細(xì)菌感染病原學(xué)診斷課件

1、細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷1細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷1 （一）標(biāo)本的采集要求： 1.早期采集：盡量在發(fā)病早期、應(yīng)用抗生素之前采集2.根據(jù)標(biāo)本的種類(lèi)及可能的目的菌的特性選擇不同的標(biāo)本采集方法3.無(wú)菌采集：嚴(yán)格無(wú)菌操作，采集后標(biāo)本置于無(wú)菌容器，且不得接觸任何抗菌物質(zhì)和消毒劑4.標(biāo)本采集要足量5.安全采集一、臨床標(biāo)本的采集及處理原則2 （一）標(biāo)本的采集一、臨床標(biāo)本的采集及處理原則2（二）標(biāo)本的運(yùn)送、保存及處理 標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送檢，厭氧菌必須在2h內(nèi)送檢。1. 床邊接種2. 置于保存液或轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中送檢3. 針對(duì)可能存在的病原體的特點(diǎn)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行冷藏、保溫或保持厭氧狀態(tài)進(jìn)行送檢4. 標(biāo)本送檢過(guò)程中應(yīng)注意安全3（

2、二）標(biāo)本的運(yùn)送、保存及處理 標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送檢，厭氧菌不染色標(biāo)本檢查法染色標(biāo)本檢查法二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查4不染色標(biāo)本檢查法二、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查4主要用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力及其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)1.懸滴法2.壓滴法3.毛細(xì)管法4.暗視野顯微鏡檢查法5.相差顯微鏡檢查法（一）不染色細(xì)菌標(biāo)本的檢查5主要用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力及其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)（一）不染色細(xì)菌標(biāo)本的檢查細(xì)菌染色標(biāo)本的制作程序 涂片 干燥 固定 染色（二）細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查6細(xì)菌染色標(biāo)本的制作程序（二）細(xì)菌染色標(biāo)本的檢查6（1）單染色法 只用一種染料色的方法 制片結(jié)晶紫1min水洗晾干、油鏡檢（2）復(fù)染色法 革蘭染色法（Gram stain） 抗酸染色法（a

3、cid-fast stain）（3）特殊結(jié)構(gòu)染色法3.細(xì)菌常用的染色方法7（1）單染色法 只用一種染料色的方法3.細(xì)菌常用的染色方法革蘭染色法（Gram stain）方法（改良快速法） 初染： 結(jié)晶紫等量NaHCO3 35s，水洗 媒染： 堿性碘液 35s，水洗 脫色： 丙酮酒精 35s，水洗 復(fù)染： 堿性稀釋復(fù)紅 35s，水洗8革蘭染色法（Gram stain）方法（改良快速法）8結(jié)果 紫色：革蘭陽(yáng)性菌 紅色：革蘭陰性菌9結(jié)果 紅色：革蘭陰性菌9原理方法 （ZiehlNeelsen染色法） 初染：5石碳酸復(fù)紅 加溫 染 35min ，水洗 脫色：3%鹽酸酒精 1 min ，水洗 復(fù)染：堿性美

4、蘭 1 min ，水洗抗酸染色法（acid-fast stain）10原理 初染：5石碳酸復(fù)紅 加溫 染 35min ，結(jié)果紅色：抗酸性細(xì)菌藍(lán)色：非抗酸性細(xì)菌注意事項(xiàng) 一張玻片只能涂染一份標(biāo)本 不能使用染色缸 染色關(guān)鍵：脫色時(shí)間的長(zhǎng)短11結(jié)果注意事項(xiàng)11特殊結(jié)構(gòu)染色法莢膜染色（capsule stain）芽胞染色（spore stain）鞭毛染色（flagellum stain）12特殊結(jié)構(gòu)染色法12細(xì)菌的接種及分離培養(yǎng)技術(shù)13細(xì)菌的接種及分離培養(yǎng)技術(shù)13一、培養(yǎng)基（culture medium）（一）定義 用人工方法將適合細(xì)菌生長(zhǎng)需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)配制成的混合營(yíng)養(yǎng)制品。14一、培養(yǎng)基（cul

