中草藥鑒定種特異性DNA探針的篩選方法

1、中草藥鑒定種特異性DNA探針的篩選方法【摘要】基因芯片技術(shù)為中草藥高效、并行、快速鑒定提供了可能。而中草藥種特異性探針的篩選是中草藥基因芯片鑒定技術(shù)開發(fā)的關(guān)劍文章結(jié)合當(dāng)今中藥鑒別芯片和其它物種鑒定芯片研究進(jìn)展總結(jié)了幾種適合中草藥特異性探針篩選的方法?！娟P(guān)鍵詞】基因芯片；中草藥鑒別；種特異；DNA探針Abstrat:DNAhiptehnlgyakesitfeasibletidentifyhineseherbalediinerapidly,effiientlyandinparallel.Thesreeningfspeies-speifiDNAprbesfrediinalplantsisthekey

2、stepindevelpingDNAhipfrtheauthentiatinfhineseherbalediines.binedithurrentDNAhipresearhesnidentifiatinfherbalplantsrtherspeies,seethdsavailablefrthesreeningfediinalplantsspeies-speifiDNAprbeseresuarizedinthispaper.Keyrds：DNAhip;Herbalediine;Speies-speifiDNAPrbe在中藥材基因鑒別和特征性基因測序的基礎(chǔ)上，建立以基因診斷和基因芯片為載體的中藥材

3、分子鑒別技術(shù)和方法是今后中藥生物技術(shù)研究中的努力方向之一1。中藥鑒定的基因芯片技術(shù)是指采用原位合成或顯微打印手段，將中藥種特異性DNA探針固定在玻璃片、尼龍膜或其它支持物表面上，形成二維DNA探針陣列，然后與熒光或DIG標(biāo)記待檢中藥基因組DNA樣本雜交，通過檢測雜交信號來實(shí)現(xiàn)對中藥的準(zhǔn)確、并行、高效地檢測。雖然DNA芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于DNA測序2、單核苷酸多態(tài)性分析3、基因表達(dá)分析4、基因診斷5、藥物篩選6、微生物種類鑒定等7各個方面，但應(yīng)用于中藥鑒定尚處于起步階段，近年來隨著基因芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外一些研究機(jī)構(gòu)已開始研究使用基因芯片對中藥(材)進(jìn)行鑒別8，9。采用基因芯片技術(shù)鑒定中藥

4、的基本過程是10：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)找出待鑒定中藥的特定寡核苷酸序列；以此寡核苷酸序列作為探針，裝配到芯片上；檢測樣品（DNA）的提娶擴(kuò)增和標(biāo)記；雜交檢測及結(jié)果分析。其中找出待定中藥的特定DNA序列（DNA探針）是建立中草藥鑒定基因芯片的關(guān)鍵。本文結(jié)合近年來中藥及其它物種鑒別芯片研究進(jìn)展總結(jié)了幾種可用于中草藥特異性DNA片段篩選的方法，并對這些方法的優(yōu)勢和不足做出評價。1利用現(xiàn)有藥用植物基因資源篩選其特異性片段首先，登錄GeneBank網(wǎng)站，在核酸數(shù)據(jù)庫中檢索研究對象及其相關(guān)種屬的基因序列(如植物的rRNA的ITS序列或微衛(wèi)星序列或某種功能基因)，應(yīng)用分析軟件（如aVetr6.5.1軟件包中的

5、lustalALingnent程序），對這些序列進(jìn)行對齊和分析，得到堿基對齊圖和聚類分析的結(jié)果。然后根據(jù)對齊圖找出具有高度多態(tài)性的區(qū)段，在這一區(qū)段用Priers程序設(shè)計引物并在相應(yīng)區(qū)段結(jié)合lig5.0程序找出所有可能的探針，經(jīng)過篩選后在Genebank中進(jìn)行Blast查詢，篩選出特異性最好的片段作為探針使用。這種方法簡單、快捷，充分利用了現(xiàn)有的基因資源。目前很多微生物檢測探針11,12及植物DNA探針13都是根據(jù)已公開的基因序列設(shè)計的。然而，對于大多數(shù)藥用植物種類，其遺傳背景很不清楚。已注冊的藥用植物DNA序列的數(shù)量相對于總的藥用植物資源非常有限，而且這些已知序列中大多集中在少數(shù)植物種類14，

