲得陽性質(zhì)粒。蛋白表達：將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達感受態(tài)細胞挑菌J、搖至OD值在0.4-0.之間時 添加IPTG誘導(dǎo)蛋白

4、表達IPTG濃度：O.l-l.Ommol/l誘導(dǎo)溫度禾和時間37C h30C h2C 2h1C 7h對誘導(dǎo)的大腸桿菌菌液6000rpn離心 10min用1:1OOPBS重懸細菌超聲波破碎細胞檢測蛋白質(zhì)是上清表達還是包涵體表達蛋白質(zhì)勺純化若蛋白質(zhì)是上清表達，根據(jù)標(biāo)簽直接進行純化若蛋白質(zhì)是包涵體表達 先用尿素分離為上清再純化菌體破碎一離心一等電點沉淀一親和層析二動物免疫將濃縮后的病毒抗原稀釋成濃度為00ug/m或蛋白濃度（有具體的濃度馬）選取5只6周齡左右雌性BALB/c小、鼠第一次免疫：將抗原與等量的弗氏完全佐劑充分乳化腹部皮下多點注，劑量）.2-0.4mL/ 只（蛋白腹部皮下注射100ug）第

5、二次免疫：23周，將抗原與等量弗氏不完全佐齊充分乳化皮下多點注射0.2-0.4mL只（蛋 白腹腔主射100ug）第三次免疫：2周，方法和劑量同第二次測血青抗體效介一周，斷尾采血ELISA包板測效價選擇效價高的小鼠，用不加佐劑的抗原尾靜脈注射加強劑疫O.lml/只（蛋白為腹腔注射 100ug）6.3d后取小鼠脾細胞與SP2/（細胞融合（一）骨髓瘤細胞的準(zhǔn)備1融合前兩周：開始復(fù)蘇骨髓瘤細胞SP2/0,擴大培養(yǎng)融合時確保SP2/0處于對數(shù)生長期（如 何確定骨髓瘤細胞處于對數(shù)生長期，有良好的形態(tài)（骨髓瘤細胞勺正常形態(tài)是什么樣的）活細胞計數(shù) 高 于95%2融合當(dāng)天,用DMEM不完全培養(yǎng)基將細胞從瓶壁輕輕

6、吹下收集于SOmL離心管內(nèi)3.1OOOr/n離心I Omin棄去上青4加入30mLDMEM不完全培養(yǎng)基同法離心洗滌一次5將細胞重懸于IOmLDMEM不完全培養(yǎng)基中混勻制成細胞懸液（二）脾淋巴細胞的準(zhǔn)備加強免疫后3d :加強免疫的雌生BALB/c小鼠,摘除眼球采血作為陽性血清對照頸椎脫臼致外鼠浸泡于75%酉精消毒其表10min瀝干小鼠，隨即放超凈臺內(nèi)的軍剖板上 腹部朝匕四肢固定鈍性分離腹膜 無菌取出脾臟，用無血青含雙抗的DMEM于1個皿中，一個用來洗脾并用鑷子除去 附著的結(jié)締組織脾臟移入200目微孔濾網(wǎng)上于新鮮含雙抗DMEM中,用研磨棒輕輕研磨將脾臟制成單細胞懸液可 用吸耳球吹打吧），并移至I

7、OmL離心管中或?qū)椫糜谛迈r含雙抗DMEM中，用5ml注射器的針頭朿脾 來回吹推出脾細胞，lOOOrpn離心6min棄上清20mlDMEM重懸細胞，清洗一遍，lOOOrpn離心6min 棄上清20mlDMEM重懸細胞，無5）置于37C, 5%Cq細胞培養(yǎng)箱中自然沉降1H5min,吸取上清中的細胞懸液棄去肉眼可見組織或 團塊2（三）飼養(yǎng)細胞的準(zhǔn)備1將陰性BALB/c小鼠摘除眼求采血分離血青,作為抗體檢測時的陰性對照血清。-37C30min,4C 過夜，次日6000rpn離心10min2同時頸脫位致死小鼠于75%酉精中浸泡Omin,腹部向上固定砒菌剪開腹部皮膚子剝離皮 膚,暴露腹膜,酒精棉球擦拭腹