5、ture medium）（一）定義14營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、生長(zhǎng)因子等凝固物質(zhì) 瓊脂、明膠、卵白蛋白等抑制劑 抗生素、化學(xué)物質(zhì)、染料等指示劑 酚紅、溴甲酚紫、中性紅等（二）培養(yǎng)基的組成成分15營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)、生長(zhǎng)因子等（二）培養(yǎng)基的組成按用途分類(lèi)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basic medium）牛肉湯、普通瓊脂平板 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrient medium）血瓊脂平板、巧克力血平板鑒別培養(yǎng)基(differential medium) 糖發(fā)酵管、KIA、MIU選擇培養(yǎng)基（selective medium） SS瓊脂、麥康凱瓊脂特殊培養(yǎng)基（special medium）厭氧菌培養(yǎng)基

6、、細(xì)菌L型培養(yǎng)基（三）培養(yǎng)基的種類(lèi)16按用途分類(lèi)（三）培養(yǎng)基的種類(lèi)16按物理性狀分類(lèi) 固體（平板、斜面、高層）半固體液體17按物理性狀分類(lèi) 17（一）接種工具 接種環(huán)及接種針二、細(xì)菌的接種及分離技術(shù)18（一）接種工具二、細(xì)菌的接種及分離技術(shù)18（二）細(xì)菌的接種方法1. 平板劃線(xiàn)分離法 用于細(xì)菌標(biāo)本的分離純化。19（二）細(xì)菌的接種方法192. 瓊脂斜面接種法 主要用于單個(gè)菌落的純培養(yǎng)及保存菌種，也可用于某些生化鑒定試驗(yàn)的接種。202. 瓊脂斜面接種法 203. 穿刺接種法用于半固體培養(yǎng)基或KIA、明膠等具有高層的培養(yǎng)基接種。半固體培養(yǎng)基的穿刺接種可用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。 213. 穿刺接種法用于半

7、固體培養(yǎng)基或KIA、明膠等具有高層的培用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等的接種。4. 液體接種法22用于各種液體培養(yǎng)基如肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等的接種。4. 5. 傾注平板法 細(xì)菌定量培養(yǎng) 6. 涂布法L棒涂布。增菌培養(yǎng)、活菌計(jì)數(shù)、藥敏試驗(yàn)等。23 5. 傾注平板法 6. 涂布法23四、細(xì)菌的培養(yǎng)方法1.需氧培養(yǎng)（普通培養(yǎng)） 需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下進(jìn)行的培養(yǎng)普通孵育箱37C 1824h觀察培養(yǎng)結(jié)果 平板已接種好的 斜面 試管 少數(shù)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌需要培養(yǎng)37d直至1個(gè)月才能生長(zhǎng)。 24四、細(xì)菌的培養(yǎng)方法1.需氧培養(yǎng)（普通培養(yǎng)） 普通孵育箱觀察培2. 二氧化碳培養(yǎng) 將已接種培

8、養(yǎng)基置于5%10%CO2環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 （2）燭缸培養(yǎng)：簡(jiǎn)單易行，不需特殊設(shè)備，尤其適用于基層實(shí)驗(yàn)室。（1）二氧化碳培養(yǎng)箱：能自動(dòng)調(diào)節(jié)CO2的含量、溫度和濕度。252. 二氧化碳培養(yǎng) （2）燭缸培養(yǎng)：簡(jiǎn)單易行，不需特殊設(shè)備3. 厭氧培養(yǎng) 厭氧菌對(duì)O2敏感，培養(yǎng)過(guò)程中需造成低氧化還原電勢(shì)的厭氧環(huán)境。物理法、化學(xué)法、生物法。厭氧罐培養(yǎng)法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。263. 厭氧培養(yǎng) 26五、細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象 細(xì)菌的菌落特征:菌落大小形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)則等）高度（突起、扁平或凹陷）邊緣（整齊、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）表面（光滑、粗糙等）濕潤(rùn)度（干燥、濕潤(rùn)等）透明度

