免疫球蛋白宣講培訓(xùn)課件

1、免疫球蛋白宣講免疫球蛋白宣講第二節(jié) 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)一 、Ig的基本結(jié)構(gòu)2免疫球蛋白宣講第二節(jié) 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)一 、Ig的基本結(jié)構(gòu)2免疫球蛋白宣（一）、重鏈和輕鏈 Ig的兩條長鏈稱為重鏈（Heavy chain, H鏈）, 含 450-550aa，分子量為50-75kD。 重鏈可分為、鏈 Ig的兩條短鏈稱為輕鏈（Light chain, L鏈） 含214aa，分子量為25kD?？煞譃楹托?。 IgM IgG IgA IgD IgE 3免疫球蛋白宣講（一）、重鏈和輕鏈 IgM IgG IgA （二）可變區(qū)和恒定區(qū) .可變區(qū)：重鏈和輕鏈靠近N端的約110個(gè)氨基酸的序列變化很大，稱為可變區(qū)（vari

2、able region,V區(qū)）； VH和VL 。2.恒定區(qū)：靠近C端的其余氨基酸序列相對(duì)穩(wěn)定，稱為恒定區(qū)(constant region, C區(qū))；CH（CH1、CH2、CH3和CH4 ）和CL.4免疫球蛋白宣講（二）可變區(qū)和恒定區(qū) 4免疫球蛋白宣講高變區(qū)（hypervariable region，HVR）： 氨基酸組成和排列順序特別易變化 VH或VL各3個(gè)高變區(qū)：HVR1、HVR2和HVR3骨架區(qū)（framework region,FR） 高變區(qū)之外的區(qū)域。 VH和VL各有四個(gè)骨架區(qū)， FR1、FR2、FR3和FR4表示。5免疫球蛋白宣講高變區(qū)（hypervariable region，HV

3、R）：互補(bǔ)性決定區(qū)（complementarity-determining region，CDR）： VH和VL的3個(gè)高變區(qū)共同組成Ig的抗原結(jié)合部位，故高變區(qū)又被稱為互補(bǔ)性決定區(qū)。6免疫球蛋白宣講互補(bǔ)性決定區(qū)（complementarity-determi（三）免疫球蛋白的功能區(qū)1定義：Ig的H鏈、L鏈每隔110個(gè)氨基酸由鏈內(nèi)二硫鍵接構(gòu)成一個(gè)能行使特定功能的球形結(jié)構(gòu)，稱為Ig的功能區(qū)。L鏈功能區(qū)：2個(gè)，（VL，CL各一個(gè)）H鏈功能區(qū)：IgG，IgA，IgD，4個(gè)（V區(qū)1個(gè)，C區(qū)3個(gè)）, IgM，IgE，5個(gè)（V區(qū)1個(gè)，C區(qū)4個(gè)）鉸鏈區(qū)：位于CH1、CH2之間。7免疫球蛋白宣講（三）免疫球蛋白

4、的功能區(qū)7免疫球蛋白宣講V區(qū)C區(qū)VL+VH區(qū)：抗原結(jié)合部位（2個(gè)）CH3區(qū)：是Ig與多種細(xì)胞Fc受體結(jié)合的部位.CL和CH 區(qū)：具有同種異型抗體的遺傳標(biāo)記。（2個(gè)）CH2區(qū)：IgG的補(bǔ)體結(jié)合點(diǎn)和通過胎盤的部位2.功能區(qū)的作用鉸鏈區(qū)：賦予彈性和伸展性.8免疫球蛋白宣講V區(qū)C區(qū)VL+VH區(qū)：CH3區(qū)：是Ig與多種細(xì)胞Fc受體結(jié)合二、Ig的其他結(jié)構(gòu)（一）連接鏈（J鏈）：富含半胱氨酸得多肽鏈 由漿細(xì)胞合成的一種糖蛋白。 IgA和IgM含有J鏈 可穩(wěn)定Ig多聚體的成份（二）分泌片 是分泌型IgA(sIgA）的一個(gè)輔助成分， 為一種糖肽，由粘膜上皮細(xì)胞合成和分泌。 介導(dǎo)IgA二聚體的轉(zhuǎn)運(yùn) 保護(hù)sIgA的鉸