8、膜消毒皿中加入0mlHAT完全培養(yǎng)液 用注射器注射L至腹腔注意不要穿入腸管手固觸射器 將針頭留置在腹控內(nèi)右手持酒精棉球輕輕按摩腹部lmin,僅可抽吸2-3次,注入培養(yǎng)液后再吸出培養(yǎng)液將皿中液體混勻，加入6孔板，100ul/FL, 37C，5%Cq細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察無污染方 可使用（四）細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)1取計數(shù)后的SP2/（細胞與脾淋巴細胞按1:51:1的比例混合于50mL離心管中，1000r/mii離心10min棄上青，用酒精棉擦離心管口。用手掌輕擊離丿心瓦 底使沉淀的細胞打散在離心管架j來回拉動，充分混勻至糊狀將離心瓶底放入40-41C水浴中邊旋轉(zhuǎn)邊加入融 合用的PE

9、GlmL（50%37C預(yù)熱），在lmin內(nèi)加完，一滴一滴加，不可吹吸，可輕輕混勻4.37C水浴靜置）0s繼續(xù)旋專同時力叭無血清DMEM15mL在90s內(nèi)加完，由慢到快,前5s加1mL室溫靜置lomin后，l000r/mii離心 10min,棄上青將HAT選擇培養(yǎng)液力叭至細胞融合物中,懸浮細胞分配至己有飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板,100ul孔，四周多加液，以防蒸干&置于37C, 5%CO細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)9.5d后用新鮮預(yù)熱的HAT培養(yǎng)基換出一半培養(yǎng)基10.10d后用預(yù)熱的HT換出HAT11第三次用20%勺FBS12.觀察雜交瘤細胞的生長情況,待其細胞培養(yǎng)上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時

10、（大約 在細胞融合后15天），吸取適量細胞上青進行抗體檢測四.雜交瘤細胞的檢測及篩選細胞融合后 15天即可進行雜交瘤細胞的檢測和篩選 間接ELISA方法來篩選陽性克隆1融合 10d換液后待雜交瘤細胞生長至培養(yǎng)孔1/1（或者培養(yǎng)上清變黃時吸取待檢孑孔上清100uL加 入上述檢測板孔中同時設(shè)立陽性融合前免疫小鼠眼球采血制備的陽性血篩選時作為陽性對）陰 性（非免疫小鼠疇采血制備勺血清作為陰,對照）和空白對照（以PBST作為空白對照調(diào)零孔，37C孵 育lh,同前洗滌拍干2棄去孔內(nèi)的液體，同時用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，拍干。3每孔加200ul封閉液4C過夜或37C封閉2小時；該步驟對于一些抗原，可

11、省略。洗滌液洗3次；此時包被板可-20C或4C保存?zhèn)溆谩?每孔加50-100ul待檢雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，同時設(shè)立陽性、陰性對照和空白對照；37C孵育1-2小時；洗滌，拍干。6加酶標(biāo)第二抗體，每孔50-100ul，37C孵育1-2小時，洗滌，拍干。7加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul, 37C10-30分鐘。&以2mol/L H2S04終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫閱讀儀上讀取OD值。9結(jié)果判定：以P （待檢孔）/N（陰性孔）三2.1即為陽性。若陰性對照孔無色或接近無 色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結(jié)果。五陽性雜交瘤細胞的亞克隆對篩選出的陽性克隆株通過有限稀釋去進行亞克隆一般

12、需要四次1采用有限稀釋法對連續(xù)兩次檢測為陽性的細胞株進行克隆化克隆前制備小鼠飼養(yǎng)細胞層3將計數(shù)后的雜交瘤細胞準(zhǔn)確地進行系列稀釋，直至每毫升含10個細胞，按每孔接種0.1ml 細胞懸液，即每孔含1個細胞。4.37C、7.5% CO2濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下 觀察，標(biāo)出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。5取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養(yǎng)，并凍存（1）凍存將雜交瘤細胞（或其他細胞）離心，重新懸浮于預(yù)冷的凍存液中，濃度為106-107左右 /ml，分裝安瓶，每瓶1ml，置冰浴上;安瓶上表明細胞名稱、凍存日期、批號等。安瓶封口后仍置冰浴上。將安瓶放入一帶收口