9、（不透明、半透明、透明等）顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、黃色或無(wú)色等）溶血性（溶血、溶血或溶血）特殊氣味27五、細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象 細(xì)菌的菌落特征:2728282929半固體觀察動(dòng)力陰性動(dòng)力陽(yáng)性30半固體觀察動(dòng)力陰性動(dòng)力陽(yáng)性30表面菌膜生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象31表面菌膜生長(zhǎng)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象31細(xì)菌的生化反應(yīng)32細(xì)菌的生化反應(yīng)32不同細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，對(duì)糖和蛋白質(zhì)的分解能力不同，因而其代謝產(chǎn)物也各異。據(jù)此可利用生物化學(xué)方法檢測(cè)這些代謝產(chǎn)物以區(qū)別和鑒定不同細(xì)菌。原理33不同細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，對(duì)糖和蛋白質(zhì)的分解能力不同，因而其1. 糖（醇、苷）類(lèi)發(fā)酵試

10、驗(yàn)一、碳水化合物代謝試驗(yàn) 用途 糖發(fā)酵試驗(yàn)是鑒定細(xì)菌最常用的生化反應(yīng)，特別用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。341. 糖（醇、苷）類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)一、碳水化合物代謝試驗(yàn) 用途342.氧化/發(fā)酵試驗(yàn)（OF試驗(yàn)） 又稱(chēng)葡萄糖代謝類(lèi)型鑒別試驗(yàn)或 Hugh-Leifson（HL）試驗(yàn)分解葡萄糖 氧化型分解葡萄糖 發(fā)酵型不分解葡萄糖 產(chǎn)堿型有氧有氧或無(wú)氧有氧或無(wú)氧細(xì)菌 原理352.氧化/發(fā)酵試驗(yàn)（OF試驗(yàn)） 又稱(chēng)葡萄糖代謝類(lèi)型鑒別試 產(chǎn)堿型 發(fā)酵型 氧化型用途 主要用于革蘭陰性桿菌的鑒別。腸桿菌科細(xì)菌均為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌通常為氧化型或產(chǎn)堿型。葡萄球菌和微球菌的鑒別，前者為發(fā)酵型，后者為氧化型。 36 產(chǎn)堿型 發(fā)酵型 陽(yáng)

11、性 培養(yǎng)基變黑陰性 培養(yǎng)基不變色 用途 主要用于D群鏈球菌及其他鏈球菌的鑒別，前者陽(yáng)性，后者陰性。也可用于腸桿菌科、其他革蘭陰性菌及厭氧菌的鑒別。 3.七葉苷水解試驗(yàn)37陽(yáng)性 培養(yǎng)基變黑 用途3.七葉苷水解試驗(yàn)374.甲基紅（MR）試驗(yàn)細(xì)菌葡萄糖丙酮酸 醇、酮、醛等 培養(yǎng)基 pH5.4甲酸、乙酸、乳酸等 培養(yǎng)基 pH4.4甲基紅指示劑 pH4.5 變?yōu)榧t色 pH5.4 變?yōu)辄S色 用途 主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別，前者陽(yáng)性，后者陰性。原理384.甲基紅（MR）試驗(yàn)細(xì)菌葡萄糖丙酮酸 醇、酮、醛等 5.VP試驗(yàn)細(xì)菌脫羧KOH-2H二乙酰胍基紅色化合物葡萄糖乙酰甲基甲醇 CO2丙酮酸 用途

