體外分析的技術(shù)

1、關(guān)于體外分析技術(shù)1第1頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四2定義與分類一、體外放射分析技術(shù)：在體外實驗條件下，以特異性結(jié)合反應(yīng)為生物學(xué)基礎(chǔ)，以結(jié)合反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律為共同方法學(xué)基礎(chǔ)，利用核射線對體內(nèi)的各種生物活性物質(zhì)進(jìn)行體外定量分析的各種方法。二、分類：1、競爭性體外放射分析法（如RIA）2、非競爭性體外放射分析法（如IRMA）3、由體外放射分析技術(shù)派生出來的非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)（酶、化學(xué)發(fā)光、時間分辨熒光分析）第2頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四3第一節(jié) 放射免疫分析法radioimmunoassay， RIA 1959年，美國的兩位科學(xué)家Be

2、rson和Yalow首次將示蹤技術(shù)的高度靈敏性和免疫學(xué)抗原-抗體結(jié)合的高度特異性結(jié)合起來，創(chuàng)立了放射免疫分析技術(shù)，開創(chuàng)了生物活性物質(zhì)微量測定技術(shù)的新時代。RIA 的特點：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好。經(jīng)不斷改進(jìn)，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于臨床檢測和科學(xué)研究的很多領(lǐng)域。第3頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四4一、基本原理競爭性抑制 被測量的微量物質(zhì)Ag（未標(biāo)記抗原）和標(biāo)記有放射性核素的該種物質(zhì)*Ag(標(biāo)記抗原)對其抗體Ab有相同的結(jié)合能力，反應(yīng)時， Ag和 一定量的*Ag競爭有限量的Ab。生成的*AgAb的量隨Ag的增加而減少，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。反應(yīng)達(dá)到平衡后，分離*AgAb

3、（B）與*Ag（F），B、F或B/F與Ag的量呈函數(shù)關(guān)系，利用這一函數(shù)關(guān)系求出待測抗原的的濃度。第4頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四5反應(yīng)式第5頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四6具體方法 用一系列濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)抗原（濃度遞增的標(biāo)準(zhǔn)品）在嚴(yán)格相同的條件下與一定量的*Ag和有限量的Ab共同反應(yīng)，反應(yīng)達(dá)到平衡后，分離B與F，測定B的放射性做為縱坐標(biāo)，以每一反應(yīng)管的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)被測抗原試管中的B的CPM值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出該抗原的濃度第6頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四7函數(shù)式第7頁，共46頁，202

4、2年，5月20日，19點25分，星期四8標(biāo)準(zhǔn)曲線第8頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四9得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線之所以是曲線而不是直線，這是可逆反應(yīng)的質(zhì)量作用定律決定的。函數(shù)式見上圖根據(jù)放射免疫分析法的基本原理，建立放射免疫分析必須具備以下技術(shù)條件：1、可靠的標(biāo)準(zhǔn)品2、高比活度的標(biāo)記品3、高親和力的抗體4、合適的分離技術(shù)5、理想的曲線擬合方式第9頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四10二、基本方法（一）基本試劑 放射免疫分析反應(yīng)需要三種基本試劑： 1、標(biāo)準(zhǔn)品（非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)抗原） 2、標(biāo)記抗原 3、抗體第10頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星

5、期四111、標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品是樣品定量的基礎(chǔ)，它的質(zhì)和量的變化直接影響待測樣品的測定值。 對標(biāo)準(zhǔn)品的要求如下：1）標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品應(yīng)屬于同一種物質(zhì)；2）在與抗體反應(yīng)時，標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品應(yīng)有相同的活性和親和能力；3）高度純化，不含有影響分析的雜質(zhì)；4）對標(biāo)準(zhǔn)品的定量一定要精確第11頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四122、標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原是樣品測量的基礎(chǔ)對標(biāo)記抗原的要求是： 1）比活度和放射化學(xué)純度必須足夠高以保證分析的靈敏度 標(biāo)記抗原的放化純必須不小于95% 2）放射性核素的半衰期合適 3）標(biāo)記抗原的生理活性未改變 4）標(biāo)記抗原的應(yīng)有較高的穩(wěn)定性第12頁，共46頁，202