5、鏈區(qū)免受蛋白酶的水解破壞 9免疫球蛋白宣講二、Ig的其他結(jié)構(gòu)9免疫球蛋白宣講 J 鏈分泌片sIgA10免疫球蛋白宣講 J 鏈分泌片sIgA10免疫球蛋白宣講11免疫球蛋白宣講11免疫球蛋白宣講三 Ig的酶解片斷1.木瓜蛋白酶 2個(gè)Fab 段：結(jié)合抗原 1個(gè)Fc段：結(jié)合細(xì)胞2.胃蛋白酶F(ab)段:雙價(jià)抗體活性pFc段：無生物學(xué)活性12免疫球蛋白宣講三 Ig的酶解片斷1.木瓜蛋白酶12免疫球蛋白宣講第三節(jié)免疫球蛋白的生物學(xué)活性 11.特異性結(jié)合抗原,清除病原微生物 ； 2.激活補(bǔ)體（IgG、IgM）；13免疫球蛋白宣講第三節(jié)免疫球蛋白的生物學(xué)活性13免疫球蛋白宣講3與多種細(xì)胞表面Fc受體結(jié)合；（

6、1）調(diào)理作用（opsonization)：IgG、IgM指抗體促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌等顆粒性抗原的作用。 （2）抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)：IgG、IgA、IgE指表達(dá)Fc受體的細(xì)胞（ NK細(xì)胞、吞噬細(xì)胞)通過與抗體Fc段結(jié)合直接殺傷被抗體包被的靶細(xì)胞。 （3）I型超敏反應(yīng)：IgE 與肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞Fc受體結(jié)合，促使其合成和釋放生物活性物質(zhì)。14免疫球蛋白宣講3與多種細(xì)胞表面Fc受體結(jié)合；14免疫球蛋白宣講四、穿過胎盤 IgG所獨(dú)有，是嬰兒獲得天然被動(dòng)免疫的主要原因，主要借助胎盤滋

7、養(yǎng)層細(xì)胞表面的FcR進(jìn)行的。五、免疫調(diào)節(jié) 15免疫球蛋白宣講四、穿過胎盤15免疫球蛋白宣講第三節(jié) 五類Ig的主要特性16免疫球蛋白宣講第三節(jié) 五類Ig的主要特性16免疫球蛋白宣講 一、IgG（一） 特性1、存在形式：單體，占血清Ig總量的3/4。2、合成時(shí)期：嬰兒出生后三個(gè)月開始合成。3、半衰期：23天，是所有抗體中半衰期最長的。（二） 生物活性1、是主要的抗感染抗體 2、是補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑參與者。3、是唯一可以穿過胎盤的抗體4、具有調(diào)理作用和介導(dǎo)ADCC效應(yīng)的功能。17免疫球蛋白宣講 一、IgG（一） 特性1、存在形式：單體，占血清IgIgG 分 子 的 四 種 亞 型IgG1IgG4IgG

8、3IgG2 四種亞類的IgG分子在血清中的濃度不同，所發(fā)揮的生物學(xué)特性亦不相同。18免疫球蛋白宣講IgG 分 子 的 四 種 亞 型IgG1IgG4IgG3二、IgM（一）特性1、存在形式：五聚體，占血清Ig總量的10%，是分子量最大抗體。 mIgM 是 BCR 2、合成時(shí)期：胎兒晚期已能合成，最早合成和初次免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體。3、半衰期：5天，（三） 生物活性1、具有強(qiáng)大的調(diào)理、激活補(bǔ)體及殺菌作用 。3、不能介導(dǎo)ADCC效應(yīng)。4、ABO血型天然抗體。19免疫球蛋白宣講二、IgM19免疫球蛋白宣講IgM J 鏈IgM 抗 體 結(jié) 構(gòu)分 泌 型 IgM膜 型 IgMsIgM Iga Igb