12、本試驗(yàn)常及MR試驗(yàn)一起使用，通常兩者結(jié)果相反。 MR VP 大腸埃希菌 產(chǎn)氣腸桿菌 395.VP試驗(yàn)細(xì)菌脫羧KOH-2H二乙酰胍基紅色化合物葡萄糖二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1.吲哚試驗(yàn)（靛基質(zhì)試驗(yàn)）原理 色氨酸 吲哚（靛基質(zhì)） 細(xì)菌對(duì)二甲氨基苯甲醛（柯氏試劑）玫瑰吲哚（紅色）用途 主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。40二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1.吲哚試驗(yàn)（靛基質(zhì)試驗(yàn)）細(xì)菌對(duì)2.硫化氫試驗(yàn) 原理含硫氨基酸細(xì)菌硫化氫Fe2+（或Pb2+）FeS（ PbS） （黑色） 用途 常用于腸桿菌科菌屬間的鑒定。412.硫化氫試驗(yàn) 原理含硫氨基酸細(xì)菌硫化氫Fe2+（或Pb2+3.尿素酶試驗(yàn)原理 NH2OC 2

13、H2O (NH4)2CO3 2NH3CO2 H2O NH2 細(xì)菌（脲酶）（尿素）（碳酸銨）（培養(yǎng)基pH）用途 主要用于腸道桿菌科的鑒定。變形桿菌屬為。423.尿素酶試驗(yàn)原理細(xì)菌（脲酶）（尿素）（碳酸銨）（培養(yǎng)基pH4.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) 原理 苯丙氨酸 苯丙酮酸NH3細(xì)菌（苯丙氨酸脫氨酶）Fe+綠色化合物 用途 主要用于腸桿菌科的鑒定。434.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn) 原理細(xì)菌（苯丙氨酸脫氨酶）Fe+三、碳源和氮源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)原理 某些細(xì)菌能利用枸櫞酸鈉作為唯一碳源獲得能量，并利用銨鹽作為唯一氮源，因而能在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鈉和氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。44三、碳源和

14、氮源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)44結(jié)果 培養(yǎng)基變藍(lán)為陽(yáng)性，不變色為陰性。用途 用于腸桿菌科中各菌屬間的鑒別。45結(jié)果用途45IMViC試驗(yàn)I 吲哚試驗(yàn)M MR試驗(yàn)V VP試驗(yàn)C 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)用于腸道桿菌的鑒定 I MR VP C 大腸埃希菌 產(chǎn)氣腸桿菌 +46IMViC試驗(yàn)I 吲哚試驗(yàn) 四、呼吸酶類(lèi)試驗(yàn)1.氧化酶試驗(yàn)原理還原型細(xì)胞色素C 氧化型細(xì)胞色素C 細(xì)菌（細(xì)胞色素氧化酶）對(duì)苯二胺醌類(lèi)化合物（Wurster氏藍(lán)）試劑 1%鹽酸四甲基對(duì)苯二胺 或 1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試劑47四、呼吸酶類(lèi)試驗(yàn)1.氧化酶試驗(yàn)細(xì)菌（細(xì)胞色素氧化酶）對(duì)苯二胺結(jié)果 細(xì)菌10s內(nèi)呈深紫色（或深藍(lán)色）為陽(yáng)性，不變色為

15、陰性。四甲基對(duì)苯二胺二甲基對(duì)苯二胺48結(jié)果四甲基對(duì)苯二胺二甲基對(duì)苯二胺48用途 （1）革蘭陰性桿菌的鑒定：腸桿菌科均呈陰性，大多數(shù)非發(fā)酵菌呈陽(yáng)性。（2）奈瑟菌屬的鑒定：奈瑟菌屬為陽(yáng)性 。注意事項(xiàng) 試驗(yàn)時(shí)避免接觸含鐵物質(zhì)，不能用接種環(huán)取菌。49用途492.過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)（觸酶試驗(yàn)）原理 細(xì)菌（過(guò)氧化氫酶） 2H2O2 2H2OO2用途 常用于革蘭陽(yáng)性球菌的初步分群。葡萄球菌屬和微球菌屬為陽(yáng)性，鏈球菌屬和腸球菌為陰性。502.過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)（觸酶試驗(yàn)）原理用途50五、抑菌試驗(yàn)1.桿菌肽試驗(yàn)原理 A群溶血性鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎100%敏感，而其它鏈球菌對(duì)桿菌肽通常耐藥。 用途 鑒別A群和非A群鏈球菌的