6、2年，5月20日，19點25分，星期四133、抗體在放射免疫分析中，抗體質(zhì)量的好壞是影響放射免疫分析的關(guān)鍵因素之一。高質(zhì)量的抗體必須具備三個條件： 高親和力、高特異性、高滴度第13頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四141）高親和力只有高親和力的抗體才能得到斜率高的標(biāo)準(zhǔn)曲線，而斜率高的標(biāo)準(zhǔn)曲線是高靈敏度和高精密度的必備條件。親和力測定方法最常用的是Scatchard作圖法（P36） KA值越大（即直線斜率越大），抗體的親和力越大方法的靈敏度和精密度越高第14頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四152）高特異性抗體必須與反應(yīng)系統(tǒng)中抗原以外的物質(zhì)尤其是抗

7、原類似物結(jié)合得少，以免影響分析結(jié)果抗體特異性的測定： 方法：測抗體的交叉反應(yīng)率 交叉反應(yīng)率越小，抗體的特異性越高第15頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四163）高滴度滴度 是抗體實際應(yīng)用時的稀釋倍數(shù) 抗體的滴度越高，其中的干擾物質(zhì)的影響就越小。滴度的測定：以一定濃度的*Ag與稀釋度不同的抗體進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)*Ag的結(jié)合率為50%時對應(yīng)的抗體的稀釋度即為該抗體的滴度。這時的抗體濃度就是實際使用時的濃度。 第16頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四17（二）分離技術(shù)1、聚乙二醇（PEG）沉淀法2、雙抗體沉淀法3、雙抗體+PEG法4、葡萄球菌A蛋白（SPA）

8、沉淀法5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭6、微孔濾膜過濾法：玻璃或醋酸纖維濾膜7、磁化分離技術(shù)：氧化鐵-活性炭（-抗體）8、固相分離技術(shù)： 1）第一抗體與試管聯(lián)接 2）第二抗體與試管聯(lián)接第17頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四18（三）數(shù)據(jù)處理1、logit-log模型2、四參數(shù)logistic模型：3、四參數(shù)質(zhì)量作用定律模型U=（A-D）/1+（X/C）B+D其中U為各試驗管結(jié)合率（含NSB） A、B、C、D分別為0劑量時的結(jié)合率， logit-log函數(shù)的斜率，各點實際結(jié)合率下降一半時X的量，NSB。第18頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四

9、19三、質(zhì)量控制 Quality Control , QC（一）定義：質(zhì)量控制 就是控制誤差，即對分析工作中的誤差進(jìn)行經(jīng)常性的檢查，遇有質(zhì)量異常則及時采取對策，以保證分析誤差控制在可接受的范圍內(nèi)。放射免疫分析是一類高靈敏度的超微量分析技術(shù)，極易受各種因素的影響而使檢測結(jié)果失真，因此必須有嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系。第19頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四20（二）誤差的來源1、系統(tǒng)誤差：這種誤差表現(xiàn)為檢測結(jié)果呈傾向性的偏高或偏低，常有一些可以確定的因素導(dǎo)致，如：量器不準(zhǔn)、試劑不純、標(biāo)準(zhǔn)品的定量不準(zhǔn)、儀器狀態(tài)不佳、分離效果不好、不適當(dāng)?shù)那€擬合模型等等，系統(tǒng)誤差是通過努力可以消除

10、的。2、隨機(jī)誤差：這種誤差多由難以確定且無法控制的原因引起，誤差的出現(xiàn)是隨機(jī)的，由各種偶然因素造成，符合正態(tài)分布，如量取液體或分離時的誤差。第20頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四21（三）實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制側(cè)重對檢測質(zhì)量的控制，它保證從收集樣本開始到發(fā)出報告為止的全過程中，能及時發(fā)現(xiàn)檢測過程中出現(xiàn)的各種誤差，分析產(chǎn)生的原因，找出糾正的辦法，以確保檢測的質(zhì)量。常用以下指標(biāo)對檢測結(jié)果做可靠性評價：精密度、準(zhǔn)確度、特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、有效性第21頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四221、精密度（precision）是指在相同條件