6、所以，這種方法只適合于遺傳背景比較清楚或已有相關(guān)序列發(fā)布的藥用植物。2通過構(gòu)建的DNA文庫篩選這種方法要求先構(gòu)建DNA克隆文庫或DNA文庫，然后從文庫中隨機(jī)選出若干克隆，將各克隆插入片段斑點(diǎn)印跡在雜交膜上(如硝酸纖維膜、尼龍膜)，用標(biāo)記的本種基因組和其他種基因組的總DNA為探針分別進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，選擇與本種基因組雜交時雜交信號強(qiáng)，而與其他基因組雜交時無雜交信號的克隆，該克隆的插入序列即為本種基因組的特異序列。Q.ai.R.Bullen15從梯牧草屬(Phleu)兩個野生種P.alpinu和P.bertlnii的DNA文庫中分別篩選到它們的特異性探針。首先，提取P.alpinu和P.bertlni

7、i的總DNA，用Sau3AI部分酶切，然后將消化后片段用pU19作為載體克隆到E.liDH5ar.構(gòu)建了P.alpinu和P.bertlnii的部分基因組DNA文庫（P.alpinu含3030個lnies，P.bertlnii含3240個lnies），接著從P.alpinuDNA文庫中選了1230個克隆，從P.bertlniiDNA文庫中選了1320個克隆斑點(diǎn)印跡在膜上，最后和通過缺口平移法采用32P-dTP標(biāo)記的P.alpinu和P.bertlnii總基因組探針雜交，根據(jù)雜交信號挑選到P.alpinu特異性克隆8個，P.bertlnii特異性克隆13個，對其進(jìn)行測序后篩選到3個P.alpin

8、u特異性探針和3個P.bertlnii特異性探針。還有其它通過類似方法篩選到植物種特異性探針的例子16,17。這種方法可以一次篩選大量克隆，能得到相當(dāng)數(shù)量的探針，主要問題是構(gòu)建DNA庫過程比較繁瑣，耗時費(fèi)力，文庫質(zhì)量也會影響篩選效果。再是如果從DNA文庫中篩選，因DNA是切除了內(nèi)含子的DNA序列，而很多內(nèi)含子本身在種間具有高度多態(tài)性（如rDNA中IST序列），這些序列的切除會降低種特異性探針的篩選效率。3從nrDNA篩選因結(jié)構(gòu)和功能上的差異，植物基因組不同部位的序列變異速度很不一致，一般情況編碼區(qū)比較保守，而非編碼區(qū)序列因其功能上的限制較少,比編碼區(qū)表現(xiàn)出更快的進(jìn)化速率，不同種間各編碼序列或非

9、編碼序列的變異方式和速率也是千差萬別。植物細(xì)胞核中編碼rRNA的基因分編碼區(qū)和非編碼區(qū)，其中編碼區(qū)的18S與5.8S，5.8S與26S基因間被兩個非編碼區(qū)ITS1和ITS2所間隔（如圖1所示）。它們共同組成一轉(zhuǎn)錄單位順反子(istrn)，順反子高度重復(fù)(幾百至幾千次),以串聯(lián)的方式排列于核染色體上,并且這些核糖體RNA順反子拷貝表現(xiàn)出高度的均一性(hgenEity)18。據(jù)此特征，可根據(jù)保守區(qū)序列設(shè)計引物，擴(kuò)增出易變異區(qū)DNA片段，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析后，從中篩選出可做為種特異性探針的寡核苷酸序列19。3.1ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))高等植物中nrDNA序列差異主要表現(xiàn)在ITS、ETS及IGS等

10、非編碼區(qū)上。被子植物中ITS序列既具有核苷酸序列的高度變異性又有長度上的保守性。有研究表明18：被子植物大多數(shù)科屬其ITS序列的種間差異值為1.2%10.2%，屬間差異值為9.6%28.8%，這對系統(tǒng)發(fā)育研究來說都是較合適的范圍，也適合從這些序列中篩選種特異性探針。ZhangYB等20將16個不同種屬石斛的ITS1-5.8S-ITS2序列固定于玻片上制作了基因芯片，并用熒光標(biāo)記的ITS2序列作為探針,可檢測出5種已被載入中國藥典的石斛。該基因芯片還可檢測出含有9種不同的中藥材復(fù)方中的石斛。劉建全等21從市售“藏茵陳”藥材中提取DNA,PR擴(kuò)增ITS1-5.8SrDNA-ITS2整個片段，擴(kuò)增產(chǎn)

11、物直接測序得到約700bp片段，采用排序和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件分析“藏茵陳”原植物的親緣關(guān)系，據(jù)此設(shè)計的特異性分子快速鑒定試劑盒可對市場上的藏茵陳進(jìn)行檢測。3.226SrDNAnrDNA編碼區(qū)比較保守，但其中有些可變區(qū)，不同的植物類群，其可變區(qū)變異率有很大差別。對于變異率大的類群，可以據(jù)此從中篩選到鑒別DNA探針。為了對不同種的貝母進(jìn)行區(qū)分，香港城市大學(xué)及香港理工大學(xué)的研究者22設(shè)計了一種基因芯片可有效地對不同種的貝母進(jìn)行區(qū)分。他們首先提取9種貝母球莖的基因組DNA，用引物對(上游引物5-GAGTGGGTTGTTTGGGA-3；下游引物5-GTATTGAGGGAAATT-3)對其26SrDNA基因

