金蓮花中總黃酮抗氧作用的研究

1、金蓮花中總黃酮抗氧作用的研究【摘要】目的研究金蓮花中總黃酮抗氧作用的才能。方法用分光光度法測定金蓮花總黃酮對2-、H、DPPH的去除作用和對紅細(xì)胞膜的保護(hù)作用，并與維生素比擬。結(jié)果金蓮花總黃酮有抑制2-、H、DPPH的才能和保護(hù)紅細(xì)胞膜的作用，金蓮花總黃酮的濃度與抑制2-、H、DPPH的才能和保護(hù)紅細(xì)胞膜的才能呈量-效關(guān)系。結(jié)論金蓮花總黃酮具有較強(qiáng)抗氧作用。【關(guān)鍵詞】金蓮花總黃酮抗氧化金蓮花TrlliushinensisBunge.為毛茛科植物金蓮花的枯燥花。據(jù)記載，金蓮花的成效為清熱解毒1?，F(xiàn)代藥理研究說明金蓮花具有很好的抗菌、抗病毒作用2。金蓮花中總黃酮是其有效成分。本實(shí)驗(yàn)通過研究金蓮花總

2、黃酮對超氧陰離子、羥自由基、DPPH去除才能與紅細(xì)胞膜的保護(hù)作用證明金蓮花總黃酮的抗氧作用。1材料與儀器1.1藥品和試劑金蓮花采自河北省張家口壩上地區(qū)，經(jīng)河北北方學(xué)院中醫(yī)系中藥教研室馬淑蘭教授鑒定為金蓮花。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品中國生物制品藥品檢定所，DPPH(二苯代苦味酰基苯肼自由基，美國，維生素中國生物制品藥品檢定所。鄰苯三酚，雙氧水，鄰二氮菲，硫酸亞鐵，Tris-Hl，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉均為分析純。生理鹽水，實(shí)驗(yàn)用水為三重蒸餾水。1.2動(dòng)物昆明種小鼠由學(xué)校動(dòng)物中心提供。1.3儀器DZ-1B型真空枯燥箱天津市泰斯特儀器有限責(zé)任公司；中藥粉碎機(jī)(浙江省溫嶺市大海藥材器械廠

3、)；電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備)；循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪于華儀器廠)；756紫外可見光分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠)；GR-202型分析天平1/10萬(日本)；Heraeus低溫高速離心機(jī)(德國)。2方法與結(jié)果2.1金蓮花中總黃酮的提娶純化、含量測定稱取已洗凈枯燥粉碎的金蓮花10.12g，60%乙醇提取，提取兩次，合并兩次提取液，過濾，適當(dāng)稀釋，石油醚萃取，經(jīng)D-101大孔樹脂純化，真空枯燥成粉末即得金蓮花總黃酮。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定總黃酮含量為64.81%。2.2金蓮花總黃酮抗氧實(shí)驗(yàn)2.2.1去除超氧陰離子自由基2-的活性3鄰苯三酚在弱堿性Tris-Hl緩沖液(p

4、H8.2)溶液中自身氧化產(chǎn)生2-，隨著反響進(jìn)展2-在體系中不斷積累，反響3in后體系在322n處的吸光度值隨時(shí)間變化呈量效增大，而2-去除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在322n處吸收峰受抑制通過光化學(xué)方法測定A值，求抑制率。抑制率%=Antrl-AsapleAntrl100%取6支具塞試管，依次參加pH值8.2的Tris-Hl2.25l，三蒸水、總黃酮，在25水浴保溫20in，參加在25水浴保溫的鄰苯三酚(用10lL-1Hl配置，濃度為3lL-1)后，準(zhǔn)確反響3in，參加10lL-1的Hl0.25l終止反響，終體積為5l。用相應(yīng)空白試劑作對照，在322n處測吸光度值A(chǔ)?？傸S酮的終濃度分別為5，10

5、，20，40，60gl-1，每管平行5次。以維生素做陽性對照組，分別計(jì)算抑制率。見表1。表1金蓮花中總黃酮去除超氧陰離子的測定結(jié)果略轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.求得總黃酮I50=37.50gl-1，維生素I50=3.10gl-1。2.2.2對羥基自由基H的作用Fe2+/H22體系通過Fentn反響產(chǎn)生H，鄰二氮菲-Fe2+被H氧化成鄰二氮菲-Fe3+后，F(xiàn)e2+與鄰二氮菲形成的紅色配合物顏色變淺，在510n處的吸光度值減小，當(dāng)體系中參加H去除劑后，此氧化過程受抑制，用在510n處的吸光度值的變化上下來說明抗氧化才能上下。取7支試管，依次參加2.5gl-1的鄰二氮菲0.5l，pH值7.4的PBS1l，

6、不同濃度的總黃酮，2lL-1的H220.5l，用三蒸水補(bǔ)足體積至5l，混勻后置37水浴中保溫60in，在510n處測吸光度值A(chǔ)。用相應(yīng)空白試劑作對照。總黃酮的終濃度分別為50，60，70，80，90gl-1，每管平行5次。以Vit做陽性對照組，分別計(jì)算抑制率見表2。求得總黃酮I50=72.51gl-1，維生素I50=7.60gl-1。表2金蓮花中總黃酮去除H的測定結(jié)果略抑制率%=Asaple-AblankAntrl-Abland100%2.2.3對DPPH的影響4DPPH是以氮為中心的穩(wěn)定自由基，在320n，517n處有兩個(gè)吸收峰，當(dāng)參加該自由基去除劑后吸收峰均減弱，但在517n處減弱明顯，應(yīng)