11、下對某一樣品多次檢測所得結(jié)果的符合程度，即復(fù)管的重復(fù)性，它是最重要的質(zhì)量參數(shù)。 常用精密度圖來評價實驗室內(nèi)部的精密度水平。2、準(zhǔn)確度（accuracy）是指測定值與真值的接近程度，用回收率來評價，回收率是反應(yīng)測定值偏差的質(zhì)控指標(biāo)。3、靈敏度（sensitivity）是指檢測能與零劑量區(qū)分的最小檢測量。 累計10次測定結(jié)果，計算出零標(biāo)準(zhǔn)管的結(jié)合率為X2SD時對應(yīng)的劑量值，即為靈敏度。第22頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四234、特異性（specificity）是指該反應(yīng)體系不受干擾物質(zhì)物質(zhì)影響的程度。常用的指標(biāo)是交叉反應(yīng)率。5、穩(wěn)定性（stability）是指測定試劑在

12、合理保存和正確使用條件下，在規(guī)定的有效期內(nèi)，保持其全部原有性能不變的能力。常用指標(biāo)有：零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率（B0%20%）、非特異性結(jié)合率（NSB%5%）、標(biāo)準(zhǔn)曲線上的質(zhì)控指標(biāo)等。6、有效性（effectivity）主要指臨床診斷符合率及臨床使用評價，檢測結(jié)果在正常和異常之間有良好的區(qū)分，得出可信的結(jié)論。第23頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四24第二節(jié) 免疫放射分析 immunoradiometric assay , IRMA免疫放射分析技術(shù)是1968年由Miles和Hales創(chuàng)立的，IRMA是非競爭性體外放射分析技術(shù)的代表。第24頁，共46頁，2022年，5月20日，19

13、點25分，星期四25一、基本原理用放射性核素標(biāo)記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過量的標(biāo)記抗體，抗原與標(biāo)記抗體進(jìn)行全量反應(yīng)，多余的抗體用一定的手段除去，測定復(fù)合物的放射性，其活度與待測抗原量正相關(guān)。 第25頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四26RIA和IRMA低劑量區(qū)的不確定因素示意圖第26頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四27IRMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線第27頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四28IRMA的特點1、屬于非競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)；2、抗原抗體復(fù)合物的與抗原的量正相關(guān)3、在低劑量區(qū)不會有不確定因素4、IRMA的非特異性結(jié)

14、合對低劑量區(qū)的影響大第28頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四29二、基本方法1、雙抗體夾心法2、標(biāo)記第三抗體法3、生物素-親和素系統(tǒng)的應(yīng)用第29頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四30第30頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四31第31頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四32RIA和IRMA的區(qū)別第32頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四33體外分析常用檢查項目項目 方法及正常值 臨床意義T3 放免 1.0-3.2nmol/l 判斷甲狀腺功能及腎病肝病 糖尿病腫瘤心肌梗死等引起的低T

15、3T4綜合征T4 放免 70-180nmol/l 同上FT3 放免 3.2-9.2pmol/l 同上，判斷甲亢復(fù)發(fā)及妊娠 時甲狀腺功能FT4 放免 8.2-26pmol/l 同上甲狀腺球 放免30% 甲狀腺自身免疫疾病特異指蛋白抗體 標(biāo)，橋本氏甲狀腺炎第33頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四34甲狀腺微 放免20% 甲狀腺自身免疫疾病特異指粒體抗體 標(biāo)，橋本氏甲狀腺炎TSH 免放 0.4-3.1IU/ml 鑒別原發(fā)與繼發(fā)甲低,評價下 丘腦-垂體-甲狀腺軸功能,垂體瘤,庫欣綜合征 甲狀腺 放免4-14.5g/ml 診斷甲癌慢性淋巴細(xì)胞性球蛋白 甲狀腺炎/甲亢,尤其監(jiān)測甲癌

