腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法優(yōu)質(zhì)課件

1、腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法提綱化療藥物的發(fā)展腫瘤的藥物治療抗腫瘤新藥的發(fā)現(xiàn)和治療靶點(diǎn)抗腫瘤藥物篩選及評(píng)價(jià)提綱化療藥物的發(fā)展化療藥物的發(fā)展近代腫瘤化療學(xué)始于20世紀(jì)40年代。50年代通過動(dòng)物篩選化療藥物發(fā)現(xiàn)了5FU、MTX、CTX等，化療學(xué)有了發(fā)展。60年代認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及化療藥藥代動(dòng)力學(xué)的重要性。大部分目前所用的抗癌藥已發(fā)現(xiàn)，有急淋、HD、睪丸癌等可化療治愈?；熕幬锏陌l(fā)展近代腫瘤化療學(xué)始于20世紀(jì)40年代。70年代形成腫瘤內(nèi)科學(xué)，更多腫瘤有了比較成熟的化療方案。80年代研究以生物反應(yīng)修飾劑等藥物來(lái)提高化療療效，探索抗藥性產(chǎn)生的原因，5%腫瘤患者

2、可治愈。90年代新抗癌藥進(jìn)入臨床，多藥耐藥基因發(fā)現(xiàn)，生物治療，基因治療輔助治療改善等，療效進(jìn)一步提高。70年代形成腫瘤內(nèi)科學(xué)，更多腫瘤有了比較成熟的化療方案。腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法優(yōu)質(zhì)課件1、細(xì)胞毒類抗腫瘤藥2、以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物3、腫瘤新生血管生成抑制藥物4、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑5、分化誘導(dǎo)劑6、基因調(diào)節(jié)藥物7、單克隆抗體藥物腫瘤的藥物治療1、細(xì)胞毒類抗腫瘤藥腫瘤的藥物治療a、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑b、胸苷酸合成酶抑制劑c、鉑類抗腫瘤藥物1、細(xì)胞毒類抗腫瘤藥a、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑1、細(xì)胞毒類抗腫瘤藥原理： 真核細(xì)胞DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topo )是生物體內(nèi)及其重要的細(xì)胞核內(nèi)酶，

3、參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等所有關(guān)鍵的核內(nèi)過程。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶已成為重要的抗腫瘤藥物研究新靶點(diǎn)。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑已成為高選擇性抗腫瘤藥物研究的一個(gè)主攻方向。 代表藥物：喜樹堿類化合物 對(duì)S期的毒性作用，這一作用需共價(jià)TopoIDNA復(fù)合物的形成和DNA復(fù)制。TopoI抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而非DNA斷裂是引起細(xì)胞最終死亡的原因。a、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑原理： a、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑原理： 胸苷酸合成酶（TS）把單磷酸脫氧尿嘧啶（DUMP）轉(zhuǎn)換成單磷酸胸腺嘧啶（TMP），在DNA復(fù)制和細(xì)胞生長(zhǎng)過程中起著關(guān)鍵作用。是已知抗腫瘤藥物的重要有效靶點(diǎn)之一。胸苷酸合成酶抑制劑導(dǎo)致了DNA斷裂從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

4、代表藥物：培美曲塞 它是一種結(jié)構(gòu)上含有核心為吡咯嘧啶基團(tuán)的抗葉酸制劑，通過破壞細(xì)胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過程，抑制細(xì)胞復(fù)制，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。體外研究顯示，培美曲塞能夠抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶和甘氨酰核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶活性，這些酶都是合成葉酸所必需的酶。一旦培美曲塞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，它就在葉酰多谷氨合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為多谷氨酸的形式。多谷氨酸存留于細(xì)胞內(nèi)成為胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。多谷酸化在腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)時(shí)間-濃度性過程，而在正常組織內(nèi)濃度很底。多谷氨酸化代謝物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，從而也就延長(zhǎng)了藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的作用時(shí)間。b、胸苷酸合成酶抑制劑原理： b、胸苷酸

5、合成酶抑制劑原理： 鉑絡(luò)合物產(chǎn)生抗腫瘤活性的原因，是由于其與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，從而干擾DNA的復(fù)制，抑制腫瘤細(xì)胞的分裂。代表藥物：順鉑和奧沙利鉑c、鉑類抗腫瘤藥物原理： c、鉑類抗腫瘤藥物a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制劑b、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑C、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑2、以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制劑2、以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn) 原理：通過擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，與 EGFR 的胞內(nèi)段激酶結(jié)合區(qū)結(jié)合，從而抑制 EGFR 受體的磷酸化，阻斷受體下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，發(fā)揮抗腫瘤作用。 代表藥物：吉非替尼 研究表明吉非替尼的作用通過上調(diào) P27KIP1和 P

6、21CIP/WAF1 的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞 G1 期阻滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 b、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑 原理：通過擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，與 EGFR 的胞內(nèi)段激酶腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法優(yōu)質(zhì)課件原理： 法尼基轉(zhuǎn)移酶是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與Ras蛋白異戊二烯化修飾密切相關(guān)的一種必需酶。抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶活性，阻止Ras蛋白的活化，可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖 代表藥物：替匹法尼c、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑原理：c、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑原理： 原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是依賴于新生血管生成的，開發(fā)和研究能夠破壞或抑制血管生成、有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物（稱為TA 抑制劑），是新型抗腫瘤藥物研究的活躍領(lǐng)域之一

7、。 代表藥物：angiostatin和endostatin AvastinEndostatin可直接與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增生； 可與肝素樣的硫酸蛋白結(jié)合，抑制血管生成； 可抑制VEGF等血管生長(zhǎng)因子，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖 與腫瘤的生長(zhǎng)； 可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1,促使血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速。3、腫瘤新生血管生成抑制藥物原理：3、腫瘤新生血管生成抑制藥物腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法優(yōu)質(zhì)課件腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法優(yōu)質(zhì)課件原理： 根據(jù)腫瘤耐藥的特點(diǎn)可分為原藥耐藥(PDR)和多藥耐藥(MDR)兩大類。前者只對(duì)誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生耐藥性而對(duì)其它藥物不產(chǎn)生交叉耐藥

8、性，如抗代謝藥甲氨蝶呤(MTX)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)等；后者則是指腫瘤細(xì)胞一旦對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)對(duì)其它結(jié)構(gòu)上無(wú)關(guān)、作用機(jī)制各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，這是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象。許多天然來(lái)源的抗腫瘤藥物如秋水仙堿、紫杉醇等及蒽環(huán)類抗癌抗生素如阿霉素、柔紅霉素都極易發(fā)生MDR。 腫瘤耐藥產(chǎn)生的可能原因是藥物代謝障礙、DNA修復(fù)機(jī)制障礙、DNA多聚酶活性改變等。另外，耐藥是凋亡抑制的表現(xiàn)。一些與凋亡抑制相關(guān)的癌基因(如bcl-2,bcr/abl,NF/KB等)的表達(dá)產(chǎn)物可阻斷或阻礙多種因素(如化療藥物、輻射、激素等)誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生耐藥性。 研究表明MDR的產(chǎn)生是由于細(xì)胞