9、 Iga Igb20免疫球蛋白宣講IgM J 鏈IgM 抗 三、IgA（一） 特性：1、存在形式：單體（血清型）和雙體（分泌型）；其中分泌型主要分布于呼吸道、消化道及初乳等分泌液中。2、合成時(shí)期：嬰兒在出生46個(gè)月才能合成IgA。（二） 生物活性1、是機(jī)體局部粘膜防御感染的重要因素（分泌型IgA）。2、具有中和毒素作用（血清型IgA）。3、輔助嬰兒抵抗呼吸道、消化道感染（初乳中含分泌型IgA） 21免疫球蛋白宣講三、IgA（一） 特性：1、存在形式：單體（血清型）和雙四、IgD（一） 特性1、存在形式：單聚體，僅占血清Ig總量的1%。2、合成時(shí)期：較晚。 3.半衰期：3天（二） 生物活性1、成

10、熟B細(xì)胞的重要表面標(biāo)志。2、血清中IgD的功能尚不清楚。22免疫球蛋白宣講四、IgD（一） 特性1、存在形式：單聚體，僅占血清Ig五、IgE（一） 特性1、存在形式：單聚體，僅占血清Ig總量的0.002%。2、合成時(shí)期：最晚合成的抗體。（三） 生物活性1、引發(fā)型過敏反應(yīng)。2、抗寄生蟲的主要抗體。23免疫球蛋白宣講五、IgE（一） 特性1、存在形式：單聚體，僅占血清Ig第四節(jié)Ig的基因及抗體的多樣性一、Ig的基因結(jié)構(gòu) 1.Ig輕鏈基因結(jié)構(gòu)（1）Ig 型輕鏈基因：V、J、C 小鼠：350 5 1 人：100 5 1（2）Ig型輕鏈基因：V、J、C 小鼠：2 4 4 人：2 6 624免疫球蛋白宣講

11、第四節(jié)Ig的基因及抗體的多樣性一、Ig的基因結(jié)構(gòu) 24免疫2. Ig重鏈的基因結(jié)構(gòu) V、D、J、C小鼠：300-1000 20 4 8 人： 75-250 30 6 11 25免疫球蛋白宣講2. Ig重鏈的基因結(jié)構(gòu)25免疫球蛋白宣講26免疫球蛋白宣講26免疫球蛋白宣講27免疫球蛋白宣講27免疫球蛋白宣講二、Ig基因重排由于Ig基因成簇存在，編碼完整的功能性Ig多肽鏈必須通過基因重排。 28免疫球蛋白宣講二、Ig基因重排28免疫球蛋白宣講重鏈胚系基因重鏈基因重排初始RNA轉(zhuǎn)錄mRNA新合成多肽29免疫球蛋白宣講重鏈胚系基因重鏈基因重排初始RNA轉(zhuǎn)錄mRNA新合成多肽29輕鏈基因的重排、RNA處理

12、和蛋白質(zhì)表達(dá)的過程30免疫球蛋白宣講輕鏈基因的重排、RNA處理30免疫球蛋白宣講(二)抗體多樣性機(jī)制: 1.組合多樣性：Ig基因庫中眾多V、D、J、C基因家族成員極端多樣性的排列組合；2.連接多樣性：基因重排過程中可出現(xiàn)不同的連接點(diǎn)； 3.體細(xì)胞突變：已成熟的B細(xì)胞受抗原刺激后，在發(fā)育過程中重排基因所發(fā)生的突變。4. L鏈H鏈相互隨機(jī)配對(duì)。31免疫球蛋白宣講31免疫球蛋白宣講多肽鏈基因片段數(shù)V區(qū)基因重組方式重排和隨機(jī)配對(duì)后推算的多樣性數(shù)目V D JH鏈1000 12 4V-D-J48000鏈250 - 4V-J1000小鼠Ig多樣性（舉例）32免疫球蛋白宣講多肽鏈基因片段數(shù)V區(qū)基因重組方式重排