16、重要試驗(yàn)，A群鏈球菌為陽(yáng)性，其他群鏈球菌為陰性。 51五、抑菌試驗(yàn)1.桿菌肽試驗(yàn) 用途512.奧普托欣（Optochin ）敏感試驗(yàn)原理 Optochin(乙基氫化羥基奎寧) 能干擾肺炎鏈球菌葉酸合成，抑制該菌的生長(zhǎng)，故肺炎鏈球菌對(duì)Optochin敏感，而其它鏈球菌對(duì)其耐藥。用途 用于肺炎鏈球菌和甲型鏈球菌的鑒別。肺炎鏈球菌為陽(yáng)性，甲型鏈球菌為陰性。522.奧普托欣（Optochin ）敏感試驗(yàn)原理用途52六、其他生化試驗(yàn)1.凝固酶試驗(yàn)原理 致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶：結(jié)合凝固酶（或凝聚因子）和游離凝固酶。 游離凝固酶 凝血酶樣物質(zhì) （凝血酶原）協(xié)同因子纖維蛋白原纖維蛋白 （試管法）結(jié)合凝

17、固酶纖維蛋白 （玻片法 ）纖維蛋白原53六、其他生化試驗(yàn)1.凝固酶試驗(yàn) 游離凝固酶 結(jié)果 玻片法：對(duì)照側(cè)無(wú)凝集顆粒 血漿側(cè)出現(xiàn)明顯凝集顆粒 陽(yáng)性用途 用于葡萄球菌的鑒定，常作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)。試管法：血漿凝固、不流動(dòng) 陽(yáng)性54結(jié)果陽(yáng)性用途試管法：542.膽汁溶菌試驗(yàn)原理 膽鹽或膽汁能溶解肺炎鏈球菌。用途 主要用于肺炎鏈球菌及草綠色鏈球菌的鑒別。肺炎鏈球菌陽(yáng)性，草綠色鏈球菌陰性。552.膽汁溶菌試驗(yàn)原理用途55血清學(xué)試驗(yàn)56血清學(xué)試驗(yàn)56血清學(xué)檢測(cè)的原理：未知 已知 血清學(xué)鑒定（確診，細(xì)菌定種、定型）已知 未知 血清學(xué)診斷（協(xié)助診斷）Ag AbAg-Ab57血清學(xué)檢測(cè)的原理：未知

18、已知 血清學(xué)鑒定（確診， 1.表面抗原 莢膜多糖抗原 K抗原 Vi抗原2. 菌體抗原（O抗原）3.鞭毛抗原（H抗原）4.菌毛抗原 目前尚未用于細(xì)菌鑒定特異性抗原：細(xì)菌鑒定及分群（型）的主要依據(jù)類(lèi)屬抗原或共同抗原：非特異性交叉反應(yīng)的原因細(xì)菌的抗原物質(zhì)：58 1.表面抗原 莢膜多糖抗原 K抗原 Vi抗原1.玻片凝集試驗(yàn) 原理 用診斷血清（已知抗體）在載玻片上直接及待檢菌混合，若有相應(yīng)細(xì)菌，則可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集顆粒，借以鑒定細(xì)菌。方法細(xì)菌診斷血清生理鹽水混勻13min觀察結(jié)果（一）凝集反應(yīng)一、血清學(xué)鑒定591.玻片凝集試驗(yàn)細(xì)菌診斷血清生理鹽水混勻觀察結(jié)果（一）凝集反結(jié)果陽(yáng)性試驗(yàn)側(cè)出現(xiàn)凝集顆粒，對(duì)照