9、內(nèi)藥物積聚發(fā)生障礙，此后研究證實(shí)細(xì)胞內(nèi)藥物積聚降低的同時(shí)，有一分子量約為170 000細(xì)胞膜蛋白過度表達(dá)，稱之為P-糖蛋白(Pgp) 代表藥物：鈣拮抗藥（維拉帕米及其衍生物）、鈣調(diào)蛋白拮抗藥（包括氯丙嗪等吩噻嗪類衍生物）、環(huán)孢素類（環(huán)孢素及其衍生物PSC833，SDZ280-466等）及抗雌激素類化合物（他莫昔芬）等。4、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑原理：4、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑EXTRACELLULARINTRACELLULARATPPGP170ATPDrugDrugPlasmaMembraneEXTRACELLULARINTRACELLULARATP 環(huán)胞菌素A(CsA)是一種從真菌屬中提取的天然藥物，具有選

10、擇性的免疫抑制功能，廣泛用于器官移植后的抗排斥反應(yīng)及治療免疫性疾病。它能競(jìng)爭(zhēng)性的和Pgp結(jié)合，阻斷Pgp泵出藥物的功能，提高胞內(nèi)藥物濃度，從而對(duì)抗MDR，通過進(jìn)一步研究表明，CsA的作用機(jī)制并非單一，除了通過結(jié)合Pgp而調(diào)節(jié)藥物濃度外，還可通過與細(xì)胞內(nèi)，靶結(jié)構(gòu)之間的相互作用而增加化學(xué)敏感因子自身的細(xì)胞毒性。CsA在MDR中可調(diào)節(jié)藥物的運(yùn)輸，使抗癌藥在細(xì)胞內(nèi)積累增加，外排減少，從而增加抗腫瘤藥物的敏感性。 原理： 通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到腫瘤縮小、消退的目的已成為當(dāng)今腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。促進(jìn)惡性細(xì)胞向成熟分化的抗癌藥物稱分化誘導(dǎo)劑。代表藥物：維A酸類化合物 咪唑衍生物利阿唑5、分化誘導(dǎo)劑原理：5

11、、分化誘導(dǎo)劑 維A酸類化合物維甲酸類化合物(Retinoic acids)在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生命活動(dòng)中起重要作用。其在體內(nèi)的生理活性代謝產(chǎn)物包括全反式維甲酸(ATRA)、13-順維甲酸(13-cis-RA)和9-順維甲酸(9-cis-RA)，它們可通過核維甲酸受體(RAR)結(jié)合于DNA應(yīng)答元件，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。 維A酸類化合物維甲酸類化合物(RetinoiRight now we lump patients together and treat them with the same drugs and then deal with their variable response

12、 to treatment. Were essentially treating different diseases with the same medicine.”Richard Klausner, 1997 腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法優(yōu)質(zhì)課件a、反義藥物b、Decoy核酸C、RNA干擾6、基因治療a、反義藥物6、基因治療a、反義藥物 反義藥物又稱反義寡核苷酸藥物（AODNs） ，是指人工合成長(zhǎng)度為1030個(gè)堿 基的DNA分子及其類似物。根據(jù)核苷酸雜交原理，反義藥物能與特定的 基因雜交，在基因水平上干擾致病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生過程。 AODNs 可以與其靶RNA鏈互補(bǔ)結(jié)合，形成RNA-DN

13、A雜交雙鏈。形成的雜交雙鏈可以被RNA酶H識(shí)別并消化RNA鏈，由此釋放出的 AODN可以繼續(xù)與靶RNA鏈結(jié)合，最終導(dǎo)致編碼基因沉默。由此可推RNA酶H過多表達(dá)可增強(qiáng)各種AODNs效應(yīng)，反之RNA酶H受抑則降低其作用。有些AODNs 并不能激活RNA酶H，相反與翻譯元件競(jìng)爭(zhēng)空間因此可抑制RNA翻譯。另外，AODNs 如果和mRNA結(jié)合可作用于內(nèi)含子外顯子接合處以中斷其拼接過程。AODNs還可以占領(lǐng)校正RNA細(xì)胞內(nèi)定位的蛋白R(shí)NA作用序列，從而擾亂RNA運(yùn)輸， 藥物：Vitravenea、反義藥物a、反義藥物a、反義藥物5-ACGCT-33-TGCGA-5mRNARNAse HAntisense

14、DNA5-ACGCT-33-TGCGA-5mRNARNAs Decoy核酸是與靶轉(zhuǎn)錄因子具有高親和性的雙鏈寡聚核酸 ,通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控區(qū)域的結(jié)合 ,調(diào)控轉(zhuǎn)錄來(lái)改變下游基因的異常表達(dá) ,從而抑制腫瘤惡性增殖 . 體外篩選結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子AP2的decoy核酸藥物 ,結(jié)果K102對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的抑制作用 ,在異植人腫瘤細(xì)胞NCIH460的裸鼠模型中 ,靜脈注射高中低三劑量組的decoy核酸K102 ,抑瘤率分別達(dá) 71.8%、64.4 %及 57.3%.通過凝膠阻抑試驗(yàn) ,驗(yàn)證了K102與轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生特異性結(jié)合 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果為decoy核酸轉(zhuǎn)錄調(diào)控藥物的研究提供了依據(jù)。b、Deco

15、y核酸 Decoy核酸是與靶轉(zhuǎn)錄因子具有高親和性的雙鏈寡聚核酸Design oligos which can specifically bind to the transcription factor JUN/ATF and block downstrean multiple oncogenes expressionDesign oligos which can specif RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機(jī)制. RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表

16、達(dá)的監(jiān)控機(jī)制。由于RNA干擾是針對(duì)轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默，相對(duì)于傳統(tǒng)基因治療對(duì)基因水平上的敲除，整個(gè)流程設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開辟了新的途徑。其總體思路是通過加強(qiáng)關(guān)鍵基因的RNAi機(jī)制，控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進(jìn)程或外源致病核酸的復(fù)制及表達(dá)。c、RNA干擾 RNA干擾(RNAinterference，RNA 單克隆抗體(單抗)藥物就是通過淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)或基因工程技術(shù)制備的抗體。起初用于診斷劑或檢測(cè)劑，后來(lái)用于治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病。治療腫瘤的優(yōu)越性： （1）單抗藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用 （2）單抗藥物具有更高的療效 （3）單抗藥物對(duì)腫瘤相關(guān)