13、和隨機(jī)配對(duì)后推算的多樣性第五節(jié) 抗體的應(yīng)用免疫學(xué)檢測免疫學(xué)檢測是以特異性抗原-抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測方法。具有很高的靈敏度和能快速提供檢測結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)。33免疫球蛋白宣講第五節(jié) 抗體的應(yīng)用免疫學(xué)檢測免疫學(xué)檢測是以特異性抗原-抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性抗原抗體反應(yīng)的可見性適當(dāng)?shù)谋壤蜐舛瓤赡嫘?4免疫球蛋白宣講抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)34免疫球蛋白宣講應(yīng) 用1、利用已知抗原檢測未知抗體（1）檢測病原微生物的相應(yīng)抗體以輔助診斷疾?。?傷寒病、流行性乙型腦炎、AIDS病等。（2）檢測自身抗體診斷自身免疫?。篠LE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。2、利用已知抗體檢測未知抗原（1）鑒定病原菌：診斷疾?。?）檢測腫瘤相關(guān)抗原：檢

14、測甲胎蛋白以診斷肝癌（3）檢測血型抗原、HLA抗原：鑒定血型，親子鑒定（4）檢測藥物半抗原;35免疫球蛋白宣講應(yīng) 用1、利用已知抗原檢測未知抗體（1）檢測病原微生物抗原或抗體的檢測方法 凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)36免疫球蛋白宣講抗原或抗體的檢測方法 凝集反應(yīng)36免疫球蛋白宣講 （一）凝集反應(yīng)（agglutination） 顆粒性抗原（紅細(xì)胞、細(xì)菌等）與抗體特異性結(jié)合，形成肉眼可見的凝集塊。1 、直接凝集(direct agglutination) 玻片凝集、試管凝集細(xì)菌的鑒定和血型的檢查一、 傳統(tǒng)免疫分析37免疫球蛋白宣講 （一）凝集反應(yīng)（agglutination） 顆2、間接凝集（in

15、direct agglutination） 可溶性抗原包被在乳膠顆?；蚣t細(xì)胞表面，與相應(yīng) 抗體混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。檢測病原體可溶性抗原，病原體感染后產(chǎn)生的抗體38免疫球蛋白宣講2、間接凝集（indirect agglutination）（二）沉淀反應(yīng)（precipitation） 可溶性抗原（免疫球蛋白、細(xì)胞裂解物、組織浸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合， 形成不溶性免疫復(fù)合物，出現(xiàn)不透明的沉淀物。多在半固體瓊脂凝膠上進(jìn)行，形成白色的沉淀。 免疫比濁法39免疫球蛋白宣講（二）沉淀反應(yīng)（precipitation） 1、單向免疫擴(kuò)散（single immunodiffusion）：可溶性抗原在含相應(yīng)抗體的瓊

16、脂凝膠中進(jìn)行的擴(kuò)散，為一種半定量試驗(yàn)。 環(huán)的直徑與抗原含量成正相關(guān)40免疫球蛋白宣講1、單向免疫擴(kuò)散（single immunodiffusio2、雙向免疫擴(kuò)散（doule immunodiffusion）：抗原與抗體在瓊脂板中相互擴(kuò)散而形成一定類型的沉淀線的方法。常用于抗原或抗體的定性檢測、組成和兩種抗原相關(guān)性分析。一致部分一致不一致，有多種成分41免疫球蛋白宣講2、雙向免疫擴(kuò)散（doule immunodiffusion3、免疫電泳（immunoelectrophoresis）常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失。 1）簡易免疫電泳先將抗原樣品在瓊脂中進(jìn)行電泳分離，可將蛋白質(zhì)

