核酸的分子雜交技術及其應用

1、核酸的分子雜交技術及其應用1概述核酸的分子雜交（molecular hybridization）技術是日前生物化學 和分子生物學研究中應用最廣泛的技術之一，是定性或定量檢測特異 RNA或DNA序列片段的有力工具。它是利用核酸分子的堿基互補原 則而發(fā)展起來的。在堿性環(huán)境中加熱或加入變性劑等條件下，雙鏈 DNA之間的氫鍵被破壞（變性），雙鏈解開成兩條單鏈。這時加入異源 的DNA或RNA（單鏈）并在一定離子強度和溫度下保溫（復性），若異 源DNA或RNA之間的某些區(qū)域有互補的堿基序列，則在復性時可 形成雜交的核酸分子。在進行分子雜交技術時，要用一種預先分離純化的已知RNA或 DNA序列片段去檢測未知

2、的核酸樣品。作為檢測工具用的已知RNA 或DNA序列片段稱為雜交探針（probe）。它常常用放射性同位素來標 記。雖然核酸分子雜交技術的應用僅有二十多年的歷史，但它在核酸 的結(jié)構(gòu)和功能的研究中作出了重要貢獻，在基因的表達調(diào)控和物種的 親緣關系研究中也發(fā)揮重要作用。而且，隨著核酸探針制備及標記技 術的豐富和完善以及以不同材料為支持物的固相雜交技術的發(fā)展，使 核酸分子雜交技術在分子生物學領域中的應用更加廣泛。這里我們將 就分子雜交技術的幾個主要過程及其應用進行介紹。2核酸探針的制備核酸分子雜交的靈敏性主要依賴雜交探針的放射性比活度。比活 度高就可提高反應的靈敏性，減少待測樣品的用量。日前一般所用的

3、 是體外標記，這里介紹幾種最常用的方法：2.1 DNA的切口平移雙鏈DNA分子的一條鏈有切口時，大腸桿菌DNA聚合酶I可 把核苷酸殘基加到切口處的3端，同時由于此酶具有5。3外切核酸 酶活性，它還可從5端除去核苷酸。這樣5端核苷酸的去除與3端核 苷酸的加入同時進行，導致切口沿著DNA鏈移動，稱切口平移 （nicktranslation）o常用于在雙鏈DNA上打開切口的酶為胰DNA酶 I。由于高放射性比活度的核苷酸置換了原有核苷酸，就有可能制備 比活度大于108計數(shù)/（分,pg）的32P標記的DNA探針。2.2單鏈DNA探針的制備與傳統(tǒng)的雙鏈探針相比，單鏈探針由于不存在互補鏈，因此可以 消除由探

4、針的兩條鏈重退火形成無效雜交體的可能。最常用的是以 M13噬菌體載體合成單鏈DNA探針的方法。其主要原理是用人工合 成的寡核苷酸引物（其序列與載體上固定區(qū)段的序列相互補?？蓮纳?物試劑公司直接購買）與來自重組M13噬菌體的單鏈DNA退火，然 后以此寡核苷酸作為引物在大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow大片段 催化下合成互補的放射性標記DNAo2.3單鏈RNA探針的制備首先將感興趣的DNA序列克隆到帶有SP6噬菌體或T7及T3 噬菌體的啟動子的重組載體質(zhì)粒中。由于這些重組質(zhì)粒帶有的強啟動 子能被噬菌體的依賴DNA的RNA聚合酶所識別。因此，當把線狀 質(zhì)粒與適當?shù)囊蕾嘍NA的RNA聚合酶及4種rN

5、TP(核糖核苷三磷 酸)在體外混合并溫育時，就可在噬菌體啟動子處開始合成RNA。單鏈RNA探針除具有單鏈DNA探針的優(yōu)點之外，還具有： 合成效果高(模板可反復被轉(zhuǎn)錄)；用DNA酶I處理就可容易除去 RNA探針中的模板DNA,而無需用凝膠電泳純化；RNA雜交體穩(wěn) 定性高，所以探針在雜交反應中產(chǎn)生的信號較DNA探針強，等優(yōu)點。3雜交膜的準備核酸的分子雜交可分成液相雜交和固相雜交兩大類。液相雜交是 將待檢測的核酸樣品和同位素標記的雜交探針同時溶于雜交液中進 行反應，然后分離雜交雙鏈和未參加反應的探針，用儀器計數(shù)并通過 計數(shù)分析雜交結(jié)果。固相雜交是把欲檢測的核酸樣品先結(jié)合到某種固 相支持物上，再與溶解