17、靶點(diǎn)的特異性作用 其研究重點(diǎn)主要集中在將抗體與化學(xué)藥物、酶、放射性核素、毒素和生物誘導(dǎo)劑等耦聯(lián)后直接殺傷腫瘤或者利用抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等方面。目前，國(guó)際上與腫瘤治療相關(guān)的抗體研究主要集中在將抗體與耦聯(lián)物作用后直接殺傷腫瘤細(xì)胞，利用抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等方面。7、單克隆抗體藥物 單克隆抗體(單抗)藥物就是通過淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)或腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法優(yōu)質(zhì)課件 代表藥物：曲妥珠單抗（trastuzumab， Herceptin ） Trastuzumab為靶向結(jié)合HER2的人IgG1類單抗，HER2為酪氨酸激酶受體，在約20%25%的進(jìn)展期乳腺癌患

18、者過表達(dá)。HER2分子具有以下的特點(diǎn)，因此成為乳腺癌治療的靶分子： HER2的表達(dá)水平與乳腺癌的發(fā)病機(jī)理及預(yù)后相關(guān)； 腫瘤的HER2表達(dá)水平及基因拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于正常組織，有效的減輕了HER2靶向治療藥物的毒性； HER2表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞比例很高，而且在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，因此在患者體內(nèi)可以靶向大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞； HER2在原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移灶均有表達(dá)，因此HER2靶向治療對(duì)原發(fā)及轉(zhuǎn)移病灶均有效。 代表藥物：曲妥珠單抗（trastuzumab， Herc曲妥珠單抗（trastuzumab）的作用機(jī)制：抑制受體信號(hào)傳導(dǎo)。HER2可以活化多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括PI3K、MAPK等。Trastuzumab

19、減少了這些信號(hào)通路的傳導(dǎo)，將細(xì)胞阻滯于調(diào)定點(diǎn)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。受體信號(hào)傳導(dǎo)的降低是由于trastuzumab介導(dǎo)的HER2受體內(nèi)化及降解。通過調(diào)節(jié)p27kipl阻滯細(xì)胞于G1調(diào)定點(diǎn)。Trastuzumab處理的細(xì)胞被阻滯于G1調(diào)定點(diǎn)，細(xì)胞增殖減少。細(xì)胞阻滯于G1調(diào)定點(diǎn)與細(xì)胞周期依賴的激酶抑制蛋白p27kipl相關(guān)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)研究表明trastuzumab可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，凋亡的發(fā)生與Ki67的表達(dá)無(wú)關(guān)。抑制血管形成。高表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞新生血管及VEGF的表達(dá)顯著增加。體內(nèi)研究結(jié)果顯示trastuzumab處理后，乳腺癌腫瘤體積減小，微血管密度降低；體外研究表明trastuzu

20、mab處理后，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力下降。 抑制DNA修復(fù)。體外研究顯示可與許多化療藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。Trastuzumab或聯(lián)合化療藥物促進(jìn)DNA損傷，并抑制DNA的修復(fù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。曲妥珠單抗（trastuzumab）的作用機(jī)制：腫瘤動(dòng)物模型和抗腫瘤藥物的研究方法優(yōu)質(zhì)課件抗腫瘤新藥發(fā)現(xiàn)抗腫瘤新藥發(fā)現(xiàn)Mathematical modelCell BiologyTarget selectionDrug design(Pre)clinical testingMathematical Cell BiologyTargeHow many drug targets are there?8,000 t

21、argets of pharmacological interest, of which nearly 5,000 could be potentially hit by traditional drug substances, nearly 2,400 by antibodies and 800 by protein pharmaceuticals. How many drug targets are therDrug Target: EnzymesDrug Target: EnzymesDrug Target: Enzymes IIDrug Target: Enzymes IIDrug T

22、arget: Enzymes IIIDrug Target: Enzymes IIIDrug Target: Enzymes IIIDrug Target: Enzymes IIIDrug Target: Receptors IDrug Target: Receptors IDrug Target: Receptors IIDrug Target: Receptors IIDrug Target: Receptors IIIDrug Target: Receptors IIIDrug Target: Receptors IIIDrug Target: Receptors IIIDrug Tar

23、get: Ion channelsDrug Target: Ion channelsDrug Target: Transport proteinsDrug Target: Transport proteinDrug Target: DNA/RNA and the ribosomeDrug Target: DNA/RNA and the rDrug Target: Targets of monoclonal antibodiesDrug Target: Targets of monoclDrug Target: Various physicochemical mechanismsDrug Tar

24、get: Various physicoch抗腫瘤藥物的篩選和評(píng)價(jià)抗腫瘤藥的臨床前藥理研究包括藥效學(xué)和毒性研究?jī)刹糠挚鼓[瘤藥物藥效學(xué)需研究?jī)?nèi)容：體外抗腫瘤試驗(yàn)體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)評(píng)價(jià)藥物的抗癌活性時(shí)，以體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為主，同時(shí)參考體外試驗(yàn)結(jié)果以做出正確的結(jié)論。 抗腫瘤藥物的篩選和評(píng)價(jià)抗腫瘤藥的臨床前藥理研究包括藥效學(xué)和毒體外抗腫瘤活性試驗(yàn) 目的：對(duì)候選化合物進(jìn)行初步篩選； 了解候選化合物的抗瘤譜；為隨后進(jìn)行的體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)提供參考，如劑量范圍、腫瘤類別等 。 體外抗腫瘤活性試驗(yàn) 目的：體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法體外試驗(yàn)常用方法有：染料排斥法四氮唑鹽還原法 阿拉馬藍(lán)法磺酰羅丹明染色法 集落形成法生長(zhǎng)曲線

25、測(cè)定法。藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間一般為48-72 小時(shí)，貼壁細(xì)胞需先貼壁24 小時(shí)后再給藥。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥，陰性對(duì)照為溶媒對(duì)照 體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法體外試驗(yàn)常用方法有：體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法染料排斥法（dye exclusion assay）試驗(yàn)原理：活細(xì)胞有排斥某些染料如伊紅、臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑等的能力，而死細(xì)胞由于膜完整性的破壞，可被著色。因此培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中加入這些染料，一定時(shí)間后，對(duì)著色和未著色的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，即可算出被殺死的細(xì)胞比例。方法要點(diǎn)：向一定容積的待檢細(xì)胞懸液加入定量的某種染液，最常用的是0.4%臺(tái)盼藍(lán)液，混勻，室溫染色5-15m

26、in，將已染色的細(xì)胞懸液滴加至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，直接在光鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。觀測(cè)指標(biāo)：按（未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）X100%計(jì)算活細(xì)胞率，對(duì)照組活細(xì)胞率應(yīng)在90%以上。根據(jù)活細(xì)胞率計(jì)算受試樣品的半數(shù)致死劑量（IC50）作為藥物抗腫瘤活性的指標(biāo)。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法染料排斥法（dye exclusi體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法阿拉馬藍(lán)法（alamar blue assay）試驗(yàn)原理：非熒光性藍(lán)色底物阿拉馬藍(lán)可被活細(xì)胞中的線粒體內(nèi)的NADPH相關(guān)的脫氫酶類還原為強(qiáng)熒光性粉紅色底物，采用微培養(yǎng)板自動(dòng)讀數(shù)儀在激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為530nm和590nm處讀取熒光強(qiáng)度值，與活細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系