17、抗原分子分成不同的區(qū)帶，然后將抗血清加入瓊脂板橫槽中，使二者進(jìn)行雙向擴(kuò)散，當(dāng)比例合適時(shí)即形成特異性的沉淀線， 42免疫球蛋白宣講3、免疫電泳（immunoelectrophoresis）常2）對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種技術(shù)43免疫球蛋白宣講2）對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectro3）火箭免疫電泳(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在電場下通過含有一定量抗體的瓊脂凝膠，并于抗體發(fā)生反應(yīng)，形成沉淀帶?？啥糠治?。44免疫球蛋白宣講3）火箭免疫電泳(roc

18、ket immunoelectro 用標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)借以提高免疫學(xué)診斷的敏感性熒光素 ：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、 羅丹明（紅色熒光）放射性同位素： 125I、131I酶：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶免疫熒光檢測法（IFA）放射免疫檢測法（RIA）酶免疫檢測法（EIA） 二、現(xiàn)代免疫分析-免疫標(biāo)記技術(shù)45免疫球蛋白宣講 用標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)借以提1抗體制備。多克隆抗體單克隆抗體，2標(biāo)記物與標(biāo)記方法。 放射性同位素、酶、熒光分子、化學(xué)和生物發(fā)光系統(tǒng)。免疫分析基本環(huán)節(jié) 46免疫球蛋白宣講1抗體制備。免疫分析基本環(huán)節(jié) 46免疫球蛋白宣講3分析方式設(shè)

19、計(jì)：非競爭方式、競爭方式；直接法、間接法；標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗體；均相、非均相4.信號(hào)檢測。與相應(yīng)的標(biāo)記物對(duì)應(yīng)。主要為分光光度法、熒光光度法、化學(xué)發(fā)光檢測法。47免疫球蛋白宣講3分析方式設(shè)計(jì)：非競爭方式、競爭方式；直接法、間接法； （一）、放射免疫分析 (Radioimmunoassay RIA) 利用放射性同位素的測量方法與免疫反應(yīng)基本原理相結(jié)合的一種同位素分析技術(shù)。特點(diǎn)： 靈敏度高、特異性強(qiáng)、樣品用量少、標(biāo)記物容易制備以及放射性強(qiáng)度容易檢測48免疫球蛋白宣講 （一）、放射免疫分析 (Radioi1.放射免疫分析必需的基本試劑：抗體：作為標(biāo)記藥物和非標(biāo)記藥物競爭結(jié)合的蛋白。標(biāo)記藥物：提供可檢測的

20、信號(hào)(響應(yīng)值)（放射性）。非標(biāo)記藥物：在標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)是藥物標(biāo)準(zhǔn)品，在樣品中則為被測藥物分離劑分離結(jié)合與游離部分49免疫球蛋白宣講1.放射免疫分析必需的基本試劑：49免疫球蛋白宣講結(jié)合相游離相2.基本原理：RIA是標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原對(duì)有限量抗體的競爭性結(jié)合。50免疫球蛋白宣講結(jié)合相游離相2.基本原理：RIA是標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原對(duì)有限標(biāo)記藥物(S*)+抗體(Ab) 標(biāo)記藥物-抗體復(fù)合物(S*-Ab) F* P-B* B* F*、B*分別是游離的和與抗體結(jié)合的標(biāo)記藥物濃度，它們可通過產(chǎn)生的信號(hào)(如放射性、光吸收、熒光發(fā)射)強(qiáng)度反映出來(用儀器檢測)。51免疫球蛋白宣講51免疫球蛋白宣講 非標(biāo)記