6、于溶液中的雜交探針進行反應，雜交結(jié)果可用 儀器進行檢測，但大多數(shù)情況下直接進行放射自顯影，然后根據(jù)自顯 影圖譜分析雜交結(jié)果。日前，固相雜交技術的發(fā)展較快，而且應用范 圍更為廣泛。日前使用最多的固相支持物是硝酸纖維素(NC )膜。它對單鏈 DNA有較強的吸附作用。RNA經(jīng)過一些特殊變性劑處理后，也能較 容易地結(jié)合到NC膜上。下面介紹固相雜交反應中常用的幾種將核酸 樣品轉(zhuǎn)移到膜上的方法。31點印跡的直接點樣法(Dot blotting)這是一種能快速而且簡便地檢測樣品中微量核酸的常用技術。其 方法主要是將待測樣品直接在NC膜上，然后進行雜交檢測。其主要 過程包括膜的處理、點樣、變性、中和、干燥固定

7、以及變性劑去除(檢 測RNA法)等。DNA 轉(zhuǎn)移(Southern blotting)用于點印跡的DNA直接點樣法具簡單、快速、靈敏度高等優(yōu)點， 但不能確定特異DNA序列的大小和定位。1975年Southern氏建立 了吸附轉(zhuǎn)移法硝酸纖維素膜雜交。其主要原理是利用濾紙對水的毛細 管吸附作用，將經(jīng)限制酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳分離的的DNA片段 轉(zhuǎn)移到固相雜交膜上，此時的DNA片段還保留著原來凝膠中的分布 圖式。然后再用探針進行雜交。RNA 轉(zhuǎn)移(Northern blotting)這是在Southern blot的基礎上發(fā)展的RNA固相雜交技術，其因 兩技術相類似而得名。其方法與Southernb

8、lot 一樣。但RNA需先經(jīng) 乙二醛等變性劑處理后，再于合適的條件下電泳，這樣便能使充分變 性的RNA像變性DNA 一樣直接轉(zhuǎn)移到NC膜上。固定之后除去變 性劑，再進行雜交，可大大提高雜交的敏感性，每條區(qū)帶所需的RNA 量可從500pg降低到1pg以下。此外，由于有時需要分離的核酸樣品分子量很小，用瓊脂糖凝膠 不能達到要求的分辨率。這種情況下往往需要聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)進行分離，而由于這種膠的孔經(jīng)較小，用前述的吸印轉(zhuǎn)移法 轉(zhuǎn)移速度緩慢，易造成轉(zhuǎn)移不完全。為了解決之一問題，發(fā)展了電泳 轉(zhuǎn)移法。即以電泳的方法使分離后的待測核酸樣品從凝膠轉(zhuǎn)移到NC 膜或DBM紙等固相支持物上，再進行雜交

9、。3.4用于原位雜交的菌落轉(zhuǎn)移在基因克隆操作中，為了在眾多轉(zhuǎn)化菌落中篩選帶有日的基因的 重組克隆，常用的方法是用標記的探針通過原位雜交找出帶有互補序 列的日的基因。主要步驟包括長好菌落、制膜、NC膜上菌落的裂解 及膜上核酸的固定等。4固相雜交反應核酸樣品經(jīng)直接點樣或轉(zhuǎn)移到NC膜上并經(jīng)真空干燥后，即進行 雜交反應。在雜交液中，NC膜上變性核酸樣品與變性后的標記探針 在一定條件下形成雜交雙鏈，然后通過儀器計數(shù)或放射自顯影判定結(jié) 果。主要步驟如下。4.1預雜交 日的在于消除NC膜對探針的非特異性結(jié)合，降低雜 交背景。將膜在2xSSC中浸泡2分鐘。然后將膜放入盛有預雜交液6xSSC、0.05xBLOT

10、TO（1xBLOTTO： 5%脫脂奶粉。含 0.02%疊 氮鈉）的雜交管中，于68C雜交爐中溫育12hr。4.2雜交 將32P標記的雙鏈DNA探針100C加熱5分鐘變性，迅 速置冰浴中冷卻。然后加入預雜交液中混勻，于68C下雜交1618 小時。4.3洗膜 將膜置于大體積2xSSC和0.1%SDS溶液中，于室溫下 輕輕振搖5分鐘，反復2次。又于68C下用1xSSC和0.1%SDS溶 液洗2次，約11.5小時。4.4放射自顯影 將膜在紙巾上涼干，用Saron膜(或冰箱保鮮膜和 微波爐用膜)將NC膜做成一夾心包裝，用放射性墨水制作的圓點標 簽在Saron膜上作幾個不對稱的標記。然后置X光片暗盒中，黑