27、。方法要點(diǎn)：細(xì)胞經(jīng)受試樣品處理后，加入10-20ul阿拉馬藍(lán)染液，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間，用微培養(yǎng)板自動(dòng)讀數(shù)儀在激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為530nm和590nm處讀取熒光強(qiáng)度值。觀測(cè)指標(biāo)：根據(jù)熒光強(qiáng)度可以計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，適當(dāng)時(shí)可進(jìn)一步計(jì)算IC50值。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法阿拉馬藍(lán)法（alamar blue體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法集落形成法（clonogenic assay）試驗(yàn)原理：克隆原細(xì)胞具有持續(xù)增殖能力，當(dāng)單個(gè)細(xì)胞分裂6代或6代以上時(shí)，其后代所組成的群體(集落)便含50個(gè)以上細(xì)胞。通過集落計(jì)數(shù)可對(duì)克隆原細(xì)胞作定量分析。它反映了單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力，故能較靈敏地測(cè)定抗癌藥的活性，日前被認(rèn)為是一

28、種較理想的檢測(cè)方法。方法要點(diǎn)：將濃度為500個(gè)細(xì)胞/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液2ml種至35ml的培養(yǎng)皿，并加受試樣品適量，培養(yǎng)7d或更長(zhǎng)時(shí)間，姬姆薩染色，解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)含50細(xì)胞以上的集落。觀測(cè)指標(biāo)：根據(jù)集落數(shù)計(jì)算集落形成率，對(duì)照組集落形成率不應(yīng)低于40%，再計(jì)算用藥組的集落形成抑制率，根據(jù)情況可進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算受試樣品的IC50值。 集落形成率=集落數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)X100% 集落形成抑制率=（1-用藥組集落形成率）/對(duì)照組集落形成率X100%體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法集落形成法（clonogenic 體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法生長(zhǎng)曲線測(cè)定法（growth-curve determ

29、ination）試驗(yàn)原理：在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈指數(shù)生長(zhǎng)，如取細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間作圖可得一條直線，故稱此時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨著細(xì)胞密度不斷增高，由于代謝產(chǎn)物的積聚及營(yíng)養(yǎng)物的消耗，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢以致停止，此時(shí)稱高坪期或穩(wěn)定期。因此藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可通過生長(zhǎng)曲線反映出來(lái) 。方法要點(diǎn)： 將濃度為10000個(gè)細(xì)胞/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液按每瓶5ml種至25ml的培養(yǎng)瓶，或按每孔100微升種至96孔板，并加受試樣品適量，培養(yǎng)后分別于即刻和1、2、3、4、5、6、7d進(jìn)行檢測(cè)。前者可采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，后者可采用MTT法或SRB法讀取OD值，并據(jù)此進(jìn)行作圖與計(jì)算。 觀測(cè)指標(biāo) 1

30、、倍增時(shí)間(TD),將實(shí)際生在曲線進(jìn)行直線回歸求出0和t時(shí)刻的理論細(xì)胞數(shù)N0和N t，據(jù)此計(jì)算：TD=0.301t/（log N tlog N0）；2 增殖細(xì)胞殺傷率（%）=( N0N0)/ N0100%；3 細(xì)胞生長(zhǎng)飽和密度（N s），代表高坪期每毫升細(xì)胞數(shù)的均數(shù)。 體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法生長(zhǎng)曲線測(cè)定法（growth-cu體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法磺酰羅丹明染色法（sulforhodamine B assay）試驗(yàn)原理：SRB是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水。 SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合。其在515 nm波長(zhǎng)的OD讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。MT

31、T法的一個(gè)缺點(diǎn)是OD值可隨放置時(shí)間而變，而SRB法無(wú)此現(xiàn)象。因此更適用于進(jìn)行大規(guī)模的試驗(yàn)。 方法要點(diǎn)： 用10%冷三氯乙酸與4固定已經(jīng)受試樣品處理的細(xì)胞1h，洗滌，干燥；加入4mg/ml SRB液100微升/孔 染色15min，1%冰醋酸洗滌，干燥；最后加入150微升/孔 的Tris溶液，在酶標(biāo)儀上與515nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。觀測(cè)指標(biāo) 同MTT法。另外，NCI目前采用以下指標(biāo)評(píng)價(jià)化合物的體外抗腫瘤活性。測(cè)定的OD值包括對(duì)照組、加藥組及加藥時(shí)的細(xì)胞的OD值C、T、和T0。據(jù)此計(jì)算： 生長(zhǎng)抑制率（%）=（TT0）/（CT0）100% ；細(xì)胞死亡率（%）=（TT0）/ T0 100% 。 按生長(zhǎng)抑

32、制率或細(xì)胞死亡率對(duì)樣品濃度繪出量效關(guān)系曲線圖，并求出： GI50，即生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)的樣品濃度； TGI，即生長(zhǎng)抑制率為100%時(shí)的樣品濃度： LC50，即細(xì)胞死亡率為50%時(shí)的樣品濃度。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法磺酰羅丹明染色法（sulforho體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法四氮唑鹽還原法（tetrazolinm salt reduction assay）試驗(yàn)原理：四氮唑MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide是一種能接受氫原子的染料?；罴?xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不

33、溶性的藍(lán)紫色的甲月替 (formazan)，而死的細(xì)胞則無(wú)此功能。用二甲基亞諷(DMSO)溶解甲月替后，在一定波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值，即可定量測(cè)出細(xì)胞的存活率。 方法要點(diǎn)：受試樣品處理細(xì)胞結(jié)束后，加入5mg/ml MTT液20微升/孔，繼續(xù)培養(yǎng)四小時(shí)。再加三聯(lián)液并培養(yǎng)過夜。在酶標(biāo)儀上于570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。 觀測(cè)指標(biāo) 直接指標(biāo)為96孔板上各被測(cè)孔的OD值；然后按公式（對(duì)照組OD值-治療組OD值）/對(duì)照組OD值100%計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；劇情況可進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算50%生長(zhǎng)抑制濃度IC50值。 體外抗腫瘤活性試驗(yàn)常用方法四氮唑鹽還原法（tetrazoli體外抗腫瘤活性試

34、驗(yàn)體外篩選方法的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單用藥量少取材可直接用于人體腫瘤得出結(jié)果快速體外抗腫瘤活性試驗(yàn)體外篩選方法的優(yōu)點(diǎn)：Case: Activity of 20 compounds on the growth of three cancer cell linesProvider: C Biotech CompanyCase: Activity of 20 compoundsHuman NCI-H460 lung cancer cell without treatmentHuman NCI-H460 lung cancer cell With Compound A treatmentHuman NCI-H