21、藥物（S） F +標(biāo)記藥物(S*)+抗體(Ab) 標(biāo)記藥物-抗體復(fù)合物(S*-Ab) F* P-B-B* B* 非標(biāo)記藥物-抗體復(fù)合物(S-Ab) B隨著S的加入，它對(duì)S*同Ab的結(jié)合則起競爭抑制作用，表現(xiàn)為使B*減少、使F*增加，并且只要S加入一定量，便有對(duì)應(yīng)的F*和B*信號(hào)強(qiáng)度值，因此可建立S量(濃度)與響應(yīng)值(F*和B*的信號(hào)強(qiáng)度)之間的函數(shù)關(guān)系，作成劑量反應(yīng)曲線。52免疫球蛋白宣講 非標(biāo)記藥物（S）52免疫球蛋白宣免疫分析中各種競爭結(jié)合抑制曲線示意圖53免疫球蛋白宣講免疫分析中各種競爭結(jié)合抑制曲線示意圖53免疫球蛋白宣講54免疫球蛋白宣講54免疫球蛋白宣講3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與樣品測定步

22、驟取標(biāo)準(zhǔn)抗原，用無放射活性的空白血清或血漿稀釋成58個(gè)系列濃度。加入定量標(biāo)記抗原，其總放射性(T)應(yīng)能滿足準(zhǔn)確測量的需要。加入定量的已稀釋好的特異抗體，其抗體的量應(yīng)滿足靈敏度的要求。將標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)記抗原、特異抗體與緩沖液混勻后，在適當(dāng)條件下溫育，待反應(yīng)平衡后測定總計(jì)數(shù)率(T)。55免疫球蛋白宣講3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與樣品測定步驟取標(biāo)準(zhǔn)抗原，用無放射活性的空加入分離劑，使結(jié)合部分(B)與游離部分(F)分離。測定各管結(jié)合部分或游離部分的計(jì)數(shù)率。標(biāo)準(zhǔn)曲線通常以標(biāo)準(zhǔn)抗原(待測藥物標(biāo)準(zhǔn)品)的濃度為橫坐標(biāo)，以結(jié)合率(B)為縱坐標(biāo)作圖。 縱坐標(biāo)B的計(jì)算：將與抗體結(jié)合的標(biāo)記藥物的放射性強(qiáng)度(B)與加入的標(biāo)記藥物

23、總放射性強(qiáng)度(T)比較，即B=(BT)100；56免疫球蛋白宣講加入分離劑，使結(jié)合部分(B)與游離部分(F)分離。56免疫球57免疫球蛋白宣講57免疫球蛋白宣講例：125IRIA(DCC沉淀法)測定血清中地高辛濃度 待測血清樣品50l樣品管中;含不同濃度地高辛標(biāo)準(zhǔn)品的血清50l標(biāo)準(zhǔn)曲線各管中;50l 空白人血清零標(biāo)準(zhǔn)管.各管中依次加入保溫液100l抗體溶液100l125I標(biāo)記的地高辛(溶液)100l搖勻在室溫(1525)放置30min-計(jì)數(shù)器測定各管的總計(jì)數(shù)T(即加人的協(xié)I總放射性劑量)在電磁攪拌(或手搖)下，迅速向各管內(nèi)加人1ml工作液(全部加完控制在5min內(nèi))，搖勻離心10min(300

24、0r/min)傾去上清液-計(jì)數(shù)器測定各管中沉淀的計(jì)數(shù)F(游離協(xié)I地高辛放射性強(qiáng)度)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線各管和樣品各管的結(jié)合率。58免疫球蛋白宣講例：125IRIA(DCC沉淀法)測定血清中地高辛濃度 （二）酶免疫分析（enzyme immunoassay） 標(biāo)記物為酶，酶本身并不能直接產(chǎn)生信號(hào)，必須要有其他試劑如底物、輔酶等的參與才能完成酶反應(yīng)，從而引起吸收光譜等的變化供測定。 常用的酶為： 辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、-半乳糖苷酶。 59免疫球蛋白宣講 （二）酶免疫分析（enzyme immunoassay）5酶 底 物顯色反應(yīng) 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺四甲替聯(lián)苯

