重組結(jié)核分枝桿菌Mr 38 000蛋白的表達(dá)、純化和鑒定

1、重組結(jié)核分枝桿菌Mr 38 000卵白的表達(dá)、純化和斷定摘要從h37rv基因組中擴(kuò)增r38000卵白基因并高效表達(dá)和純化。用pr技能從結(jié)核分枝桿菌h37rv基因組中擴(kuò)增r38000卵白序列，將其與pge-t-easy載體毗連轉(zhuǎn)化e.lidh5，構(gòu)建重組克隆載體pge-t-easy/r38000，測(cè)序準(zhǔn)確后將目的基因片斷克隆入pqe-80l原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化e.lidh5，iptg誘導(dǎo)目的卵白表達(dá)。經(jīng)estern-blt斷定目的基因與(his)6交融表達(dá)，將已表達(dá)的卵白質(zhì)通過(guò)ni-nta親和色譜柱舉行純化。pr得到結(jié)核分枝桿菌r38000卵白基因，測(cè)序效果與gebank中報(bào)道的完全同等。sds表

2、現(xiàn)，在r為38.5103處有相應(yīng)的卵白質(zhì)表達(dá)條帶，esernblt斷定為(his)6交融表達(dá)卵白。經(jīng)ni-nta親和色譜柱舉行純化后可得到純化的卵白。樂(lè)成克隆了鐵調(diào)治卵白基因r38000卵白序列，并在e.lidh5高效表達(dá)，親和層析后得到了純化目的卵白。關(guān)鍵詞r38000卵白;表達(dá);純化;結(jié)核分枝桿菌；lning,expressinandpurifiatinfr38000prteinfrybateriutuberulsiszhanging，lijin-heng，linhangkeyrdsr38000prtein;expressin;purifiatin;ybateriutuberulsis(t

3、b)結(jié)核分枝桿菌ybateriutuberulsis,tb是結(jié)核病(tuberulsis,tb)的病原體。其在患者體內(nèi)重要為細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)。診斷要領(lǐng)的短缺是結(jié)核病盛行的緊張緣故原由。如今常用的ppd試驗(yàn)，常使bg疫苗接種者被誤檢為陽(yáng)性1，且對(duì)后期結(jié)核患者敏感性較低，存在顯著不敷。比年來(lái)，有研究創(chuàng)造r38000卵白具有強(qiáng)的免疫原性，而成為結(jié)核分枝桿菌抗原的研究熱門(mén)2,3，大概成為結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑和疫苗研究的候選抗原之一。為此，我們?cè)谠吮磉_(dá)載體中表達(dá)結(jié)核分枝桿菌r38000卵白并對(duì)其舉行了純化，為進(jìn)一步研究其抗原性和重要成效提供便利。質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料tb毒株h37rv、dh5由本室保存;pg

4、e-t-easy及izardpluspurifiatinsyste購(gòu)自prega公司；x-gal，限定性內(nèi)切酶bah,er及t4-dna毗連酶，taqdna聚合酶均為takara公司產(chǎn)物；iptg,dtt,dte,小量質(zhì)粒提取試劑盒均為siga公司產(chǎn)物，膠接納試劑盒為vitagene公司產(chǎn)物。1.2要領(lǐng)2效果2.1r38000卵白片斷的擴(kuò)增及序列測(cè)定經(jīng)30個(gè)循環(huán)pr擴(kuò)增，可得與估計(jì)長(zhǎng)度相稱的片斷圖1。將dna接納后插入pge-t-easy載體，經(jīng)測(cè)序證明所擴(kuò)增的r38000序列與gebank數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄的r38000序列完全同等。:dnaarkerdl2000;1:r38000基因pr產(chǎn)物;圖

5、1pr擴(kuò)增r38000卵白基因產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳10g/l效果2.2表達(dá)載體的構(gòu)建pqe-80l經(jīng)bahi和er雙酶切后與r38000基因目的片斷舉行毗連反響后，轉(zhuǎn)化感覺(jué)態(tài)e.lidh5。挑取的克隆子舉行酶切斷定，切出約1151bp巨細(xì)片斷的為陽(yáng)性克隆子(圖2)，定名為pqe-80l-r38000。:dnaarkerdl2000;1,2:pqe-80lr38000;圖2pqe-80l-r38000重組質(zhì)粒bahi和er雙酶切斷定效果2.3r38000卵白在pqe-80l表達(dá)載體中的誘導(dǎo)表達(dá)將pqe-80l-r38000經(jīng)37活化留宿，經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)后做sds闡發(fā)，從電泳圖中可以看出在r為3