19、側(cè)均勻混濁；陰性試驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)均為均勻混濁；自凝試驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)均出現(xiàn)凝集顆粒。 用途 用于鑒定菌種及菌型。 評(píng)價(jià) 本法簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，是鑒定細(xì)菌最常用的方法。60結(jié)果 用途602. 反相間接凝集試驗(yàn) 原理 已知Ab顆粒性載體 Ag 顆粒凝集 （致敏顆粒） （未知）方法 常用方法有反相間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)和膠乳凝集試驗(yàn)。評(píng)價(jià) 敏感性高且易于觀察結(jié)果，是一種敏感快速的方法?？捎糜跈z測(cè)微量抗原。612. 反相間接凝集試驗(yàn) 原理方法61（二）莢膜腫脹試驗(yàn) 原理 當(dāng)特異性抗血清及相應(yīng)細(xì)菌的莢膜抗原特異性結(jié)合，形成復(fù)合物時(shí)，可使細(xì)菌莢膜顯著增大，呈腫脹現(xiàn)象。 方法 待檢菌抗血清染料待檢菌正常兔血清染料

20、室溫510min鏡檢62（二）莢膜腫脹試驗(yàn) 原理 當(dāng)特異性抗血清及相應(yīng)細(xì)菌的莢膜結(jié)果 陽(yáng)性 在紅色細(xì)菌周?chē)梢?jiàn)厚薄不等、邊界清晰的無(wú)色環(huán)狀物，而在對(duì)照側(cè)無(wú)此現(xiàn)象； 陰性 試驗(yàn)側(cè)及對(duì)照側(cè)均不產(chǎn)生無(wú)色環(huán)狀物。 應(yīng)用 本試驗(yàn)常用于肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、炭疽芽胞桿菌的檢測(cè)及分型。63結(jié)果 應(yīng)用 63（三）制動(dòng)試驗(yàn)原理 抗鞭毛抗體及鞭毛抗原結(jié)合，使鞭毛強(qiáng)直、相互粘著而失去動(dòng)力，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)停止。方法 抗血清室溫 510min懸滴觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)懸滴觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng) 菌懸液 64（三）制動(dòng)試驗(yàn)原理 抗血清懸滴觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)懸滴觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng) 結(jié)果 陽(yáng)性 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)停止，菌體凝集成塊 陰性 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)無(wú)改變注

21、意事項(xiàng) 抗血清中不能加防腐劑。應(yīng)用 常用于運(yùn)動(dòng)活潑細(xì)菌的快速鑒定，如霍亂弧菌的鑒定。 65結(jié)果65二、血清學(xué)診斷 用已知抗原檢測(cè)病人血清中的相應(yīng)抗體，以診斷感染性疾病的方法。用途 作為某些傳染病的輔助診斷，尤其對(duì)某些病原體不能培養(yǎng)或難于培養(yǎng)的感染性疾病，可以提供診斷依據(jù)。 血清學(xué)診斷主要適用于病程較長(zhǎng)的傳染病的診斷。結(jié)果判斷 一般作血清學(xué)診斷時(shí)，需取患者急性期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本，若后者的抗體效價(jià)比前者有4倍或4倍以增長(zhǎng)上才有診斷意義。66二、血清學(xué)診斷 用已知抗原檢測(cè)病人血清中的相應(yīng)抗體，病毒感染的病原學(xué)檢查67病毒感染的病原學(xué)檢查67病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法 病原學(xué)診斷 顯微鏡檢查病毒分離培

22、養(yǎng)及鑒定抗原檢測(cè)核酸檢測(cè)血清學(xué)診斷 抗體檢測(cè) IgM、IgG68病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法 病原學(xué)診斷 68一、標(biāo)本采集、運(yùn)送和處理（一）標(biāo)本采集采集時(shí)間：盡早采集（越早越好）標(biāo)本種類(lèi)：根據(jù)感染的部位、可能感染的病毒類(lèi)型選擇標(biāo)本種類(lèi)無(wú)菌采集標(biāo)本：必要時(shí)用抗生素或抗真菌藥處理血清學(xué)檢查標(biāo)本：雙份血清69一、標(biāo)本采集、運(yùn)送和處理（一）標(biāo)本采集69（二）標(biāo)本的運(yùn)送及保存1.低溫送檢 4可保存數(shù)小時(shí)，-70可長(zhǎng)期保存對(duì)冷凍標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融2.保濕送檢50%甘油鹽水保存送檢 病毒轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明膠或牛血清白蛋白的Hanks液3.無(wú)菌送檢70（