25、胺氨基水楊酸鄰聯(lián)苯甲胺2,2-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 橘紅色黃色棕色蘭色藍(lán)綠色492460449425642堿性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸鹽(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽 黃色紅色 400500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭 黃色深藍(lán)色 405420 -半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) 熒光黃色 360,450420 60免疫球蛋白宣講酶 底 物顯色反應(yīng) 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺四甲1. 均相酶免疫分析，EMIT法（enzyme multipled immunoassay techni

26、que） 基本原理：酶標(biāo)藥物與未標(biāo)記藥物互相競爭有限量的抗體(Ab)，測定小分子抗原。 酶標(biāo)抗原(AgE)同抗體(Ab)結(jié)合后，所形成的酶標(biāo)抗原一抗體結(jié)合物(AgEAb)可使酶的活性發(fā)生改變(增強(qiáng)或減弱)； 可直接通過測定酶活性的變化，求出樣品含量的方法。61免疫球蛋白宣講1. 均相酶免疫分析，EMIT法（enzyme multip62免疫球蛋白宣講62免疫球蛋白宣講2.酶聯(lián)吸附免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）屬于非均相免疫分析的代表，普遍應(yīng)用于各領(lǐng)域?；驹恚菏菍⑦^量抗體（抗原）包被于載體上，通過抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)

27、合在載體上，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)記抗體（抗原）后，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物確定待測物的存在與含量的檢測技術(shù)。63免疫球蛋白宣講2.酶聯(lián)吸附免疫分析（enzyme-linked immun1）雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢樣品，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用： 二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測定 如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等64免疫球蛋白宣講1）雙抗體夾心法64免疫球蛋白宣講65免疫球蛋白宣講65免疫球蛋白宣講獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì) 加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點(diǎn)洗滌并除去未結(jié)合的

28、封閉蛋白加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體抗原復(fù)合物 洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗體生成抗體待測抗原酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物 徹底洗滌未結(jié)合的 酶標(biāo)抗體 加底物進(jìn)行酶催化反應(yīng) 根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測定66免疫球蛋白宣講獲得待分析物的未標(biāo)定抗體將特異性抗體與固相洗滌除去未結(jié)合的加2）間接法方法：利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相上抗原結(jié)合的受檢抗體應(yīng)用： 常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定67免疫球蛋白宣講2）間接法67免疫球蛋白宣講68免疫球蛋白宣講68免疫球蛋白宣講包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體123）競爭法方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加

29、酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。 應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）69免疫球蛋白宣講包被反應(yīng)123）競爭法方法：用已知抗體包被，加入待測血清，70免疫球蛋白宣講70免疫球蛋白宣講ELISA試劑盒71免疫球蛋白宣講ELISA試劑盒71免疫球蛋白宣講72免疫球蛋白宣講72免疫球蛋白宣講（三）膠體金免疫快速檢測法1.雙抗體夾心法-大分子抗原 73免疫球蛋白宣講（三）膠體金免疫快速檢測法1.雙抗體夾心法-大分子抗原 7374免疫球蛋白宣講74免疫球蛋白宣講75免疫球蛋白宣講75免疫球蛋白宣講樣本加到S區(qū)，進(jìn)入B區(qū)和B區(qū)的金標(biāo)抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，再層析到T

30、線位置時(shí)，如果樣本中含有待測抗原，則T線不顯色或顯色很淡，C線顯色，這樣得到的是陽性結(jié)果。當(dāng)待測樣本中不含抗原時(shí)，再層析到T線位置時(shí)，則T線顯色，C線也顯色，得到陰性結(jié)果SBTCD2.競爭抑制法76免疫球蛋白宣講樣本加到S區(qū)，進(jìn)入B區(qū)和B區(qū)的金標(biāo)抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，再層析到 能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量，常用于檢測多種病毒的抗體或抗原，如抗HIV抗體的檢測。（四）免疫印跡法77免疫球蛋白宣講 第五節(jié) 抗體生成技術(shù)整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù) 基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體組合抗體庫技術(shù) 噬菌體抗體庫技術(shù) Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達(dá)