7、選擇測517n處的A值來反映去除該自由基的才能。取7支試管，依次參加0.13lL-1的DPPH2l，不同濃度的總黃酮，用無水乙醇補(bǔ)足體積至5l，混勻避光，暗室下反響20in，取出后于517n處測吸光度值A(chǔ)，用相應(yīng)空白試劑作對照?？傸S酮的終濃度分別為1，2，4，6，8，10gl-1，每管平行5次。以維生素做陽性對照組，分別計(jì)算抑制率見表3。求得總黃酮I50=5.90gl-1，維生素I50=2.30gl-1。表3金蓮花中總黃酮去除DPPH自由基的測定結(jié)果略去除率%=1-Ai-AjA)100%2.2.4對小鼠紅細(xì)胞溶血的影響5自由基進(jìn)攻紅細(xì)胞膜上的多聚不飽和脂肪酸，使紅細(xì)胞破裂導(dǎo)致溶血，當(dāng)體系中參加

8、自由基去除劑后，紅細(xì)胞溶血變化的多少說明金蓮花總黃酮抗氧化才能的上下。取昆明種小鼠，摘除眼球取血，肝素抗凝，用生理鹽水洗滌4次(4,1500rin-1離心6in)至上清液澄清，取積壓紅細(xì)胞(RB)用生理鹽水制成1%的紅細(xì)胞懸液50l。取7支10l離心試管，依次參加1%的RB懸液2l，不同濃度的總黃酮,用生理鹽水補(bǔ)足體積至1.9l，混勻后于37水浴保溫10in,再參加100lL-1的H220.1l，混勻后37水浴保溫60in,取出后參加生理鹽水稀釋5倍,4,1500rin-1離心6in，取上清液于415n處測吸光度值A(chǔ)。用相應(yīng)空白試劑作對照。總黃酮的終濃度分別為10，20，30，40，50gl-

9、1，每管平行5次。以Vit做陽性對照組，分別計(jì)算抑制率見表4。求得總黃酮I50=32.50gl-1，維生素I50=15.50gl-1。表4金蓮花總黃酮對H22引起紅細(xì)胞溶血的影響略抑制率%=1-Asaple-AblankAdel-Ablank)100%3討論去除超氧陰離子實(shí)驗(yàn)中，鄰苯三酚自氧化受Hl濃度影響。本實(shí)驗(yàn)采用5l的總體系中參加10lL-1的Hl0.25l終止反響?？傸S酮和Vit去除2-的才能均與濃度呈量效關(guān)系，總黃酮的I50值比Vit大。去除H的實(shí)驗(yàn)中，加樣順序?qū)?shí)驗(yàn)的影響較大，文獻(xiàn)多采用鄰二氮菲、PBS、Fe2+加樣順序。本實(shí)驗(yàn)分別采用了3種加樣順序鄰二氮菲、PBS、Fe2+；鄰二

10、氮菲、Fe2+、PBS；Fe2+、PBS、鄰二氮菲，在510n處測的吸光度值顯示，說明在PBSpH=7.4環(huán)境下，F(xiàn)e2+受H-作用可能會發(fā)生變化，而與鄰二氮菲配合的數(shù)量減少。故實(shí)驗(yàn)中采用鄰二氮菲、Fe2+、PBS加樣順序，使Fe2+與鄰二氮菲先反響，生成穩(wěn)定的配合物，防止PBS對Fe2+的影響。文獻(xiàn)說明8，DPPH在固體狀態(tài)下可以穩(wěn)定存在，但制成溶液后穩(wěn)定性降低，常溫下只能穩(wěn)定存在5h，要求DPPH要現(xiàn)用現(xiàn)配。而在本實(shí)驗(yàn)中，測得空白組在3，4，5，6，8，10h的吸光度值依次為0.564，0.566，0.564，0.569，0.561，0.564。計(jì)算求得RSD=0.47%，說明DPPH制成

11、溶液后經(jīng)過放置至10h仍然是穩(wěn)定的。抗紅細(xì)胞氧化損傷實(shí)驗(yàn)中，文獻(xiàn)方法均用3000rin-1離心而用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞破壞較多，而且細(xì)胞形態(tài)不規(guī)那么。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)探究在文獻(xiàn)根底上，改良為1500rin-1離心。黃酮類化合物根本構(gòu)造為B環(huán)上的3，4-鄰位二羥基是具有去除自由基生物活性的關(guān)鍵構(gòu)造6。金蓮花總黃酮中主要含有葒草苷、牡荊苷、槲皮素-3-新橙皮糖苷和槲皮素-3-巢菜糖苷等黃酮類成分，其中葒草苷、槲皮素-3-新橙皮糖苷和槲皮素-3-巢菜糖苷均有與黃酮類根本母核構(gòu)造相似的B環(huán)3，4-鄰位二羥基周欣?短瓣金蓮花黃酮類成分制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及抗氧化活性研究?第二軍醫(yī)大學(xué),2022。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明金蓮花總黃酮有較強(qiáng)的抗氧作用。本實(shí)驗(yàn)以維生素做陽性對照，研究發(fā)現(xiàn)金蓮花總黃酮對超氧陰離子、羥自由基、DPPH去除才能與紅細(xì)胞膜的保護(hù)作用的I50值比維生素I50值低。金蓮花總黃酮具有抗氧作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典，上冊.上海:上海人民出版社，1977：1398.2林秋風(fēng)，馮順卿，李薇蘭，等.金蓮花抑菌抗病毒活性成分的初步研究J.浙江大學(xué)理學(xué)版,2022,314:412.3劉靜.杜仲葉提取物的體外抗氧化作用J.陜西教育學(xué)院學(xué)報(bào)，2022，232：65.4陳季武，胡斌，