35、460 lung cancer Hum體外抗腫瘤活性試驗(yàn) 體外篩選方法的缺陷：1、細(xì)胞毒性易顯陽(yáng)性，有毒物質(zhì)也常常顯陽(yáng)性，故假陽(yáng)性率高2、非直接對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的藥物顯示假陰性3、體外細(xì)胞并不能完全代表體內(nèi)腫瘤的惡性細(xì)胞體外抗腫瘤活性試驗(yàn) 體外篩選方法的缺陷：體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn) 1、自發(fā)性腫瘤2、誘發(fā)的腫瘤3、移植性腫瘤 （a）皮下腫瘤模型 （b）腹水瘤模型 （c）原位接種模型 體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn) 1、自發(fā)性腫瘤65第一節(jié) 自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型(animal model of spontaneous tumors)概念: 未經(jīng)人為處理；自然發(fā)生 自發(fā)性乳腺癌模型 自發(fā)性白血病模型65第一節(jié) 自發(fā)性

36、腫瘤動(dòng)物模型(animal model66 一、自發(fā)性乳腺癌模型 生長(zhǎng)在體表,易早期發(fā)現(xiàn),罕有自發(fā)消退,因而能準(zhǔn)確觀察其大小與生長(zhǎng)速度,便于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。66 一、自發(fā)性乳腺癌模型 生長(zhǎng)在體表,易67 現(xiàn)介紹三種自發(fā)性乳腺癌小鼠模型C3H小鼠：繁殖用雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為 85%100%。 A系小鼠： 經(jīng)產(chǎn)雌鼠乳腺腫瘤發(fā)生率為30%80%。 CBA小鼠：雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為60%65%。 67 現(xiàn)介紹三種自發(fā)性乳腺癌小鼠模型C3H小鼠68 在乳腺左右兩側(cè)及乳頭部均可發(fā)生腫瘤。每只小鼠常見1個(gè)以上腫瘤。選擇腫瘤數(shù)目和大小相近的動(dòng)物, 配對(duì)分組,給予受試藥,觀察受試藥對(duì)腫瘤發(fā)展的影響。 給藥方案

37、和給藥途徑可根據(jù)受試藥物的特點(diǎn)確定。因自發(fā)性乳腺癌發(fā)展較緩慢，故采用間歇給藥或小劑量連續(xù)給藥較為合適。 68 在乳腺左右兩側(cè)及乳頭部均可發(fā)生腫瘤。每只小鼠常見169結(jié)果判定 給藥后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄發(fā)生時(shí)間和位置。 腫瘤結(jié)節(jié)長(zhǎng)到一定程度,每周用腳規(guī)測(cè)量皮下腫瘤2次。測(cè)定腫塊的最大徑(a)和最小徑(b)。 腫瘤體積(cm3) = ab2/269結(jié)果判定 給藥后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄發(fā)生時(shí)間70 將腫瘤體積變化對(duì)時(shí)間作出生長(zhǎng)曲線,可由曲線的斜率變化判斷藥物抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用,尤其應(yīng)觀察腫瘤能否完全消退。70 將腫瘤體積變化對(duì)時(shí)間作出生長(zhǎng)曲線,可由曲線的斜率變71注意事項(xiàng)1.在同一品系內(nèi)

38、,發(fā)病率比較穩(wěn)定,而不同品系間差別甚大。 2.動(dòng)物乳腺癌發(fā)生與遺傳基因、乳癌因子(即致乳癌病毒)及激素有關(guān)。 3.飼料的變更有明顯影響,要用固定全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料。 4.配對(duì)分組。71注意事項(xiàng) 3.飼料的變更有明顯影響,要用固定全價(jià)營(yíng)72 二、AKR白血病模型 AKR小鼠為白血病高發(fā)品系，淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病率雄性76%90%，雌性為68%90%。 操作步驟 實(shí)驗(yàn)用612月齡AKR小鼠, 此時(shí)鼠的脾和淋巴結(jié)腫大, 血象異常。 經(jīng)血液檢查確診為白血病后的次日, 配對(duì)分組并開始給予受試藥, 觀察結(jié)果。 72 二、AKR白血病模型 AKR小鼠為白血病高發(fā)品系73 觀察指標(biāo)：末梢血象,白細(xì)胞數(shù),淋巴結(jié)和脾大小

39、,動(dòng)物生存時(shí)間。有效者生存期比對(duì)照組延長(zhǎng), 并根據(jù)血象評(píng)價(jià)藥物的誘導(dǎo)緩解和維持緩解作用。 各鼠白血病的病程不一,自發(fā)瘤確診后, 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)配對(duì)分組。 結(jié)果判定 注意事項(xiàng)73 觀察指標(biāo)：末梢血象,白細(xì)胞數(shù),淋巴結(jié)和脾大小,動(dòng)物生存74自發(fā)性腫瘤的總體評(píng)價(jià) 動(dòng)物自發(fā)性腫瘤的病因往往是由動(dòng)物的遺傳特性決定的,與人癌的病因有較大距離。 各動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)速度差異較大, 很難在限定時(shí)間內(nèi)獲得大量生長(zhǎng)均勻的荷瘤動(dòng)物(tumor-bearing animals) 因此，自發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型很少在抗腫瘤藥物的常規(guī)篩選中廣泛應(yīng)用。74自發(fā)性腫瘤的總體評(píng)價(jià) 動(dòng)物自發(fā)性腫瘤的病因往往是由75第二節(jié) 誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型(an

40、imal models of induced tumor)概念: 在實(shí)驗(yàn)條件下; 使用致癌物(carcinogens); 誘發(fā)動(dòng)物發(fā)生腫瘤75第二節(jié) 誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型(animal model76 基本原理 利用外源性致癌物引起細(xì)胞遺傳特性改變，從而出現(xiàn)異常生長(zhǎng)和高增殖活性細(xì)胞,形成腫瘤。 外源性致癌物主要有化學(xué)性、物理性(如放射性物質(zhì))及生物性(如誘發(fā)動(dòng)物腫瘤的病毒),其中以化學(xué)性致癌物最為常用。76 基本原理 利用外源性致癌物引起細(xì)胞遺傳特性改77 一、誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型的基本方法 實(shí)驗(yàn)時(shí),必需注意選擇合適的致癌方法、動(dòng)物種系、致癌物及其溶劑、給予劑量、途徑以及觀察時(shí)間等。致癌物的劑量應(yīng)