31、技術(shù)78免疫球蛋白宣講第五節(jié) 抗體生成技術(shù)整體水平抗體生成技術(shù)細(xì)胞工程抗體生成技術(shù)一、多克隆抗體（polyclonal antibody） 給動(dòng)物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物, 它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的, 稱為多克隆抗體.存在問題特異性差, 用于免疫學(xué)檢測容易出現(xiàn)交叉反應(yīng) 79免疫球蛋白宣講一、多克隆抗體（polyclonal antibody）79傳統(tǒng)抗血清抗 原免 疫所有抗體混合123412341234脾 臟淋巴結(jié)B 細(xì)胞制備過程80免疫球蛋白宣講傳統(tǒng)抗血清抗 原免 疫所有抗體混合123412341234脾 傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒有

32、反應(yīng)交叉反應(yīng)+-? 1 2 3 Ag A x y z Ag B 1 2 0 Ag A12312312381免疫球蛋白宣講 傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-? 1 二、單克隆抗體（monoclonal antibody） 通過B細(xì)胞雜交瘤技術(shù), 獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體.82免疫球蛋白宣講 二、單克隆抗體（monoclonal antibody）8可生產(chǎn)有用抗體的 淋巴細(xì)胞 若與 癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細(xì)胞株。癌細(xì)胞可培養(yǎng)生長漿細(xì)胞B cell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細(xì)胞融合兩組染色體混在

33、一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個(gè) B cell 只產(chǎn)生一種抗體83免疫球蛋白宣講可生產(chǎn)有用抗體的 淋巴細(xì)胞 若與 癌細(xì)胞融合，則形成穩(wěn)定而可 抗體-a-b-c-d-a -b -c -d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體 (抗血清) 是所有抗體的混和 脾臟產(chǎn)生各種 B 細(xì)胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫 抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細(xì)胞株由脾臟收集 B 細(xì)胞免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次Ag X制備過程84免疫球蛋白宣講 抗體-a-b-c-d-a -b -d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgXAgXELISAHATPEG Cell fusion融合瘤細(xì)胞ddabcdabcd+

34、-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌細(xì)胞B cell脾細(xì)胞分株培養(yǎng)篩選單抗傳統(tǒng)抗體 (抗血清)試驗(yàn)專一性對(duì)抗原的反應(yīng)無法分辨完全不同d舊有抗原d新的抗原85免疫球蛋白宣講-d細(xì)胞融合-a-b-c-dAgAgELISAHATPEG 免疫球蛋白宣講培訓(xùn)課件 McAb 在治療中存在的問題（障礙）：1.McAb均是鼠源性抗體，應(yīng)用于人體內(nèi)可產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA），加速了排斥反應(yīng)。2.完整的抗體分子的相對(duì)分子質(zhì)量過大，難以穿透實(shí)體組織，達(dá)不到有效的治療濃度。解決問題的方法或途徑基因工程技術(shù) 87免疫球蛋白宣講 McAb 在治療中存在的問題（障礙）：87免疫球蛋白宣講三、基因工程抗體(Geneti

35、c engineering antibody) 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平對(duì)免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。 主要包括 嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體等。88免疫球蛋白宣講三、基因工程抗體(Genetic engineering 1 人一鼠嵌合抗體(Chimeric Antibodies) 人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。89免疫球蛋白宣講1 人一鼠嵌合抗體(Chimeric Antibodies)2人源化抗體(humanized antibody 把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。 90免疫球蛋白宣講2人源化抗體(humanized antibody 小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識(shí)別單位等幾種。 3 小分子抗體 (1)Fab 由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 91免疫球蛋白宣講 小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識(shí)別 Fv、ScFv的大