12、D2與D3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測序，從其多態(tài)性區(qū)段設(shè)計了各種屬特異性寡核苷酸探針，然后將不同種屬寡核苷探針點(diǎn)置于經(jīng)多聚賴氨酸處理包被的芯片。用來自不同種貝母的熒光素標(biāo)記的PR產(chǎn)物與DNA芯片進(jìn)行雜交，可在芯片特定位置檢測到不同種貝母的熒光信號從而達(dá)到區(qū)分不同貝母的目的。陳月琴等23從采自陜西秦嶺和廣東自然保護(hù)區(qū)的杜仲中提取總DNA，PR擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒載體PTZ19連接，Sanger終止法測定26SrDNA片段，采用計算機(jī)分析軟件Pgene610比較了金縷梅、栓皮櫟、水青樹、領(lǐng)春木及前人測定的8種植物的同源序列，找出其特征性核苷酸序列，為進(jìn)一步開展杜仲的專一性核酸分子探針研究奠定基矗3.35.8SrDN

13、Aarlesaria等24設(shè)計和制作了一種能鑒別有毒中草藥的DNA芯片。芯片中種特異性寡核苷酸探針來源于Anituarihaeli，A.kusnezffi，Alasiaarrrhiza，rtntigliu，等17種中藥的5.8SrRNA基因及Anitupendulu和Stellerahaaejase的Leu-tRNA基因，這些探針通過巰基連接固定在硅片上，靶基因序列通過不對稱PR擴(kuò)增和熒光標(biāo)記后與芯片雜交，通過這種并行的基因分型技術(shù)（parallelgentyping）可以將多種有毒草藥種類鑒別出來。3.418SrDNAG.fragilis是一種產(chǎn)生大量粘液狀物質(zhì)的微藻，在亞德里亞海的大量繁殖

14、時嚴(yán)重影響水產(chǎn)和旅游業(yè)。為了對其進(jìn)行監(jiān)測，F(xiàn).TintiL等25從G.fragilis的18SrDNA中篩選出了可用作檢測海水中G.fragilis的寡核苷酸探針。主要過程是：從培養(yǎng)的G.fragilis細(xì)胞提取其總DNA，用引物對16S1N-16S2N擴(kuò)增其18SrDNA基因，對擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GeneBank中Linguldiniuplyedru,Gnyaulaxspinifera,Prteratiuretiulatu（亞德里亞海中浮生植物群落中常和G.fragilis生長在一起）的同源序列進(jìn)行比對，比對后發(fā)現(xiàn)G.fragilis的18SrDNA核苷酸序列與其它種有明顯的

15、不同，因此可用此序列用于G.fragilis鑒定的特異性探針或制成芯片用于海水中這種有害藻種的常規(guī)監(jiān)測。從上述例子可以看到有些探針的是從rRNA編碼區(qū)基因篩選出來，因這些區(qū)段的保守性，在不同品種間的變化比較有限，難于篩選到有較大差異的長探針，對有些類群的植物甚至難于奏效，如需鑒別的種類較近緣時，從非編碼區(qū)篩選可能會得到更好的結(jié)果。4從葉綠體DNAatK，trnL基因篩選目前常用于生藥分析的葉綠體基因組中的基因片段有核酮糖-1,5-二磷酸酯羧化酶基因(rbL)，編碼成熟酶基因(atK)，編碼RNA聚合酶B亞基基因(rp)，編碼tRNA-lysine基因(trnL)，編碼核糖體大亞基蛋白16基因(

16、rpl16)，編碼核糖體小亞基蛋白4基因(rps4)等26。其中atK基因在葉綠體基因組中的所有編碼蛋白基因中進(jìn)化速率最快，常被用來研究被子植物科內(nèi)水平的近緣關(guān)系研究中。再就是trnL基因，trnL基因內(nèi)有三段非編碼區(qū)，由于不受功能的限制，其進(jìn)化速率大于功能編碼區(qū)，目前被廣泛用于植物系統(tǒng)學(xué)研究，也可以作為種特異性探針篩選的目標(biāo)區(qū)段。目前還未見從葉綠體基因中篩選中藥鑒別探針的報道，但應(yīng)用其相關(guān)序列進(jìn)行鑒別的事例很多，如章群27運(yùn)用PR產(chǎn)物直接測序法測定杜仲原植物atK基因序列，通過lustal軟件將其與GenBank中同源序列進(jìn)行排序比較，發(fā)現(xiàn)32個特異性位點(diǎn)和一個杜仲所獨(dú)有的GA插入序列，結(jié)論

