體外血小板流動腔研究方法的建立和應(yīng)用

1、體外血小板流動腔研究方法的建立和應(yīng)用thedevelpentandappliatinfaflhaberfrplateletresearhdepartentfbiengineering，beihanguniversity，beijing，100083，hina血小板外表膜糖蛋白glyprtein，gpib與受損血管內(nèi)皮外表血管性假性血友病因子vnillebrandfatr，vf的結(jié)合是血小板血栓形成的起始步驟。這一結(jié)合使得血小板與血管內(nèi)皮外表發(fā)生瞬時的結(jié)合，并以滾動的方式黏著于血管內(nèi)皮外表，與此同時，啟動血小板內(nèi)一系列的細胞信號傳導(dǎo)途徑，發(fā)生a2+濃度增加，pi3k活化等反響1，使得血小板外表整

2、合素b3活化2。b3與vf和血漿中纖維蛋白原結(jié)合，最終使得血小板結(jié)實附著于血管外表，并互相聚集成團，形成血栓?？梢?，gpib與vf的結(jié)合在血小板血栓形成中起著起始、關(guān)鍵的作用。這一過程的研究對預(yù)防和治療血栓形成性疾病有著重要價值。血小板和vf的互相作用通常的研究方法有：使用血小板聚集儀檢測瑞斯托霉素ristetin誘導(dǎo)的血小板聚集；流式細胞儀技術(shù)或elisa直接檢測血小板和vf的結(jié)合等。但這些方法很難反映體內(nèi)血管流動條件下血小板與血管內(nèi)皮的直接互相作用的實時情況。在本研究中，我們將vf包被于細玻璃管外表以模擬血管受損的情況，同時分別使用負壓裝置、蠕動泵和恒定注射泵以產(chǎn)生不同流態(tài)和準確剪切率的流

3、體環(huán)境，成功地建立了體外流體條件下血小板與vf互相作用的流體模型，為血小板相關(guān)的根底研究，以及抗血小板相關(guān)的抗血栓藥物研究，提供了一種實在有效的研究方法。1材料和方法1.1試劑和儀器1.2實驗方法1.3流動腔實驗把包被了vf的玻璃管裝在倒置顯微鏡上，分別使用負壓裝置、蠕動泵、恒定注射泵3種動力系統(tǒng)，根據(jù)公式r=4qr3準確計算玻璃管中的剪切率4，使得血小板或h細胞懸液通過玻璃管。流動起始后，顯微錄像系統(tǒng)顯示并記錄玻璃管中的情況。最后用difiedtyrdesbuffer在同樣剪切率調(diào)節(jié)下沖洗玻璃管5in，仍然黏附的細胞即為激活了整合素b3的穩(wěn)定黏附。2結(jié)果血小板血栓的形成與血管中的血流情況親密

4、相關(guān)5。病理性剪切力能誘導(dǎo)血小板的黏附、聚集6。有研究者采用平板流動腔和錐板黏度計來模擬體內(nèi)血液流動。我們采用細玻璃管簡單而直觀的觀察到流動條件下血小板與vf結(jié)合的全過程示意圖見圖1。gpb與vf的互相作用使得血小板在vf外表以滾動的方式發(fā)生瞬時的黏附，同時啟動血小板內(nèi)一系列細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終激活整合素b3導(dǎo)致血小板發(fā)生穩(wěn)定的黏附。圖1實驗系統(tǒng)示意圖把包被了vf的玻璃管裝在倒置顯微鏡上，通過硅膠管連接到提供動力裝置，樣品分別在負壓裝置、蠕動泵、恒定注射泵的帶動下流經(jīng)玻璃管，在流出口搜集樣品。同時通過d系統(tǒng)將圖像傳輸?shù)接嬎銠C，同步顯示并錄像。3討論血小板發(fā)揮止血功能和產(chǎn)生血栓需要血小板黏著到

5、內(nèi)皮下基質(zhì)，而這一過程是由血小板膜糖蛋白ib與vf互相作用所起始的。gpb與vf的結(jié)合誘導(dǎo)一系列的細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)使得黏附的血小板被激活：a2+濃度的改變，蛋白激酶、pi3k、蛋白磷酸化酶和酪氨酸激酶等的活化，并發(fā)生血小板肌動蛋白的重新排列8，活化整合素iib3介導(dǎo)更穩(wěn)定的黏附，致密顆粒釋放出內(nèi)容物誘導(dǎo)血小板聚集。gpb與vf的結(jié)合是血小板發(fā)揮其功能的關(guān)鍵步驟。我們所建立的方法可觀察和記錄特定剪切率條件下，血小板或轉(zhuǎn)染細胞發(fā)生黏附的過程。與通常使用的平行平板流動腔和錐板黏度計相比，我們的方法有以下幾個優(yōu)點：1裝配簡單，剪切力不會因為裝配的誤差而產(chǎn)生影響。平行平板流動腔提供的剪切力與上下平板間間隔

6、 的平方成反比，裝配時的誤差會對計算剪切力帶來較大的影響。而錐板黏度計的錐尖由于長期使用會產(chǎn)生磨損，改變了錐體與平板間原有的角度，這樣所產(chǎn)生的剪切力將不再是一致的。我們的方法不存在裝配誤差對剪切力的影響。2樣品使用量小，節(jié)約了樣本。3便于觀察。由于玻璃管是透明的，我們在光學(xué)顯微鏡下就能清楚地觀察到血小板懸液流動和黏附的情況。我們的系統(tǒng)也可以對血小板或細胞進展熒光染色觀察。而目前還沒有商品化的可視化的錐板黏度計，需要實驗室自己加工。4外表處理簡單。當我們研究剪切力對血小板直接作用的機制時，必須消除血小板外表同實驗系統(tǒng)間的互相作用。使用錐板黏度計時通常采用硅油或其它非血栓形成材料外表來消除這些互相作用。而使用玻璃管只需要采用bsa封閉就可以到達要求，操作簡單又方便。我們的方法也存在一些缺點。當負壓系統(tǒng)提供動力時，是由于虹吸原理把細胞懸液吸入到玻璃管中，可在此過程中，水柱的液面高度差逐漸縮小，使得流速緩慢地發(fā)生改變。蠕動泵是在流動腔技術(shù)中廣泛采用的，但是產(chǎn)生的是正弦流動，這與我們希望的穩(wěn)定恒流不同。注射泵流速穩(wěn)定，但不能建立循環(huán)的流動系統(tǒng)，由于血小板黏附反響時間較短，所以使用注射泵完全可以滿足要求。本系統(tǒng)除了可以研