16、 復(fù)發(fā)反T3 放免 0.5-1.2nmol/l 診斷甲狀腺疾病,對非甲狀腺 疾病嚴(yán)重程度的判斷預(yù)后療效觀察均有重要意 義,甲減替代治療觀察 TSH受體 放射受體9U/l 甲亢甲亢預(yù)后,甲亢ATD?？贵w 藥指標(biāo).判斷甲亢有無復(fù)發(fā).第34頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四35促甲狀腺素 放免法4325pg/ml 鑒別原發(fā)和繼發(fā)性釋放激素 甲低甲狀旁腺素 放免 70.5pmol/l 甲狀旁腺病,判斷骨代謝. 慢性腎衰甲旁亢甲旁腺瘤時增高, 甲旁減高鈣尿癥時減低腫瘤標(biāo)志物鐵蛋白 放免 ,男25264g/l 缺鐵性貧血,輔助診斷再障急 女25264g/l 慢性白血病惡性淋巴瘤多發(fā)

17、 性骨髓瘤。原發(fā)性肝癌部分 升高，腫瘤骨髓、肝、脾轉(zhuǎn)移時顯著增加前列腺特 放免，2.6g/l 前列腺癌前列腺肥大前列腺炎診異抗原 斷及療效觀察.前列腺癌時顯著升高,肥大時輕度升高.第35頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四36CEA 放免，20g/l 結(jié)腸直腸胃肺乳腺惡性腫瘤時動態(tài) 升高,對腫瘤診斷復(fù)發(fā)預(yù)后判斷療效觀察有意義.AFP 放免，25g/l 診斷原發(fā)性肝癌.急慢性活動性肝炎 胎兒畸形也可升高.可作肝癌手術(shù)和 化療后預(yù)后觀察.NSE 放免，15g/l 小細(xì)胞未分化肺癌腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤神 經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤腦損傷 降鈣素 放免，29.3pmol/l 甲狀腺隋樣瘤,早期診斷小

18、細(xì)胞肺癌,甲 亢時異常升高,判斷腎功能鈣磷代謝.前列腺酸性 放免，4g/l 前列腺癌時明顯升高,肥大時輕度升高,磷酸酯酶 可作前列腺癌療效監(jiān)測.血2微球 放免，2300g/l 多發(fā)性骨髓瘤肝胃結(jié)腸癌白血病時蛋白 顯著升高.慢性腎炎和腎衰時血濃度升高.第36頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四37糖類抗原 放免20mg/l 腫瘤診斷預(yù)后, 放化療及手術(shù)后的療CA-50 效觀察CA-199 放免37U/ml 胰腺癌膽管癌陽性檢出率高,結(jié)腸癌胃 癌肝癌等輔助診斷和療效隨訪.CA-242 放免25U/ml 胰腺癌肝癌診斷,高特異CA-125 放免35U/ml 婦科腫瘤的診斷與鑒別

19、診斷有重要價值CA-153 放免30U/ml 乳癌診斷特異,乳癌肝及骨轉(zhuǎn)移卵巢癌 子宮內(nèi)膜癌一定程度增高腎上腺及腎臟 尿免疫球蛋白 放免8mg/l 早期診斷腎臟受損受損部位及程度判斷尿白蛋白 放免10mg/l 同上尿2微球蛋白 放免5% IDDM早期診斷,胰島素治療糖尿病 的療效判斷,評價胰島素產(chǎn)品質(zhì)量.骨鈣素 放免 1.88.4g/l 判斷骨代謝骨質(zhì)疏松情況,了解甲狀 腺甲狀旁腺功能第38頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四39肝臟 急性黃疸型肝炎慢性活動性肝炎肝硬化膽酸 放免300g/dl 肝癌膽汁淤積時明顯升高,慢性遷延性肝 炎及膽囊炎輕度升高。妊娠膽淤明顯升高。透