41、能保證動(dòng)物的存活率較高、誘發(fā)期較短和誘發(fā)腫瘤頻率較高。77 一、誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型的基本方法 實(shí)驗(yàn)時(shí),78常用的致癌物給予方法和途徑 1.涂抹法: 涂抹在背部及耳部皮膚,主要用于誘發(fā)皮膚腫瘤。 2.經(jīng)口給藥法：通過飲水、飼料或灌喂動(dòng)物。常用于食道癌、胃癌及大腸癌等。 3.注射法：致癌物制成溶液,經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈或體腔等途徑注入體內(nèi),本法較常用。78常用的致癌物給予方法和途徑 1.涂抹法: 涂抹在背部及79常用的致癌物給予方法和途徑 4.氣管注入法：常用于誘發(fā)肺癌。 5.穿線法：將致癌物置于無(wú)菌試管內(nèi),加熱使之液化,吸附于預(yù)制的線結(jié)上,再將此線結(jié)穿入靶組織而誘發(fā)腫瘤。 6.埋藏法：包埋于皮下或

42、其他組織內(nèi)。79常用的致癌物給予方法和途徑 4.氣管注入法：常用于誘發(fā)80二、誘發(fā)性腫瘤模型的動(dòng)物和致癌物動(dòng)物：大鼠，小鼠，犬等致癌物：多環(huán)碳?xì)漕悂喯醢奉惻嫉慄S曲霉毒素 （飼料中含0.0010.015ppm黃曲霉毒素B1, 喂養(yǎng)6個(gè)月,誘發(fā)大鼠肝癌）。 ppm = parts per million80二、誘發(fā)性腫瘤模型的動(dòng)物和致癌物動(dòng)物：大鼠，小鼠，犬等818182 誘發(fā)性腫瘤模型的總體評(píng)價(jià) 約80%人癌是由環(huán)境因素引起的, 誘發(fā)性腫瘤的病因與人癌的情況近似, 且均經(jīng)過較長(zhǎng)演變過程而成瘤。動(dòng)物誘發(fā)性腫瘤是比較類似于人類腫瘤的動(dòng)物模型。 然而,人癌的發(fā)生原因十分復(fù)雜,往往并非由已知的動(dòng)物致癌

43、物所引起。另外,動(dòng)物誘發(fā)性腫瘤的組織病理類型、發(fā)生發(fā)展過程也不一定與人癌完全一致。 82 誘發(fā)性腫瘤模型的總體評(píng)價(jià) 約80%人癌是83 本模型的最大困難是誘癌時(shí)間長(zhǎng)、成癌率常達(dá)不到100%, 而且動(dòng)物之間腫瘤發(fā)生時(shí)間、發(fā)展速度的個(gè)體差異很大, 難以將未治療的動(dòng)物作為治療動(dòng)物的對(duì)照。83 本模型的最大困難是誘癌時(shí)間長(zhǎng)、成癌率常達(dá)不到10084第三節(jié)移植性腫瘤動(dòng)物模型(Animal model of transplanting tumors)84第三節(jié)85 移植性腫瘤動(dòng)物模型是指將動(dòng)物或人體腫瘤移植到同種或異種動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成的腫瘤。 該實(shí)驗(yàn)法是抗腫瘤藥物篩選最常用的體內(nèi)方法，具有重要作用。

44、目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多是首先經(jīng)該實(shí)驗(yàn)法而被發(fā)現(xiàn)的。85 移植性腫瘤動(dòng)物模型是指將動(dòng)物或人體腫瘤移植到同種或86 一般給予試驗(yàn)藥710d, 在第811d可解剖動(dòng)物獲得結(jié)果。通過一些指標(biāo)的觀察, 可以判斷試驗(yàn)藥是否有具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。這是任何體外試驗(yàn)所不能替代的, 其結(jié)果可為抗癌藥物療效提供重要依據(jù)。86 一般給予試驗(yàn)藥710d, 在第811d可解剖動(dòng)87 它比前述的自發(fā)性和誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤更易實(shí)施。 現(xiàn)有移植性腫瘤接種成功率可達(dá)100%, 可在同一時(shí)間內(nèi)獲得大量(數(shù)十至百余只動(dòng)物)、生長(zhǎng)相當(dāng)均勻的腫瘤。87 它比前述的自發(fā)性和誘發(fā)性動(dòng)物腫瘤更易實(shí)施。 現(xiàn)88 移植性腫瘤常用的動(dòng)物為小鼠

45、、大鼠和地鼠。研究藥物的抗腫瘤作用可選擇三種或三種以上小鼠、大鼠的移植性腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療；抗腫瘤藥物篩選時(shí)，每批動(dòng)物的來(lái)源應(yīng)一致；一、動(dòng)物的選擇88 移植性腫瘤常用的動(dòng)物為小鼠、大鼠和地鼠。研究藥物的89 根據(jù)瘤株的特點(diǎn)選用近交系、遠(yuǎn)交系或F1動(dòng)物；雌雄性動(dòng)物均可應(yīng)用(乳腺癌等必須用雌性動(dòng)物)。 每批實(shí)驗(yàn)只用同一性別動(dòng)物。 小鼠體重1822g，大鼠體重5070g 每組至少10只動(dòng)物，裸鼠可用510只。89 根據(jù)瘤株的特點(diǎn)選用近交系、遠(yuǎn)交系或F1動(dòng)物；雌雄性動(dòng)90二、腫瘤細(xì)胞的選擇 復(fù)制移植性腫瘤模型需要使用腫瘤細(xì)胞株(瘤株，tumor strain)或細(xì)胞系(cell line)。 細(xì)胞株(c

46、ell strain)是指通過選擇法或克隆法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群。90二、腫瘤細(xì)胞的選擇 復(fù)制移植性腫瘤模型需要使用腫瘤細(xì)91 瘤株的組織學(xué)類型和生長(zhǎng)特征趨于穩(wěn)定，并能在同系、同種或異種動(dòng)物體內(nèi)移植并連續(xù)傳代。 生長(zhǎng)特征，包括接種成活率、生長(zhǎng)速度、自動(dòng)消退率、宿主壽命與宿主反應(yīng)等。 細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。 91 瘤株的組織學(xué)類型和生長(zhǎng)特征趨于穩(wěn)定，并能在同系92 目前，動(dòng)物移植性實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤（包括實(shí)體瘤、腹水瘤和白血?。┘s500種，還有大量人的瘤株或細(xì)胞系。常用的動(dòng)物移植性腫瘤瘤株或細(xì)