23、二）標(biāo)本的運(yùn)送及保存1.低溫送檢70二、病毒形態(tài)學(xué)檢查1.光學(xué)顯微鏡 僅用于大病毒顆粒和包涵體的檢查。 簡(jiǎn)便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細(xì)胞后不形成包涵體狂犬病毒胞漿內(nèi)包涵體（內(nèi)基小提）巨細(xì)胞病毒胞核內(nèi)包涵體71二、病毒形態(tài)學(xué)檢查1.光學(xué)顯微鏡狂犬病毒胞漿內(nèi)包涵體（內(nèi)基小2. 電鏡及免疫電鏡直接檢查標(biāo)本中的病毒顆粒，快速，可確診。但敏感性低（106/ml）免疫電鏡敏感性高，但只能用于已知病毒的檢測(cè)）乙型肝炎病毒電鏡圖 輪狀病毒電鏡圖 722. 電鏡及免疫電鏡直接檢查標(biāo)本中的病毒顆粒，快速，可確診。3.病毒大小的測(cè)定方法（1）電子顯微鏡直接測(cè)量（2）超過(guò)濾法（3）超速離心法733.病毒大小的

24、測(cè)定方法73（一）病毒分離和鑒定的一般程序 動(dòng)物接種組織培養(yǎng)標(biāo)本采集標(biāo)本處理后接種雞胚接種卵黃囊膜尿囊液羊膜腔液絨毛尿囊膜觀察囊膜病變血凝試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)CPEEM包涵體空斑試驗(yàn)紅細(xì)胞吸附中和試驗(yàn)觀察發(fā)病抗原檢測(cè)抗體檢測(cè)病理檢查三、病毒的分離及鑒定74（一）病毒分離和鑒定的一般程序 動(dòng)物接種組織培養(yǎng)標(biāo)本采集標(biāo)本（二）病毒的分離雞胚培養(yǎng)動(dòng)物接種組織培養(yǎng)75（二）病毒的分離雞胚培養(yǎng)751. 動(dòng)物接種常用動(dòng)物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病對(duì)動(dòng)物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類(lèi)加以選擇。接種途徑 按病毒侵襲部位選擇相應(yīng)的接種途徑：乙型腦炎病毒及狂犬病毒 小鼠腦內(nèi)接種柯薩奇病毒 乳鼠腹腔接種乙肝病毒

25、 黑猩猩靜脈注射流感病毒 鼻腔滴種用途分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清761. 動(dòng)物接種常用動(dòng)物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不2. 雞胚培養(yǎng)常用于粘病毒、皰疹病毒和痘類(lèi)病毒的分離培養(yǎng)接種途徑及方法 新鮮受精卵 接種病毒3839713d卵黃囊接種羊膜腔接種尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種772. 雞胚培養(yǎng)常用于粘病毒、皰疹病毒和痘類(lèi)病毒的分離培養(yǎng)38絨毛尿囊膜表現(xiàn)有痘病毒的特異性損傷78絨毛尿囊膜表現(xiàn)有痘病毒的特異性損傷783.組織培養(yǎng)將人或動(dòng)物離體的活組織或分散的活細(xì)胞在體外人工控制的條件下使其生長(zhǎng)繁殖的一種技術(shù)。組織培養(yǎng)的類(lèi)型（1）組織塊培養(yǎng)（2）器官培養(yǎng) 人胚氣管呼吸道病毒； 人胚腸 腸道

