聯(lián)合survivin反義寡核苷酸和基因重組融合蛋白對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的抑

1、結(jié)合survivin反義寡核苷酸和基因重組交融蛋白對(duì)人膀胱癌細(xì)胞的抑keyrds：transfringgrthfatralpha;antisenselignuletides;bladderneplass;therapy1材料與方法1.1主要材料1.2方法美國(guó)gib公司中，包含15小牛血清杭州四季青公司，100ku/l的青霉素和鏈霉素，并置于含52的37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。gibi/brl公司介導(dǎo)下進(jìn)展反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染，操作按試劑盒說明進(jìn)展。轉(zhuǎn)染6h后用含15小牛血清的de培養(yǎng)液終止反響。對(duì)照組采用含一樣濃度lipfetin的無血清de培養(yǎng)液。采用trizl一步法提取總rna。取2l總rna，70孵

2、育10in。dna合成反響體系20l：gl2254l、rtbuffer102l、dntps102l、rna酶抑制劑20u/l0.5l、隨機(jī)引物(50)1.0l、av逆轉(zhuǎn)錄酶25u/l0.8l。逆轉(zhuǎn)錄條件為：25孵育10in，42孵育45in，最后95孵育5in。別離后，被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別用鼠抗人survivin6e4單克隆抗體(12000)孵育。然后用辣根過氧化酶偶聯(lián)的抗兔或抗鼠抗體15000孵育。最后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)。參加100l無血清de配制的干預(yù)溶液處理1、2、3天，其中tp40處理濃度為750ng/l1，寡核苷酸處理濃度為300n，并用未處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照僅含li

3、pfetin的無血清de培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染6h后更換含15%小牛血清的de培養(yǎng)液，同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的tp40。檢測(cè)時(shí)，每孔參加25ltt5g/l，37孵育2h，每孔參加100lextratinbuffer，37溫育過夜，最后用96空板酶標(biāo)儀測(cè)其于570n的光吸收值(a)3。細(xì)胞存活率由下算式計(jì)算：a實(shí)驗(yàn)組/a對(duì)照組100。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用sasversin8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展方差分析。p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1survivin反義寡核苷酸對(duì)t24細(xì)胞的作用以不同濃度的survivin反義寡核苷酸處理t24細(xì)胞48h，發(fā)現(xiàn)survivin反義寡核苷酸隨濃度的增加對(duì)survivinrna的

4、表達(dá)有明顯抑制作用，但在濃度到達(dá)300n以上時(shí)，其抑制作用不再明顯增加。因此在下面的實(shí)驗(yàn)中survivin反義寡核苷酸的處理濃度均采用300n。2.2結(jié)合suivivin反義寡核苷酸和tp40對(duì)t24細(xì)胞的作用2.3t24細(xì)胞增殖的生物學(xué)特性astp40的生長(zhǎng)抑制作用更加明顯p0.0001，s組較對(duì)照組無顯著性差異p0.05，as組較tp40組無顯著性差異p0.05。結(jié)合組astp40第1、2、3天的細(xì)胞存活率分別為65.6%、42.1%和12.2%。差異。as組、tp40組分別有36.96、57.15的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而結(jié)合組tp40as的細(xì)胞凋亡為96.37，較單獨(dú)用藥組的作用更加明顯。那么

5、大大降低，結(jié)合組tp40+as細(xì)胞幾乎沒有形成克攏在3次的獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，此結(jié)果都得到了很好的重復(fù)。3討論近年來我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率明顯上升。膀胱癌多數(shù)以浸潤(rùn)方式生長(zhǎng)，復(fù)發(fā)非常普遍，雖然可以用部分治療來控制，但仍有10%15%的非浸潤(rùn)性膀胱癌最終開展成浸潤(rùn)性膀胱癌或者發(fā)生轉(zhuǎn)移。晚期膀胱癌患者更是缺乏有效的治療方法。臨床治療效果證明化療和放療對(duì)預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)，以及治療晚期膀胱腫瘤的療效有限。大量的研究說明基因治療和生物治療是控制晚期腫瘤最有希望的手段，并可能用于預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。在生物治療和基因治療的研究中，殺傷強(qiáng)度、作用靶向性和可控性一直是世界各國(guó)研究者所追求的目的。在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)作用完全可控性難度極大，目前研究的熱點(diǎn)多數(shù)集中在作用靶向性和進(jìn)步作用強(qiáng)度上。本研究