47、胞系有： 92 目前，動(dòng)物移植性實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤（包括實(shí)體瘤、腹水瘤和白血93肉瘤S180腹水型或?qū)嶓w型艾氏腹水癌或?qū)嶓w型肝癌腹水型（HepA）或?qū)嶓w型（H22） 小鼠白血病L1210、P388及L615小鼠黑色素瘤（B16） 小鼠Lewis肺癌 肉瘤S37結(jié)腸癌C38、結(jié)腸癌C26 子宮頸癌（U14）大鼠Walker癌肉瘤256（W256）93肉瘤S180腹水型或?qū)嶓w型艾氏腹水癌或?qū)嶓w型肝癌腹水94 篩選抗癌藥物時(shí)，最好選用3類瘤株，即肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株。在眾多移植性腫瘤中，目前最受重視和應(yīng)用最廣的是： 小鼠Lewis肺癌 小鼠黑色素瘤B16 小鼠白血病P388 瘤株或細(xì)胞系的選擇應(yīng)盡量考慮

48、與臨床擬研究腫瘤的性質(zhì)、部位等相近，如擬研究肝癌的治療，可首選肝癌瘤株。 94 篩選抗癌藥物時(shí)，最好選用3類瘤株，即肉瘤、腹水型腫95 一種藥物不一定對(duì)各種類型移植性腫瘤都有效，如果僅選一種瘤株進(jìn)行藥物篩選就可能出現(xiàn)漏篩。 還必須指出，動(dòng)物腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)與人類腫瘤有較大差別，對(duì)動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用的藥物對(duì)人類腫瘤未必有效。95 一種藥物不一定對(duì)各種類型移植性腫瘤都有效，如果96三、接種方法 (一)一般要求 整個(gè)操作應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，可在無(wú)菌室和超凈工作臺(tái)內(nèi)操作。動(dòng)物處死后消毒皮膚，對(duì)每個(gè)實(shí)體瘤應(yīng)分別使用滅菌的外科器械切取，對(duì)腹水瘤則應(yīng)分別用滅菌的注射器抽吸。 96三、接種方法 (一)一般

49、要求97接種方法 瘤塊污染常是接種失敗的主要原因，應(yīng)特別注意!在高溫季節(jié)操作時(shí)，可在盛有瘤源的器皿周圍放置冰塊直接降溫。 常用接種部位： 實(shí)體瘤_腋窩皮下 肌肉接種_大腿肌肉 腹水型腫瘤_腹腔 97接種方法 瘤塊污染常是接種失敗的主要原因，應(yīng)特別注意98(二)接種操作1.實(shí)體瘤 (1)基本過程（以實(shí)體瘤為例）凍存的瘤株-移入宿主體內(nèi)（瘤源動(dòng)物）-7-10 d(增殖)獲得瘤塊-制備瘤塊-給動(dòng)物接種(受體動(dòng)物)98(二)接種操作(1)基本過程（以實(shí)體瘤為例）凍存的瘤株-99 (2)瘤塊接種法：選取接種后710d生長(zhǎng)狀態(tài)良好的瘤源動(dòng)物，頸椎脫臼處死，消毒操作部位皮膚。切開皮膚，剝離出瘤塊，置于平皿上

50、,平皿應(yīng)放置在冰塊上,內(nèi)置少許滅菌的PBS或其他營(yíng)養(yǎng)液,剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長(zhǎng)良好而無(wú)變性壞死、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，在無(wú)菌平皿內(nèi)剪成2mm3的小塊。 黑色素瘤則呈黑色或黑紫色 注意不用瘤中央的壞死部分99 (2)瘤塊接種法：選取接種后710d生長(zhǎng)狀態(tài)良好100瘤源動(dòng)物-頸椎脫臼處死-消毒切開皮膚-取瘤剪成 2mm3 小塊-用套管針抽吸瘤塊接種于受體動(dòng)物右前肢腋窩皮下 縮短接種操作時(shí)間,從瘤塊取材到接種完畢一般應(yīng)在30min內(nèi)；平皿內(nèi)放置少許滅菌PBS或其他營(yíng)養(yǎng)液；接種部位皮膚應(yīng)先消毒。流程圖：100瘤源動(dòng)物-頸椎脫臼處死-消毒切開皮101 (3)瘤細(xì)胞懸液接種法 如每次需要接種

51、的動(dòng)物數(shù)量較多時(shí)，可用瘤細(xì)胞懸液接種:取幾個(gè)瘤塊-除去壞死部分-混合瘤塊-剪成小塊-勻漿器單向研勻-放入無(wú)菌容器-生理鹽水稀釋成1:31:4懸液 每只動(dòng)物接種0.2ml；整個(gè)操作應(yīng)在30min內(nèi)完成；每次抽吸前應(yīng)將細(xì)胞混勻。101 (3)瘤細(xì)胞懸液接種法 取幾個(gè)瘤塊-除去壞102 (4)培養(yǎng)細(xì)胞接種法： 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞胰酶消化PBS洗滌2次計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)用生理鹽水稀釋成細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液置于冰上注射到接種部位(0.2ml,含11061107個(gè)細(xì)胞)。 102 (4)培養(yǎng)細(xì)胞接種法：103 2. 腹水型腫瘤 (1)抽取腹水：選擇接種后710 d 的健康動(dòng)物頸椎脫臼處死-腹部皮膚消毒-剪開剝?nèi)ジ共科つw-

52、抽吸腹水-放入無(wú)菌容器內(nèi)-若用幾只動(dòng)物作為瘤源動(dòng)物時(shí),應(yīng)將腹水混合.103 2. 腹水型腫瘤選擇接種后710 d 的健康動(dòng)物頸104104105 另取小量腹水,置于加有肝素的干試管內(nèi),作為觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞計(jì)數(shù)用。 將空針中剩余的腹水制備推片,瑞氏染色,鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù),其中瘤細(xì)胞數(shù)應(yīng)95%。 抽出的腹水應(yīng)為乳白色濃稠液體,若為黃色或含有大量紅細(xì)胞時(shí)應(yīng)棄去。105 另取小量腹水,置于加有肝素的干試管內(nèi),作為觀察細(xì)106 (2)細(xì)胞計(jì)數(shù)： 取肝素管內(nèi)的瘤細(xì)胞,用生理鹽水稀釋10倍;取稀釋液0.9ml,加0.2%臺(tái)盼藍(lán)生理鹽水溶液0.1ml混勻。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)瘤細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。 瘤細(xì)胞

53、死亡后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色, 而活細(xì)胞不著色。106 (2)細(xì)胞計(jì)數(shù)： 取肝素管內(nèi)的瘤細(xì)胞,用生理鹽107107108 計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù), 計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)壓邊線的細(xì)胞,計(jì)左不計(jì)右,計(jì)上不計(jì)下。計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù),然后按下列公式計(jì)算總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞總數(shù)。 四大方格細(xì)胞總數(shù)死細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)/ml懸液 稀釋倍數(shù)10000 4 108 計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù), 計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)壓邊線109 (3) 接種： 腹水用含葡萄糖的無(wú)菌Hanks液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛? 每只鼠腹腔注入0.10.2ml。整個(gè)操作應(yīng)在60min內(nèi)完成。109 (3) 接種： 腹水用含葡萄糖的無(wú)