17、認(rèn)為atK基序列的測序分析可成為杜仲正品鑒定的有效手段。5從差減DNA克隆庫中篩選抑制差減雜交法是Diathenk等28所創(chuàng)立，最初是應(yīng)用于建立差異DNA文庫，它是一種在差減DNA和RDA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的基于PR的差異基因表達(dá)篩選方法。其基本原理是利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，比鏈間退火更穩(wěn)定，從而使非目的序列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似于“鍋柄”的結(jié)構(gòu)，無法與引物配對，從而選擇性地抑制了非目的片段的擴(kuò)增，而差異片段得到富集。李同祥29利用該方法進(jìn)行石斛鑒別DNA探針的篩選（其過程見圖2）。首先獲得兩種石斛之間差減片段，然后選部分差異片段克隆分別和所有實(shí)驗(yàn)石斛的總DNA雜交，從中篩選出能

18、與同種石斛DNA雜交而與其它種DNA不能雜交的克隆作為該種石斛專屬DNA探針，將這些探針點(diǎn)在尼龍膜上制成微陣列，可靈敏而快速地鑒別出迭鞘石斛(D.aurantiauKerr)，金釵石斛(D.nbileLind.)，鐵皮石斛(D.finaleKiuraetig)，鼓糙石斛(D.hrystxuLindl.)，流蘇石斛(D.fibriatuHk)。因抑制差減雜交法的篩選目標(biāo)基因是整個基因組，所以可以得到大量的探針，而且可以得到長堿基序列的探針，選擇更近緣的種做為Driver有利于提高差減克隆中種特異性探針的比例，從而提高篩選效率，不足之處是過程比較復(fù)雜，各步驟反應(yīng)條件難于把握。6利用RAPD、AFL

19、P分子標(biāo)記構(gòu)建探針RAPD、AFLP分子標(biāo)記不但可以直接用來進(jìn)行中藥材的鑒別和藥材道地性鑒定（如Sha等30用RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物能有效地鑒別人參、西洋參、三七及其偽品；胡珊梅等31用RAPD技術(shù)探討澤瀉道地藥材與非道地藥材之間遺傳變異的大小，并建立了道地藥材的品質(zhì)鑒定方法），還可以通過回收RAPD，AFLP多態(tài)性產(chǎn)物，克隆后作為RFLP探針32或作為篩選人工染色體文庫(BA、YA文庫)的特異性探針33，或?qū)Χ鄳B(tài)性產(chǎn)物進(jìn)行測序，設(shè)計特異性引物探針34，用于中草藥的鑒別。此方法涉及4個步驟:DNA抽提；RAPD或AFLP擴(kuò)增；特異性條帶的回收測序；探針的設(shè)計和驗(yàn)證。莊南生等35應(yīng)用AFLP標(biāo)記技術(shù)獲

20、得了甘蔗祖親種的AFLP特異片段478條，對其中部分AFLP特異片段通過斑點(diǎn)雜交和Suthern雜交分析，篩選出了5個甘蔗屬特異性探針，2個斑茅特異性探針。通過RAPD或AFLP的方法不設(shè)計引物，方法上比較簡單省事，但獲得的探針數(shù)量有限，很多情況難以得到探針。綜上所述，中藥鑒別種特異性探針可以從多種途徑獲得，可以根據(jù)特定的設(shè)計選擇有效的篩選途徑。需要指出的是某DNA同源區(qū)段具多態(tài)性并不代表能從其中篩選出特異性探針，這是因?yàn)樘禺愋蕴结樤陂L度、堿基組成及其與其它種相應(yīng)區(qū)段的變異程度都有一定的要求；另外，為提高芯片鑒別的準(zhǔn)確性，有必要制備同一物種的多枚探針以增強(qiáng)其特異性，即使這樣，這種特異性是相對的

21、，只是增加探針的數(shù)量會最大限度地減少其它植物種類中同時出現(xiàn)相同序列的概率。隨著中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程及分子生物學(xué)技術(shù)在中藥研究中更廣泛的應(yīng)用，會有越來越多的中藥基因特征性序列被揭示，只有足夠數(shù)量中草藥種類相應(yīng)的特異性探針被設(shè)計出來，利用基因芯片技術(shù)對中藥的并行、快速、高效的檢測才能真正實(shí)現(xiàn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1曾慶平.生物醫(yī)藥前沿技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：690.2ArlinghausHF,strp,Friedrihs,etal.GenediagnstisithTF-SISApplSurfJ.Siene,2003,203-204:689.3EidngD,arsa,Krushina,etal.F

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