13、繩的小布袋內(nèi)，布袋上表明凍存號、細胞名稱等，立即將布袋放入吸 管筒內(nèi)，置-70 C冰箱。2-4小時后或過夜后從-70C冰箱取出吸管筒，將盛有細胞布袋移入液氮罐；在布袋的線 繩上作好標(biāo)記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細記錄。液氮罐應(yīng)定期補充液氮（最好是專人管理）；補充液氮及存取細胞時應(yīng)帶保護眼鏡和手套， 以免因液氮凍傷等。用間接ELISA連續(xù)險測雜交瘤細胞養(yǎng)上清液中的抗體效價六腹水的制備選81碉齡體重20g以上的雌性BALB/c鼠,腹腔注射滅菌液體石蠟0.5ml只2.1周后，腹腔i射雜交瘤細胞（2xl0護一5xl0細胞/只）3在動物復(fù)咅明顯曾大時用16號針頭從腹腔采集腹水4.3000r/mii離

14、心 10min取上青液測定效價后一80C凍存?zhèn)溆闷邌慰固匦缘蔫b定（一）單抗效介測定將培養(yǎng)液上清和腹水倍比稀其中培養(yǎng)液上清采用倍倍比稀釋腹水先按：10稀釋,再按2倍倍 比稀釋采用間接ELISA的方法。（二）單抗特異性鑒定抗原病毒及其他相近病毒，收集病毒液凍融3次,12000r/min,4C離心10min,取上清包被96孔酶標(biāo)板3分別與單抗進行間接ELISA試驗4同時收集相對應(yīng)的未接毒的細胞經(jīng)相同處理包被96孔酶標(biāo)板，平行試驗以排除背景反應(yīng)（三）雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性鑒定將雜交瘤細胞進行連續(xù)傳代，每隔一周測定其間接ELISA效價，一直傳至20代以評價其 分泌抗體的穩(wěn)定性八單抗的反應(yīng)性（一）可接

15、ELISA試驗（二）間接免疫熒光試驗1用48孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞當(dāng)細胞長滿單層時接種適量病毒同時 設(shè)未接毒的正常細胞作為陰性對照培養(yǎng)5d至病變長至40%時棄去培養(yǎng)基3用PBS洗滌3次每次5min用一20預(yù)冷的甲醇4固定10min用PBS洗滌3次每次imin,在吸水紙上拍干分別滴加1:50稀釋的腹水單抗,37C作用1.5h用PBS洗滌3次每次imin,在吸水紙上拍干&加入1:20（稀釋的羊抗鼠FITC IgG作用45min用PBS洗滌3次每次imin,在吸水紙上拍干在熒光顯微鏡下觀察出現(xiàn)特異性的亮綠色熒光者為陽性反之判為陰性（三）微量細胞培養(yǎng)中和試驗1采用固定病毒稀釋血清的方法用病毒感染細胞檢測

16、單抗腹水對胞的保護力，將5種腹水分別做:& 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512倍 稀釋與等量的I00TCID的病毒混合37C水浴lh,50將每一稀釋度的病毒腹水混合物接種到長滿單層細6孔板中每一滴度加個孔37C,5%C（2培養(yǎng) 逐日觀察病變并記錄試驗設(shè)單抗腹水對!組，病毒對組和維持液對!組，計算1保護50%細胞不出 現(xiàn)病變細胞的腹水稀釋度溶液配制不完全DMEM培養(yǎng)基：DMEM 13.37g,超純水或四蒸水980ml, NaHCO 3.7g,雙抗溶液10ml, 100XL.G.溶液10ml，用1N HC1調(diào)試PH至7.2-7.4,過濾除菌，分裝4C保存。HAT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基98ml, HT貯存液1ml, A貯存液1ml。HT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基99ml, HT貯存液1ml。氨基喋呤（A）貯存液（100X, 4X10-5mol/L） 稱取 1.76mg 氨基喋吟（Aminop terinMW 440.4）,溶于90ml超純水或四蒸水中，滴加1