20、明質(zhì)酸 放免 120g/l 肝硬化肝纖維化慢性肝炎時升高,肝硬 化惡變時顯著升高,可鑒別慢性活動性與遷延性肝炎層粘連蛋白 放免 120g/l 同上III型膠原 放免 120g/l 同上IV型膠原 放免 3565g/l 同上, 肝纖維化早期診斷指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 酶法:540U/l 肝細(xì)胞損害靈敏指標(biāo),常見于急性 病毒性肝炎慢性活動性肝炎及其他原因所致肝損害.門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 酶法: 840U/l 同上谷氨?；D(zhuǎn)移酶 酶法: 男1150U/l 診斷肝膽疾病,原發(fā)性肝癌 女 723U/l 胰腺癌時增高.第39頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四40性激素 RIA 男: 4

21、87ng/l 不孕癥及胎盤功能判斷雌二醇 女: 24315ng/lLH RIA 男:530IU/L 性腺功能狀態(tài),睪丸精原細(xì)胞癌原 女:卵泡期 230IU/L 發(fā)性閉經(jīng),性早熟等 排卵期40200IU/L 黃體期020IU/L 絕經(jīng)期35210IU/L孕酮 RIA 男0.350.19g/L 妊娠時增高,葡萄胎比正常妊娠時 女:卵泡期 0.750.38g/L 高,先兆流產(chǎn)絨毛膜上皮細(xì)胞癌 排卵期2.051.11g/L 嚴(yán)重妊毒癥等降低 黃體期11.66.7 g/L 絕經(jīng)期0.310.22g/L第40頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四41睪酮 RIA 男: 2601250n

22、g/dl 性腺功能判斷.睪丸良性間質(zhì)細(xì)胞瘤 女: 2 54ng/dl 女性男性化腫瘤升高;隱睪炎,垂體 性腺功能減退.hCG RIA 3.1g/L 早孕,絨毛膜上皮細(xì)胞癌,葡萄胎及療亞單位 效觀察,宮外孕,睪丸腫瘤,先兆流產(chǎn)的 動態(tài)觀察.垂體催 RIA 男: 6.213g/L 下丘腦,垂體病變,內(nèi)分泌疾病,惡性乳素 女: 914g/L 腫瘤,腎功能衰竭,生理月經(jīng)期或泌 乳期ACTH RIA 原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)功能減退先天性腎上腺皮質(zhì) 8AM: 2.317.9pmol/l 增生,異源性分泌庫欣病升高; 繼發(fā)性 4PM: 1.716.6pmol/l 皮質(zhì)功能減退,皮質(zhì)腫瘤, 醫(yī)源性降低 第41頁，共

23、46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四42生長激素 RIA 3.0g/L 巨人癥肢端肥大癥低血糖時升高; 侏 儒癥垂體前葉功能減退癥某些激素藥物影響減低FSH RIA 男:530IU/L 女:卵泡期 330IU/L 性功能狀態(tài),睪丸精原細(xì)胞癌,原發(fā)性 排卵期1230IU/L 閉經(jīng), 性早熟等 黃體期 515IU/L 絕經(jīng)期323333IU/L抗利尿 RIA 15g/L 腎性尿崩急性腦出血肝病慢性腎激素 衰時升高, 中樞性或繼發(fā)性尿崩降低消化及其他縮膽囊素 RIA 5800ng/L 胰腺功能不足縮膽囊素 腹瀉綜合癥 胃泌素瘤升高; 小腸疾病降低.胃動素 RIA 268384ng/L 胃泌素瘤VIP瘤急性感染腹瀉時增高神經(jīng)降 RIA2060pmol/l 消化功能障惡性腫瘤精神神經(jīng)疾病壓素 研究P物質(zhì) RIA 1115pmol/l 肝昏迷 胰性霍亂時明顯升高胃泌素 RIA 100ng/L 診斷胃泌素腫瘤各種慢性胃炎惡性 貧血胃酸缺乏消化性潰瘍. 第42頁，共46頁，2022年，5月20日，19點25分，星期四43心鈉素