54、菌Han110 3. 白血病株的接種 腹水型白血病如L1210及P388的接種方法同腹水型腫瘤接種法。110 3. 白血病株的接種 腹水型白血病如111 四、腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 為了使腫瘤細(xì)胞能得以長(zhǎng)期使用，防止退化或變異，保存不同代細(xì)胞的特征，對(duì)腫瘤細(xì)胞或瘤株進(jìn)行冷凍保存是很必要的。一般在液氮中凍存12年，細(xì)胞存活率可達(dá)80%90%。 111 四、腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇112 1.凍存方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增殖細(xì)胞，在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。經(jīng)胰蛋白酶消化、離心、洗滌，用含7份培養(yǎng)液、2份小牛血清、1份DMSO配成(15)106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入細(xì)胞凍存管，貼上標(biāo)簽，注明細(xì)胞來(lái)源、名稱

55、及凍存日期。 112 1.凍存方法 113 一般將凍存管: 4-30min；20-4h；70-過夜-然后入液氮。 可將凍存管懸掛液氮罐口處過夜，之后浸入液氮中。 可用2cm厚脫脂棉將凍存管嚴(yán)密包裹,2030過夜，然后除去脫脂棉直接放入液氮中。 113 一般將凍存管:114 2.凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法 從液氮罐中取出凍存管，迅速放入38 40水浴中，并不停搖動(dòng)使其在1min內(nèi)全部融化，500800r/min離心5min，棄上清，加入培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，以后按常規(guī)培養(yǎng)。 114 2.凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法 115 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是“慢凍快融”，標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速度是每分鐘12，到70

56、以下時(shí)可迅速放入液氮中。 所凍存的細(xì)胞必須是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞密度應(yīng)在106個(gè)/ml以上。115 細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是“慢凍快融”，標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速116第四節(jié)人體腫瘤異種移植性腫瘤模型 116第四節(jié)117 異種移植性腫瘤是移植性腫瘤的一種，近年很重視人體腫瘤的動(dòng)物體內(nèi)移植模型。因?yàn)檫@種模型使用人的腫瘤細(xì)胞，在組織形態(tài)和遺傳特征等方面，均與人類腫瘤相同，故用這種模型可以比較直接研究人類腫瘤的生物學(xué)特性及抗腫瘤藥物。117 異種移植性腫瘤是移植性腫瘤的一種，近年很重視118 由于異種移植的移植排斥反應(yīng)?？蓪?dǎo)致移植失敗，故選擇適合的受體動(dòng)物是移植成功的關(guān)鍵。常用的宿主動(dòng)物主要有裸小鼠和C57BL

57、/6小鼠，也可用免疫抑制劑或放射線等降低動(dòng)物的免疫功能后，再進(jìn)行移植。118 由于異種移植的移植排斥反應(yīng)常可導(dǎo)致移植失敗，故選119 一、裸小鼠作為移植宿主 裸小鼠是在SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)繁殖生長(zhǎng)的BALB/c裸小鼠，68周齡，體重2122g。 瘤源 人體腫瘤細(xì)胞的來(lái)源大致可分為兩類，一類是人的腫瘤細(xì)胞株(系)；另一類是源于人體腫瘤組織塊的癌細(xì)胞。 常用人癌裸鼠移植的細(xì)胞株(系)、接種方式和最佳生長(zhǎng)期見教材。 119 一、裸小鼠作為移植宿主 常用人癌裸鼠移植的細(xì)120 二、免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主 由于裸鼠嬌弱，飼養(yǎng)條件要求高，費(fèi)用昂貴，故用裸鼠復(fù)制人體腫瘤異種移植腫瘤模型較難普遍應(yīng)用。 使

58、用免疫功能受抑制的大鼠接種人癌細(xì)胞，可獲得人癌動(dòng)物模型。 先皮下注射阿糖胞苷，2d后用10Gy 60Co全身照射。 120 二、免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主121第五節(jié)抗腫瘤藥物體內(nèi)研究方法121第五節(jié)122 基本步驟是: 低溫保存瘤細(xì)胞速融加冷培養(yǎng)液洗除凍存液用培養(yǎng)液將腫瘤細(xì)胞調(diào)至一定濃度給特定動(dòng)物 (宿主)注射 (ip或sc)。 腫瘤細(xì)胞在宿主動(dòng)物體內(nèi)增殖后取出給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(受體動(dòng)物)進(jìn)行接種(荷瘤動(dòng)物)。不同腫瘤的宿主動(dòng)物、取用腫瘤的時(shí)間及接種方法見表4-1。122 基本步驟是: 低溫保存瘤細(xì)胞速融加冷培養(yǎng)液洗123 一、實(shí)體瘤() 分組給藥 接種次日將動(dòng)物隨機(jī)分組：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(C)：接

59、種腫瘤細(xì)胞不給受試藥，只給受試藥相應(yīng)的溶劑受試藥組(T)：設(shè)高、中、低3個(gè)劑量（給藥1次或數(shù)次，給藥途徑應(yīng)與推薦臨床用藥的途徑相同，靜脈給藥者可用腹腔注射代替）。 陽(yáng)性對(duì)照藥：對(duì)瘤株活性高的已知抗腫瘤藥 123 一、實(shí)體瘤()124 對(duì)S180 , 艾氏腹水癌實(shí)體型 可用環(huán)磷酰胺20 30 mg /(kg .d) 對(duì)L615 可用5-氟尿嘧啶25mg /(kg.d) 對(duì)其他腹水型腫瘤一般用絲裂霉素 2mg / (kg.d) 對(duì)W256 可用絲裂霉素4mg/ (kg.d)+環(huán)磷酰胺20 30mg/(kg.d )124 對(duì)S180 , 艾氏腹水癌實(shí)體型 可用125 療效評(píng)價(jià) 停藥24h后處死動(dòng)物,

60、稱體重,剝離瘤塊, 稱瘤重。受試藥物對(duì)實(shí)體瘤的療效以瘤重抑制率表示： CT 瘤重抑制率 (%)= 100% C 式中T:受試藥物組平均瘤重; C:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 (模型組,荷瘤未用藥動(dòng)物) 平均瘤重。 (瘤重抑制率%=(1T/C)100%計(jì)算）125 療效評(píng)價(jià)126 觀察瘤重抑制率時(shí)，要求實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠瘤重均值不得低于1g（大鼠瘤重均值不得低于2g），否則表示腫瘤生長(zhǎng)不良，實(shí)驗(yàn)作廢。 給藥組動(dòng)物平均體重下降（給藥前后自身比較）不得超過15%，動(dòng)物死亡數(shù)不得超過20%，否則表示受試藥有毒性反應(yīng)，應(yīng)減少劑量重新實(shí)驗(yàn)。126 觀察瘤重抑制率時(shí)，要求實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠瘤重均值不127 若中草藥瘤重抑制率大于3