26、病毒（3）細(xì)胞培養(yǎng)最常用793.組織培養(yǎng)將人或動(dòng)物離體的活組織或分散的活細(xì)胞在體外人工控原代和次代細(xì)胞培養(yǎng) 對(duì)病毒敏感，但制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力，只能傳23代。二倍體細(xì)胞培養(yǎng) 原代細(xì)胞反復(fù)傳代（4050代）仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制備的首選細(xì)胞株。傳代細(xì)胞培養(yǎng) 來(lái)源于腫瘤細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞，常用于病毒的分離鑒定，但不能用于制備疫苗。8080（三）病毒的鑒定病毒的初步鑒定動(dòng)物感染范圍及潛伏期對(duì)雞胚的敏感性在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)理化性質(zhì)的測(cè)定最后鑒定血清學(xué)鑒定: 中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等81（三）病毒的鑒定病毒的初步鑒定81病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)（1）細(xì)胞代謝作用改變（培養(yǎng)液顏色

27、變化）正常細(xì)胞代謝： 培養(yǎng)液由紅變黃病毒增殖，抑制細(xì)胞代謝：培養(yǎng)液顏色不變或更紅82病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)（1）細(xì)胞代謝作用改變（培養(yǎng)液顏色變化 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后，使宿主的形態(tài)發(fā)生不同程度改變，這種由病毒增殖引起的細(xì)胞形態(tài)變化，稱(chēng)為細(xì)胞病變效應(yīng)。（2）細(xì)胞病變（cytopathic effect ，CPE） 細(xì)胞變圓、融合、腫脹、細(xì)胞空泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿性包涵體等。 某些病毒感染細(xì)胞后不出現(xiàn)CPE83病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后，使宿主的形態(tài)發(fā)生不同程度改變，這種由病毒848485858686（4） 干擾現(xiàn)象當(dāng)兩種不同的病毒同時(shí)或先后感染同一細(xì)胞時(shí)，其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱(chēng)為病

28、毒的干擾現(xiàn)象。鼻病毒無(wú)CPE鼻V.Poli.V無(wú)CPEPoli.V有CPE87（4） 干擾現(xiàn)象鼻病毒Poli.V87（5）紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn) 受感染的宿主細(xì)胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附雞、豚鼠或猴紅細(xì)胞 如果在培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)的血凝素抗血清，則不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，即紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)陽(yáng)性88（5）紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn) 受感染的宿主細(xì)（6）血凝及血凝抑制試驗(yàn) 含有血凝素的病毒能吸附一定種類(lèi)的哺乳動(dòng)物或禽類(lèi)的紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞凝集。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的血凝素抗體抑制，稱(chēng)為血凝抑制試驗(yàn)，可用于分型。89（6）血凝及血凝抑制試驗(yàn) 含有血凝素的病毒能吸附一定種類(lèi)的新分離病毒的鑒定（1）病毒的大

29、小及形態(tài)（2）核酸類(lèi)型: 5-溴-2-脫氧尿苷（BUDR）能抑 制DNA復(fù)制，而不抑制RNA病毒。（3）乙醚敏感試驗(yàn): 有包膜病毒對(duì)乙醚敏感，經(jīng)乙醚作用后，失去感染性（4）耐酸試驗(yàn) 腸道病毒耐酸，在pH3的環(huán)境下穩(wěn)定，鼻病毒不耐酸，在pH3的環(huán)境下被滅活90新分離病毒的鑒定（1）病毒的大小及形態(tài)90病毒的血清學(xué)鑒定中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等91病毒的血清學(xué)鑒定中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等91四、病毒的血清學(xué)診斷單份血清IgM測(cè)定 早期診斷雙份血清IgG測(cè)定 4倍以上增長(zhǎng)，有診斷意義92四、病毒的血清學(xué)診斷單份血清IgM測(cè)定 早期診斷92五、病毒的分子生物學(xué)檢測(cè) 多種分子生物學(xué)方法。檢測(cè)以不同形式存在的病毒基因片斷。敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速，標(biāo)本用量少。核酸電泳技術(shù)核酸雜交技術(shù)PCR基因芯片技術(shù)93五、病毒的分子生物學(xué)檢測(cè) 多種分子生物學(xué)方法。檢測(cè)以不