11、暗 下加X光片并加增感屏于-20C或-70C下曝光1216小時。X光底 片經(jīng)顯影、定影及沖洗后，利用放射性墨水留下的標記對準NC膜與 底片的位置，并與凝膠電泳相片或菌落主板相對比，鑒定陽性核酸帶 或菌落。5分子雜交技術的應用Southern印跡技術用來檢查DNA樣品中是否存在有某個特定的 基因，特異性非常高，而且還可知道其大小及酶切位點的分布，盡管 其操作比較復雜;Northern印跡技術則用來檢查基因組中某個特定的 基因是否得到轉(zhuǎn)錄；點印跡則僅需要一滴液體的樣品，就可快捷地檢 查出其中是否有某個基因，但不能檢出基因的大小或重復的程度；菌 落原位雜交技術則是基因克隆中，從眾多克隆中快速篩選出陽

12、性克隆 的最常用的一種方法。V.Davis(1990)通過病毒基因組的隨機引物逆轉(zhuǎn)錄制備了舊DV 的互補DNA探針。在點印跡中，探針不能區(qū)分病毒的疫苗株、田間 株以及突變株，但在很嚴格的條件下也可獲得一些特異性。V.Vakharia用按澳大利亞舊DV序列合成的引物以及pGEM系統(tǒng)，制備了已知起始位點的克隆。將從Delaware E株、Grayson株和STC 標準毒株獲得的RNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到膜上并用放射性標記的探 針檢查。只需1小時的放射自顯影。但探針不能區(qū)分病毒的不同毒株。他用非放射性的地高辛配基系統(tǒng)也獲得了好的雜交結(jié)果。Shaohua Zhao等(1990)通過將滑液膜支原體(MS)

13、的WVU1853 株克隆到質(zhì)粒載體pUC18上，并用大腸桿菌轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了 MS的基 因文庫。在點印跡中，4個轉(zhuǎn)化的克隆與放射性磷標記的MS染色體 DNA雜交，但與MGS6株的染色體DNA則沒有雜交。在Southern 印跡中，所有氯化銫純提的重組質(zhì)?？寺《己?個長度在1.0 2.3kbp的MSDNA片段。用4個重組質(zhì)粒制備的探針在點印跡中與 MS的WVU1853株和9個田間株均可雜交，但與MG及禽支原體其 它15個種均無雜交。M.L.Khan等已制成用來區(qū)分MG致病株和疫苗株的DNA探針。 對于MG感染的快速診斷，他將株和種特異性的DNA探針直接應用 在田間樣品的點印跡檢測上。將1毫升的樣品

14、培養(yǎng)液吸到膜上，然后 用探針檢查。株特異性的探針具有與MG疫苗株相同的、長度為6kbp 的基因序列，它能特異性地檢出經(jīng)MGF株苗免疫的雞群。種特異性 的探針含有1個9kbp的插入片段，它可檢測出所有的MG，而與其 它的鳥類支原體則無交叉雜交。M.Jenkins用Southern印跡來研究球蟲的基因表達、基因的基 因組構(gòu)成以及它們在球蟲不同種的分布。能特異性地鑒別球蟲特定的 發(fā)育階段的探針也已制備。此外，還研制出了以診斷為日的、具有種 特異性的其它探針。K.S.Henderson等(1990)通過點印跡法，用cDNA探針來檢測感染雞體內(nèi)的舊DV抗原，并用瓊脂擴散試驗和免疫熒光試驗來作比較。 結(jié)果

15、用后兩種方法在接種病毒2天后即可從雞的組織中檢出病毒抗 原，檢出的持續(xù)時間分別為3天和4天。而用點印跡法在接種病毒后 1天即可檢出病毒抗原并且在整個試驗期里(24天)均可檢出。這表明 點印跡法比其它兩種方法都敏感。K.P.Snipes等(1990)應用REA及Southern印跡法可將分離自 火雞的多殺性巴氏桿菌的疫苗株(M9)和致病株相鑒別，盡管兩者在血 清型或莢膜型、生化特征、抗藥性、全細胞蛋白的PAGE圖以及質(zhì) 粒的內(nèi)容等方面完全相同。為禽霍亂流行病學研究提供很有用的工 具。除上述這些應用之外，分子雜交技術還可用于進行細胞原位雜交。 此項技術是在保持細胞，甚至單個染色體形態(tài)的情況下，檢查細胞內(nèi) 某些基因位置的一種有效的分子工具。它在診斷生物學、發(fā)育生物學、 細胞生物學、遺傳學和病理學研究上均得到廣泛的應用。原則上它保 持了核酸和細胞的形態(tài)，用標記的探針與之雜交，最后顯影。影響試 驗的因素包括基因的性質(zhì)及探針的大小。在包埋的或冰凍的切片中的 待檢樣品用固定劑處理。交聯(lián)固定劑如甲醛，可降低細胞的滲透性， 這樣反過來就需要較小的探針才能使之透入細胞，結(jié)果就使此方法的 靈敏度下降。因此，固定劑及探針的選擇是關