6、8.5103同等處出現(xiàn)了一條表達(dá)帶，表達(dá)量約占菌體總卵白的20%(圖3)。：卵白分子量arker;1:未誘導(dǎo)的pqe-80l-r38000質(zhì)量重組菌e.lidh5;2-4:誘導(dǎo)的pqe-80l-r38000質(zhì)量重組菌e.lidh5;圖3(his)6-r38000交融卵白的sds闡發(fā)2.4目的卵白的斷定所構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)的r38000卵白以帶有6個(gè)組氨酸的交融卵白的情勢(shì)出現(xiàn)，利用鼠抗(his)6ab驗(yàn)證r38000卵白的表達(dá)。效果表如今r為38.5103處有一顯色帶，而比較無(wú)相應(yīng)條帶(圖4)。：卵白分子量arker;1:(his)6-r38000prteinexpressin2.dh5圖4(h

7、is)6-r38000交融卵白的esternblt闡發(fā)效果2.5目的卵白的可溶性闡發(fā)將上清和沉淀別離所制樣品，舉行sds闡發(fā)表白表達(dá)產(chǎn)物重要在細(xì)菌裂解后的沉淀中，而上清中那么很少(圖5)。：卵白分子量arker;1:未誘導(dǎo)的pqe-80l-r38000質(zhì)量重組菌e.lidh5；2：誘導(dǎo)菌超聲裂解后沉淀;3:誘導(dǎo)菌超聲裂解后上清;圖5(his)6-r38000交融卵白的可溶性闡發(fā)2.6目的卵白的純化純化的產(chǎn)物經(jīng)sds闡發(fā)可在r為38.5103處得到一條清楚的條帶(圖6)。：卵白分子量arker;1:未誘導(dǎo)的pqe-80l-r38000質(zhì)量重組菌e.lidh5;2:誘導(dǎo)的pqe-80l-r3800

8、0質(zhì)量重組菌e.lidh5;3,4:(his)6-r38000純化卵白圖6(his)6-r38000交融卵白的表達(dá)及純化3討論r38000卵白是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)卵白，含有對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異單克隆抗體定位的7個(gè)表位，具有較強(qiáng)的抗原性，已經(jīng)得到告終核病研究學(xué)者們的同等成認(rèn)。1992年，bthaley4等以為r38000卵白是研究菌陰性肺結(jié)核最有效的抗原之一。2022年ark5等通過(guò)卵白質(zhì)基因芯片和病人血清挑選，創(chuàng)造r38000卵白是空洞性肺結(jié)核所特有的卵白抗原。本實(shí)行中應(yīng)用的pqe-80l表達(dá)載體為4751bp，起始碼卑劣接有6個(gè)組氨酸，雙鏈環(huán)狀，ap抗性，多克隆位點(diǎn)有17個(gè)單一限定性酶切位點(diǎn)。pr

9、產(chǎn)物共有約1150bp，與r38000卵白基因巨細(xì)相切合。r38000克隆入pqe-80l載體中與6個(gè)組氨酸交融，可產(chǎn)生共約390個(gè)氨基酸的交融卵白，r為38.5103擺布，實(shí)行效果與理論值相切合。交融卵白有(his)6的表達(dá)，因此通過(guò)檢測(cè)組氨酸的表達(dá)，可間接證明r38000卵白表達(dá)，同時(shí)(his)6的表達(dá)為進(jìn)一步純化卵白提供了親和位點(diǎn)，它可與ni+特異性結(jié)合，通過(guò)ni-nta親和色譜柱可得到純化的目的卵白。我們?cè)谠吮磉_(dá)體系中樂(lè)成表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的r38000卵白，并舉行了開(kāi)端斷定和純化，為下一步深化研究r38000卵白的成效奠基了基矗參考文獻(xiàn)1brittnj,palengira.iprvi

10、ngvainesagainsttuberulsisj.iunalellbil,2022:81(1):3445.2rldhealthrganizatinglbaltuberulsisntrl-surveillane,planning,finaning,hrept2022,rldhealthriganizatin,gengeva.3laals,skeikyya.iune-basedethds,intuberulsisandthetuberlebaillusj.aeriansietyfrirbilgypress,ashingtn,d.2022,7183.4bthaleygh,rrudd,ffestenstein.linialvalueftheeasureentfybateriutuberusisspeifiantibdyinpulnarytuberulsisj.zthrax,1992,47:270275.5arkj,sa